Het is bekend dat de extracellulaire matrix (ECM) in de micro-omgeving van de tumor dynamisch wordt afgezet en geremodelleerd door meerdere celtypen om de progressie van de ziekte verder te vergemakkelijken 1,2,3. Deze matrixveranderingen bieden zowel mechanische als biologische signalen die het celgedrag veranderen en vaak resulteren in een voortdurende cyclus van matrixremodellering4. Onderzoek naar het dynamische, wederzijdse samenspel tussen tumorcellen en de extracellulaire matrix wordt vaak uitgevoerd met behulp van driedimensionale (3D) in vitro cultuur of microfluïdische systemen. Terwijl deze bottom-up benaderingen mechanismen van ECM-remodellering 5,6,7 hebben aangetoond, verhoogde proliferatie8, epitheliale naar mesenchymale overgang 9,10,11,12, en tumorcelmigratie en invasie 7,13,14,15,16 , hun focus lag voornamelijk op een paar celtypen (bijvoorbeeld tumorcellen of fibroblasten) binnen een homogene 3D-matrix in vergelijking met de diversiteit en heterogeniteit van interacties die aanwezig zijn in een fysiologisch weefsel. Naast in vitro systemen kan ook ex vivo tumorhistologie enig inzicht geven in deze cel-cel en cel-ECM interacties17. Immunohistochemie heeft het voordeel dat het meerdere celtypen kan analyseren met betrekking tot de ruimtelijk heterogene samenstelling en architectuur van de ECM, maar de statische eindpunten van vast weefsel vangen niet de dynamische aard van interacties tussen cellen en de micro-omgeving. Intravitale beeldvorming heeft de deur geopend om diverse en dynamische interacties te ondervragen binnen de fysiologische context van de inheemse tumormicro-omgeving.
De mogelijkheden van intravitale tumorbeeldvorming gaan snel vooruit. Verbeteringen in het ontwerp van beeldvormingsvensters en chirurgische technieken om de vensters te implanteren hebben longitudinale tumorbeeldvorming op lange termijn mogelijk gemaakt op verschillende anatomische locaties (d.w.z. primaire tumor, lymfeklieren, gemetastaseerde plaatsen 18,19,20). Bovendien wordt het vermogen van optische instrumentatie om gegevens in meerdere dimensies (d.w.z. spectraal, ruimtelijke fluorescentie-intensiteit en levensduur) en met hoge resolutie en snelheid (videosnelheid) te visualiseren en te verzamelen, algemeen toegankelijk. De verbeterde technologie biedt de mogelijkheid om snelle veranderingen in celsignalering en fenotypische dynamica binnen een fysiologische omgeving te onderzoeken. Ten slotte maken de uitbreiding van optogenetische hulpmiddelen en het brede scala aan genetische fluorescerende constructies het mogelijk om specifieke celtypen te taggen om celmigratie in de tumormicro-omgeving of cellijntracering tijdens ontwikkeling of ziekteprogressie vast te leggen21,22. Het gebruik van deze tools in combinatie met CRISPR/Cas9-technologie biedt onderzoekers de mogelijkheid om tijdig unieke diermodellen te genereren.
Hoewel al deze ontwikkelingen intravitale beeldvorming een steeds krachtigere methode maken om dynamische en fysiologische cellulaire interacties te verkennen, is er nog steeds een belangrijke behoefte om strategieën te ontwikkelen die ruimtelijke, temporele en structurele context op weefselniveau bieden aan deze biologische interacties. Momenteel compenseren veel intravitale beeldvormingsstudies het gebrek aan visuele oriëntatiepunten zoals bloedvaten door fluorescerende kleurstoffen in de vasculatuur te injecteren of muismodellen te gebruiken die exogene fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om fysieke kenmerken af te bakenen. Injecteerbare kleurstoffen en substraten zoals fluorescerende dextrans worden breed gebruikt om de vasculatuur met succes te labelen in intravitale collecties19, 23, 24. Deze aanpak is echter niet zonder beperkingen. Ten eerste vereist het extra muismanipulaties en is het nut ervan beperkt tot kortetermijnexperimenten. Voor longitudinale studies kan fluorescerend dextran problematisch zijn omdat we de accumulatie van dextran in fagocytische cellen of diffusie in het omliggende weefsel in de loop van de tijd waarnemen25. Exogene fluorescerende eiwitopname in het muismodel is gepresenteerd als een alternatief voor fluorescerende dextrans, maar vertoont zijn eigen beperkingen. De beschikbaarheid en diversiteit van exogene fluoroforen binnen muismodellen zijn nog steeds beperkt en duur om te maken. Bovendien zijn in specifieke modellen, zoals PDX-modellen, genetische manipulaties niet wenselijk of mogelijk. Het is ook aangetoond dat de aanwezigheid van fluorescerende of bioluminescente eiwitten in cellen worden herkend als vreemd in de muis, en binnen immunocompetente muismodellen vermindert dit de hoeveelheid metastase als gevolg van de reactie van het immuunsysteem van de gastheer26,27. Ten slotte bezetten exogene fluorescerende eiwitten of fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor ruimtelijke context of om latere gegevens te segmenteren vaak prime-bereiken van het lichtspectrum die anders zouden kunnen worden gebruikt om de fysiologische interacties van belang te onderzoeken.
Het gebruik van het intrinsieke signaal van de ECM of endogene fluorescentie van cellen in het weefsel vertegenwoordigt een potentieel universeel labelvrij middel om intravitale gegevens te segmenteren voor meer diepgaande cellulaire en ruimtelijke analyse. Second harmonic generation (SHG) wordt al lang gebruikt om de ECM28 te visualiseren. Met de daaropvolgende ontwikkeling van belangrijke hulpmiddelen om te helpen bij de karakterisering van vezelorganisatie 29,30,31, is het mogelijk om celgedrag te karakteriseren ten opzichte van de lokale ECM-structuur. Bovendien biedt autofluorescentie van de endogene metaboliet, NAD(P)H, een ander labelvrij hulpmiddel om de tumormicro-omgeving in vivo te compartimenteren. NAD(P)H fluoresceert helder in tumorcellen en kan worden gebruikt om de grenzen van het groeiende tumornest te onderscheiden van het omringende stroma21,32. Ten slotte is de vasculatuur een belangrijke fysiologische structuur in de tumormicro-omgeving en de plaats van belangrijke celtypespecifieke interacties 33,34,35. De excitatie van rode bloedcellen (RBC) of bloedplasma is gebruikt om de vasculatuur van de tumor te visualiseren, en met behulp van twee- of drie-foton excitatie (2P; 3P) is aangetoond dat het meten van bloedstroomsnelheden mogelijk is36. Hoewel grotere bloedvaten gemakkelijk te herkennen zijn aan hun endogene fluorescentiehandtekeningen, vereist de identificatie van subtiele, variabele en minder fluorescerende kleine bloedvaten meer expertise. Deze inherente moeilijkheden belemmeren een optimale beeldsegmentatie. Gelukkig kunnen deze bronnen van endogene fluorescentie (d.w.z. rode bloedcellen en bloedplasma) ook worden gemeten door fluorescentielevensbeeldvorming37, die profiteert van de unieke fotofysische eigenschappen van de vasculatuur en een nuttige aanvulling vormt op de groeiende intravitale toolbox.
In dit protocol wordt een workflow beschreven voor de segmentatie van vierdimensionale (4D) intravitale beeldvorming expliciet met behulp van intrinsieke signalen zoals endogene fluorescentie en SHG van acquisitie tot analyse. Dit protocol is met name relevant voor longitudinale studies door middel van een borstbeeldvormingsvenster waar exogene fluorescentie mogelijk niet praktisch of mogelijk is, zoals het geval is met PDX-modellen. De segmentatieprincipes die hier worden beschreven, zijn echter breed toepasbaar op intravitale gebruikers die tumorbiologie, weefselontwikkeling of zelfs normale weefselfysiologie onderzoeken. De gerapporteerde reeks analysebenaderingen stelt de gebruikers in staat om cellulair gedrag te differentiëren tussen regio's van uitgelijnde of willekeurige collageenvezelconfiguraties, aantallen of gedragingen van cellen te vergelijken die zich in specifieke regio's van de tumormicro-omgeving bevinden en de vasculatuur in kaart te brengen met behulp van alleen labelvrij of intrinsiek signaal. Samen creëren deze methoden een operationeel kader voor het maximaliseren van de diepte van informatie die wordt verkregen uit 4D intravitale beeldvorming van de borstklier, terwijl de behoefte aan extra exogene labels wordt geminimaliseerd.