Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

2.1K weergaven

DOI:

10.3791/63413

24 mei 2022

In dit artikel

Samenvatting

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Samenvatting

Het vermogen om complexe en dynamische fysiologische interacties tussen talrijke celtypen en de extracellulaire matrix (ECM) in een levende tumormicro-omgeving te visualiseren, is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van mechanismen die tumorprogressie reguleren. Hoewel dit kan worden bereikt door middel van de huidige intravitale beeldvormingstechnieken, blijft het een uitdaging vanwege de heterogene aard van weefsels en de behoefte aan ruimtelijke context binnen de experimentele observatie. Hiertoe hebben we een intravitale beeldvormingsworkflow ontwikkeld die collageen tweede harmonische generatie beeldvorming, endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) combineert als een middel om de tumormicro-omgeving niet-invasief te compartimenteren in basisdomeinen van het tumornest, het omringende stroma of ECM en de vasculatuur. Dit niet-invasieve protocol beschrijft het stapsgewijze proces, variërend van het verkrijgen van time-lapse-beelden van borsttumormodellen tot nabewerkingsanalyse en beeldsegmentatie. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat het metabole handtekeningen gebruikt om de dynamisch veranderende levende tumormicro-omgeving te contextualiseren zonder het gebruik van exogene fluorescerende labels, waardoor het voordelig is voor van de mens afgeleide xenograft (PDX) -modellen en toekomstig klinisch gebruik waar extrinsieke fluoroforen niet gemakkelijk toepasbaar zijn.

Inleiding

Het is bekend dat de extracellulaire matrix (ECM) in de micro-omgeving van de tumor dynamisch wordt afgezet en geremodelleerd door meerdere celtypen om de progressie van de ziekte verder te vergemakkelijken 1,2,3. Deze matrixveranderingen bieden zowel mechanische als biologische signalen die het celgedrag veranderen en vaak resulteren in een voortdurende cyclus van matrixremodellering4. Onderzoek naar het dynamische, wederzijdse samenspel tussen tumorcellen en de extracellulaire matrix wordt vaak uitgevoerd met behulp van driedimensionale (3D) in v....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Wisconsin-Madison. Het welzijn en pijnbestrijding in alle dierproeven staat voorop. Er wordt dus alles aan gedaan om ervoor te zorgen dat het dier comfortabel en goed verzorgd is bij elke stap van de procedure.

1. Generatie van het borstbeeldvormingsvenster (MIW)

  1. Om het borstbeeldvormingsvenster te construeren, fabriceert u een ring van 14 mm van roestvrij staal van chirurgische kwaliteit.
  2. Reinig het bewerkte raamkozijn met een hete oplossing van 5% reinigingsmiddel, spoel gedurende 1....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De installatie van de MIW en de experimentele basisplanning zijn de eerste stappen in dit proces. Dit specifieke MIW-ontwerp en -protocol zijn meer vatbaar voor longitudinale studies19 en is met succes gebruikt met zowel rechtopstaande als omgekeerde microscopen. In dit geval werd een omgekeerde microscoop gebruikt omdat dit heeft geresulteerd in een grotere beeldstabiliteit van de borstklier met minder ademhalingsartefacten. In figuur 1A geven we de afmetingen van de.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

4D intravitale beeldvorming is een krachtig hulpmiddel om dynamische fysiologische interacties te onderzoeken binnen de ruimtelijke en temporele context van de inheemse tumormicro-omgeving. Dit manuscript biedt een zeer basaal en aanpasbaar operationeel kader om dynamische celinteracties binnen de tumormassa, het aangrenzende stroma of in de nabijheid van het vasculaire netwerk te compartimenteren met alleen endogene signalen van de tweede harmonische generatie of NAD (P) H-autofluorescentie. Dit protocol biedt een uitge.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag NCI R01 CA216248, CA206458 en CA179556 subsidies erkennen voor de financiering van dit werk. We willen ook Dr. Kevin Eliceiri en zijn beeldvormingsgroep bedanken voor hun technische expertise in de vroege ontwikkeling van ons intravitale programma. We bedanken ook Dr. Ben Cox en andere leden van de Eliceiri Fabrication Group van het Morgridge Institute for Research voor hun essentiële technische ontwerp tijdens de vroege fasen van de MIW. Dr. Ellen Dobson assisteerde bij nuttige gesprekken over de ImageJ trainbare WEKA segmentatietool. Daarnaast willen we Dr. Melissa Skala en Dr. Alexa Barres-Heaton bedanken voor het tijdige gebruik van hun mic....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#1.5 12mm ronde dekglasWarner Instruments# 64-0712MIW-constructie
1.0 mL spuit voor SQ-injectieBD309659Spuit
20x objectiefZeiss421452-988Waterimmersie
27G naald voor SQ-injectieCovidien1188827012Naald
40x objectiefNikonMRD77410Waterimmersie
5-0 zijde gevlochten hechtdraadEthiconK870Hechtdraad voor MIW-implantatie
Kunstmatige tranen gelAkornNDC 59399-162-35Ooggel
Betadine oplossing, 5%Fisher ScientificNC1558063Antiseptisch voor chirurgie
wattenstaafje met katoenFisher Scientific23-400-101
CyanoacrylaatlijmLoctite1365882MIW-constructie
fluorescente dextranSigmaT1287-50mgintraveneuze markering van vaatstelsel
tangMckesson.comMiltex #18-782roestvrij, 4 inch, gebogen
GaAsP fotovermenigvuldigingsbuisHamamatsu 
verwarmingsdekenCARA 72 verwarmingskussentje 038056000729Temperatuur selecteerbaar
verwarmingskamerzelf gebouwd
Fluorescentielevensduur handboekBecker en Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
Omgekeerde microscoopbasisNikon
IsofluraanAkornNDC 59399-106-01Anesthesie
Liqui-NoxFisher Scientific16-000-125MIW-reiniging
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10Pijnstiller
MicroslangScientific Commodities INC. BB31695-PE/1
MultifotonscankopBruker Ultima IIMultifotonscankop en beeldvormingsplatform
NADH FLIM-filterChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826Ontharingscrème
objectiefverwarmingTokai HitSTRG-WELSX-SET
SHG/FAD-filterChroma320740ET450/40m-2P
Sparkle glasreinigerAmazon.comB00814ME24Glasreiniger voor geïmplanteerde MIW
SPC-150 fotontellingskaartBecker en Hickl
chirurgisch lichtFAJB06XV1VQVZMagneet LED gansneklicht
chirurgische microschaarExcelta366roestvrij, 3 inch
Drievoudige antibioticumzalfActavis PharmaNDC 0472-0179-34Antibioticum
TV-katheterAangepastBD 30G naald: 305106Katheter voor TV-injectie
Twee foton-filterChroma320282ET585/65m-2P
twee-fotonlaserCoherent charmeleonAfstelbare multifotonlaser
echografie-gelParkerPKR-03-02Waterimmersie-gel
Urea-kristallenSigmaU5128-5GOptioneel: FLIM IRF

Referenties

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous mat....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mammatumormodellentweede harmonische generatiefluorescentieliftijdbeeldvormingNADPH autofluorescentiecollageenvezelstumorstroomaidentificatie van de vasculatuur