Methodenartikel

Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63430

⸱

31 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Nucleus of Multidisciplinary Research in Biology (Numpex-Bio), Federal University of Rio de Janeiro, 2Laboratory of Tissue Bioengineering, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 3Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), Unigranrio, 4Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 5Dental School, Fluminense Federal Fluminense

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de grootschalige productie van van vetweefsel afgeleide stromale / stamcel (ASC) sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor homogeniteit van sferoïde grootte en vorm wordt gegarandeerd. Deze ASC-sferoïden kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor 3D-bioprintingbenaderingen.

Samenvatting

Vet-afgeleide stromale / stamcellen (ASC's) zijn een subpopulatie van cellen gevonden in de stromale vasculaire fractie van menselijk subcutaan vetweefsel erkend als een klassieke bron van mesenchymale stromale / stamcellen. Er zijn veel studies gepubliceerd met ASC's voor op steigers gebaseerde tissue engineering-benaderingen, die voornamelijk het gedrag van deze cellen onderzochten na hun zaaien op bioactieve steigers. Er zijn echter steigervrije benaderingen in opkomst om weefsels in vitro en in vivo te engineeren, voornamelijk door sferoïden te gebruiken, om de beperkingen van op steigers gebaseerde benaderingen te overwinnen.

Sferoïden zijn 3D-microtissues gevormd door het zelfassemblageproces. Ze kunnen de architectuur en micro-omgeving van inheemse weefsels beter nabootsen, voornamelijk door de vergroting van cel-tot-cel en cel-tot-extracellulaire matrixinteracties. Onlangs worden sferoïden voornamelijk onderzocht als ziektemodellen, medicijnscreeningstudies en bouwstenen voor 3D-bioprinting. Voor 3D-bioprintbenaderingen zijn echter talrijke sferoïden, homogeen in grootte en vorm, nodig om complexe weefsel- en orgaanmodellen te biofabriceren. Bovendien, wanneer sferoïden automatisch worden geproduceerd, is er weinig kans op microbiologische besmetting, waardoor de reproduceerbaarheid van de methode toeneemt.

De grootschalige productie van sferoïden wordt beschouwd als de eerste verplichte stap voor het ontwikkelen van een biofabricagelijn, die doorgaat in het 3D-bioprintproces en eindigt in de volledige rijping van het weefselconstruct in bioreactoren. Het aantal studies dat de grootschalige ASC-sferoïdenproductie onderzocht, is echter nog steeds schaars, samen met het aantal studies dat ASC-sferoïden gebruikte als bouwstenen voor 3D-bioprinting. Daarom is dit artikel bedoeld om de grootschalige productie van ASC-sferoïden te laten zien met behulp van een niet-klevende micromolded hydrogel-techniek die ASC-sferoïden verspreidt als bouwstenen voor 3D-bioprintbenaderingen.

Inleiding

Sferoïden worden beschouwd als een steigervrije benadering in tissue engineering. ASC's zijn in staat om sferoïden te vormen door het zelfassemblageproces. De 3D-microarchitectuur van de sferoïde verhoogt het regeneratieve potentieel van ASC's, inclusief de differentiatiecapaciteit in meerdere afstammingslijnen 1,2,3. Deze onderzoeksgroep heeft gewerkt met ASC-sferoïden voor kraakbeen- en botweefseltechnologie 4,5,6. Wat nog belangrijker is, sferoïden worden beschouwd als bouwstenen in de biofabricage van weefsels en organen, voornamelijk vanwege hun fusiecapaciteit.

Het gebruik van sferoïden voor weefselvorming hangt af van drie hoofdpunten: (1) de ontwikkeling van gestandaardiseerde en schaalbare robotmethoden voor hun biofabricage7, (2) de systematische fenotypering van weefselsferoïden8, (3) de ontwikkeling van methoden voor de assemblage van 3D-weefsels9. Deze sferoïden kunnen worden gevormd met verschillende celtypen en worden verkregen via verschillende methoden, waaronder hanging drop, reaggregatie, microfluïdica en micromol 8,9,10. Elk van deze methoden heeft voor- en nadelen met betrekking tot de homogeniteit van grootte en vorm van de sferoïden, het herstel van de sferoïden na formatie, het aantal geproduceerde sferoïden, procesautomatisering, arbeidsintensiteit en kosten11.

Bij de micromoldmethode worden de cellen vanwege de zwaartekracht op de bodem van de micromol gedoseerd en afgezet. De niet-klevende hydrogel laat de cellen zich niet aan de bodem hechten en cel-tot-cel interacties leiden tot de vorming van een enkele sferoïde per recessie 8,12. Deze biofabricagemethode genereert sferoïden van homogene en gecontroleerde grootte, kan worden gerobotiseerd voor grootschalige productie op een tijdsefficiënte manier met minimale inspanning en heeft goede kosteneffectiviteitskritische factoren bij het ontwerp van een biofabricage van weefselsferoïde 7,8. Deze methode kan worden toegepast om sferoïden van elke cellijn te vormen om een nieuw weefseltype voor te bereiden met voorspelbare, optimale en controleerbare kenmerken8.

Biofabricage wordt gedefinieerd als "de geautomatiseerde generatie van biologisch functionele producten met structurele organisatie ..."13. Daarom wordt de geautomatiseerde productie van sferoïden beschouwd als de eerste verplichte stap voor het ontwikkelen van een biofabricagelijn, die doorgaat in het 3D-bioprintproces en eindigt in de volledige rijping van het biogeprinte weefsel door sferoïde fusie. In deze studie, om de schaalbaarheid van ASC sferoïde biofabricage te verbeteren, gebruiken we een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor de homogeniteit van de grootte en vorm van de sferoïde wordt gewaarborgd. Dit artikel toont aan dat het mogelijk was om een groot aantal (duizenden) sferoïden te produceren die nodig zijn voor 3D-bioprintingbenaderingen om complexere weefselmodellen te biofabriceren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De ASC's die in deze studie werden gebruikt, werden eerder geïsoleerd van gezonde menselijke donoren en gecryopreserveerd zoals beschreven14 volgens de Research Ethics Committee van Clementino Fraga Filho University Hospital, Federal University of Rio de Janeiro, Brazilië (25818719.4.0000.5257). Zie materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen en apparatuur die in dit onderzoek worden gebruikt.

1. Trypsinisatie van ASC monolaag bij passage drie

  1. Open de weefselkweek 175 cm2 kolf met de monolaag van ASC's bij 80% samenvloeiing en gooi het supernatant weg.
  2. Voeg 7 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,01 M) toe en was de monolaag tweemaal. Gooi vervolgens de vloeistof weg.
  3. Voeg 5 ml 0,125% trypsine toe met 0,78 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  4. Voeg 10 ml dulbecco's modified eagle medium (DMEM LOW) met 10% foetaal runderserum (FBS) toe aan de weefselkweekkolf van 175 cm2 en meng de celsuspensie goed met een sorologische pipet van 10 ml.
  5. Oogst de celsuspensie met een serologische pipet van 10 ml en breng deze over in een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer vervolgens op 400 × g gedurende 5 minuten om de pellet asc's te verkrijgen. Resuspendeer de celpellet met DMEM LOW met 10% FBS.
  6. Voer een celtelling uit op basis van trypan-uitsluiting.
  7. Neem na het tellen in totaal 1 × 106 ASC's in een aparte centrifugebuis van 15 ml om de 81 recessies te zaaien die zijn gemicromold met niet-adherente hydrogel (in totaal 10.000 cellen / ml die hier zijn gezaaid). Om 256 recessies van micromolded niet-adherente hydrogel te zaaien, neemt u in totaal 5 × 105 ASC's in een centrifugebuis (in totaal 2.500 cellen / ml hier gezaaid).

2. Micromolded niet-adherente agarose hydrogel fabricage

  1. Bereid 50 ml steriele oplossing van 2% ultrapure agarose in 0,9% NaCl in ultrapuur water. Autoclaaf de oplossing gedurende 30 min bij 121 °C.
  2. Voeg 500 μL steriele 2% ultrazuivere agarose-oplossing toe in het midden van een siliconenmal met 81 of 256 cirkelvormige uitsparingen.
  3. Maak na 40 minuten de ultrazuivere agaroos los uit de siliconenvorm en plaats deze in een putje van een 12-well plastic plaat.
  4. Voeg 2 ml DMEM LOW toe in de put met de micromolded agarose en incubeer in een incubator bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende ten minste 12 uur voordat u de ASC's zaait.

3. Biofabricage van ASC-sferoïden met behulp van het geautomatiseerde pipetteersysteem

  1. Controleer het volgende:
    1. Controleer of laminaire stroming is ingeschakeld en of de luchtstroom van de kast goed werkt.
    2. Controleer of de apparatuur op de juiste spanning is aangesloten.
    3. Controleer of de tablet is aangesloten op de apparatuur.
    4. Controleer of de hoogte van het kastbeschermingsglas op dezelfde hoogte ligt als de sensormarkering van de apparatuur.
  2. Druk op de aan/uit-knop aan de linkerkant van de apparatuur en wacht tot de tablet en de apparatuur zijn gestart.
  3. Plaats de tipboxen, het rek voor centrifugebuizen en de plaat met de micromolded agarose hydrogel in de werkruimte van de apparatuur.
  4. Klik op de tablet met de software open eerst op Labware Editor.
  5. Stel een virtuele werktafel op en kies de posities van de pipetten, tipboxen, het rek voor de plastic buizen en de platen.
    OPMERKING: De virtuele werktafel moet de fysieke posities van de accessoires in de apparatuur weergeven.
  6. Klik op de knop Overschakelen naar produceren om de parameters (zie stap 3.10) en opdrachten op te nemen die de apparatuur tijdens het experiment zal uitvoeren. Wacht tot een werkbalk en een produceerlijst in de software zijn geopend.
  7. Om de opdrachten aan te geven, neemt u in eerste instantie het aantal monsters op dat moet worden gepipetteerd en sleept u dit naar de lijst met producten.
    OPMERKING: Het aantal monsters is het aantal plastic centrifugebuizen met de ASC-suspensie dat in het midden van de micromolds moet worden gezaaid.
  8. Nadat u het aantal monsters hebt ingevoerd, klikt u op de opdrachtknop Sample Transfer op de software om de ASC-suspensie over te brengen naar de putten van de 12-well-plaat, die de micromolden bevat, en sleept u deze naar de produce-lijst.
  9. Klik op Eigenschappen om de begin- en eindposities in te stellen voor de apparatuur om het monster over te brengen.
  10. Wacht tot de software terugkeert naar de pagina Werktabel . Klik op de knop Opties om de parameters voor geautomatiseerd zaaien van de ASC's in te stellen: i) Aspiratiesnelheid van 15,4 s-1; ii) Doseersnelheid van 1 s-1; iii) Blaasvertraging van 0 ms; iv) Blaassnelheid van 15,4 s-1; v) Initiële slag van 100%. Selecteer Water als het standaardvloeistoftype.
  11. Stel de parameters in om de ASC's te mengen om een homogene suspensie te verkrijgen: i) Aantal cycli van 5; ii) Snelheid van 6,5 s-1; iii) Volume van 300 μL.
  12. Nadat u de parameters hebt ingesteld, voegt u de tijd van 40 minuten toe aan de lijst met producten.
    OPMERKING: Deze tijd is nodig om te wachten tot de ASC-suspensie aan de onderkant van de micromold decanteert.
  13. Neem in de productenlijst de optie Reagensoverdracht op om het sferoïde cultuurmedium over te brengen naar de overeenkomstige putten van de plaat.
  14. Herhaal stap 3.9-3.11 om de positie- en parameterconfiguraties in te stellen om het sferoïde cultuurmedium over te brengen.
  15. Klik op de knop met een controlesymbool op de bovenste balk van de software om er zeker van te zijn dat er geen programmeerfout is.
  16. Klik op de knop Afspelen (met een driehoekssymbool) op de bovenste balk van de software om het programma te starten.
  17. Laat de apparatuur starten, zoals geprogrammeerd, en wacht tot deze een geluid maakt, wat aangeeft dat deze klaar is.
  18. Verzamel de 12-well plaat en incubeer deze in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 18 uur om de sferoïden volledig gevormd en compact te maken.
  19. Oogst de sferoïden handmatig na 1, 3 en 7 dagen cultuur voor analyse. Spoel het medium handmatig met een micropipette om de sferoïden te bevrijden van de micromolded niet-hechtende agarose hydrogel.
  20. Controleer na 5 minuten onder de microscoop of de sferoïden volledig vrijkomen uit de micromolded niet-adherente agarose hydrogel.
  21. Verzamel de sferoïden handmatig met behulp van een micropipette en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 ml.
  22. Was de sferoïden minstens twee keer met 0,01 M PBS. Beoordeel de levensvatbaarheid en voer biomechanische analyses uit op de verse sferoïde monsters. Voor morfologische analyse (histologie) incubeer de sferoïde monsters in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende ten minste 18 uur bij 2-8 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het automatische pipetsysteem kan de ASC-celsuspensie in 15 minuten in 12 putten van één 12-wellplaat zaaien. Het gebruik van de 81 micromol niet-adherente hydrogel zal 972 sferoïden produceren aan het einde van het protocol. Het gebruik van de 256 micromol niet-adherente hydrogel zal 3.072 sferoïden produceren aan het einde van het protocol. ASC-sferoïden werden geanalyseerd op de homogeniteit van hun grootte en vorm. ASC-sferoïden uit micromolden met 81 recessies vertoonden een homogene diameter tijdens de kweekperiode...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel presenteert de grootschalige generatie ASC-sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetsysteem. De kritieke stap van het protocol is om de software nauwkeurig in te stellen om het juiste volume van celsuspensie, snelheid en afstand voor pipetteren te garanderen. De parameters beschreven in het protocol werden bepaald na een aantal proeven om de afgifte van de ASC-celsuspensie in de putten van 12-well platen met de micromolded, niet-adherente hydrogels te optimaliseren. De optimalisatie werd geëvalueerd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Wij danken het Nationaal Instituut voor Metrologie, Kwaliteit en Technologie (INMETRO, RJ, Brazilië) voor het gebruik van hun faciliteiten. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finance Code: E26/202.682/2018 en E-26/010.001771/2019), de National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finance code: 307460/2019-3) en het Office of Naval Research (ONR) (finance code: N62909-21-1-2091). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12-well plastic plateCorning3512
50 mL centrifuge tubeCorningCLS430828
EpMotion 5070Eppendorf5070000282
epT.I.P.S. MotionEppendorf30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Invitrogen15576028
fetal bovine serum (FBS)Gibco10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)Gibco31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 arraySigmaZ764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 arraySigmaZ764019
phosphate saline buffer (PBS)Sigma806552
sodium chloride (NaCl)SigmaS8776
tissue culture flaskCorning430720U
trypanLonza17-942E
trypsinGibco27250018
ultrapure agaroseInvitrogen16500100

Referenties

  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  3. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
  4. Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
  5. Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
  6. Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  7. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).
  8. Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
  9. Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).
  10. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  11. Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).
  12. Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).
  13. Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).
  14. Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
  15. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).
  16. Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  17. Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  18. Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).
  19. Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
  20. Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).
  21. Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).
  22. Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).
  23. Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
  24. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
  25. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adipose stamcellen3D bioprintenproductie van sfero dengeautomatiseerde celkweekmicromodellerde hydrogelscaffold vrije weefseltechnologiestromale vasculaire fractiesfero de homogeniteitzaaien van cel suspensies

Gerelateerde artikelen