Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Samenvatting

Glaucoom, wereldwijd de op één na belangrijkste oorzaak van blindheid, is een heterogene groep oogaandoeningen die wordt gekenmerkt door structurele schade aan de oogzenuw en degeneratie van retinale ganglioncellen (RGC), wat resulteert in visuele disfunctie door de overdracht van visuele informatie van het oog naar de hersenen te onderbreken. Verhoogde intraoculaire druk is de belangrijkste risicofactor; Daarom zijn er verschillende modellen van oculaire hypertensie ontwikkeld bij knaagdieren door genetische of experimentele benaderingen om de oorzaken en gevolgen van de ziekte te onderzoeken. Daarvan zijn enkele beperkingen gemeld, zoals chirurgische invasiviteit, ontoereikende functionele beoordeling, vereiste van uitgebreide training en zeer variabele uitbreiding van netvliesschade. Het huidige werk kenmerkt een eenvoudige, goedkope en efficiënte methode om oculaire hypertensie bij knaagdieren te induceren, gebaseerd op cauterisatie bij lage temperatuur en volledige cirkel van de limbale vasculaire plexus, een belangrijk onderdeel van de drainage van kamerwater. Het nieuwe model biedt een technisch gemakkelijke, niet-invasieve en reproduceerbare subacute oculaire hypertensie, geassocieerd met progressieve RGC en degeneratie van de oogzenuw, en een uniek postoperatief klinisch herstelpercentage dat in vivo functionele studies mogelijk maakt door zowel elektrofysiologische als gedragsmethoden.

Inleiding

In de medische literatuur wordt glaucoom opgevat als een heterogene groep optische neuropathieën die wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van retinale ganglioncellen (RGC's), dendrieten, soma en axonen, resulterend in structurele cupping (uitgraving) van de optische schijf en functionele verslechtering van de oogzenuw, wat leidt tot amaurosis in ongecontroleerde gevallen door de overdracht van visuele informatie van het oog naar^{de hersenen te} onderbreken 1. Glaucoom is momenteel wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van onomkeerbare blindheid en zal naar verwachting in 2040 ongeveer 111,8 miljoen mensen bereiken², waardoor de kwaliteit van leven van patiënten ernstig wordt aangetast en aanzienlijke sociaaleconomische problemen ontstaan³.

Verhoogde intraoculaire druk (IOD) is een van de belangrijkste en de enige aanpasbare risicofactoren voor de ontwikkeling en progressie van glaucoom. Van de vele soorten glaucoom zijn ze allemaal, behalve normaal spanningsglaucoom (NTG), geassocieerd met verhoogde IOP op enig moment in de klinische geschiedenis van de ziekte. Ondanks opmerkelijke klinische en chirurgische vooruitgang om IOD aan te pakken en de ziekteprogressie te vertragen of te stoppen, verliezen patiënten nog steeds het gezichtsvermogen als gevolg van glaucoom ^4,5. Daarom is een grondig begrip van de complexe en multifactoriële pathofysiologie van deze ziekte noodzakelijk voor de ontwikkeling van effectievere behandelingen, met name om neuroprotectie te bieden aan RGC's.

Van een verscheidenheid aan experimentele benaderingen voor het begrijpen van ziektemechanismen, lijken diermodellen op basis van oculaire hypertensie (OHT) het meest op humaan glaucoom. Knaagdiermodellen zijn bijzonder nuttig omdat ze goedkoop zijn, gemakkelijk te hanteren zijn, genetisch kunnen worden gemanipuleerd, een korte levensduur hebben en oculaire anatomische en fysiologische kenmerken vertonen die vergelijkbaar zijn met die van mensen, zoals de productie en drainage van kamerwater 6,7,8,9,10,11,12,13 . Momenteel gebruikte modellen zijn onder meer sclerose van het trabeculaire netwerk na injectie van hypertone zoutoplossing in episclerale aderen 14, intracamerale injectie van microbeads 15 of visco-elastische stoffen 16, cauterisatie van vortexaders 17, fotocoagulatie van het trabeculaire netwerk met argonlaser 18, circumlimbale hechting ¹⁹ en gebruik van een transgeen model van leeftijdsgebonden OHT (DBA/2J-muizen)⁸. Invasiviteit, postoperatieve troebeling van het hoornvlies, verstoring van het voorste segment, uitgebreide leercurves, dure apparatuur en zeer variabele postoperatieve IOP's behoren echter tot enkele van de gerapporteerde valkuilen die verband houden met de huidige modellen, waardoor de ontwikkeling van een alternatief model van OHT een eis is om deze problemen te overwinnen^20,21,22.

Het huidige protocol formaliseert een nieuwe chirurgische ingreep om OHT te induceren als een proxy voor glaucoom, gebaseerd op limbale plexus cauterisatie (LPC) bij knaagdieren²³. Dit is een eenvoudig, reproduceerbaar, toegankelijk en niet-invasief model dat een hoge efficiëntie en lage variabiliteit van IOD-verhoging biedt, geassocieerd met een uniek hoog percentage volledig klinisch herstel, waardoor in vivo functionele evaluatie wordt geboden bij een verminderd aantal dieren dat in elk experiment wordt gebruikt. De chirurgische techniek induceert subacute OHT met een geleidelijke terugkeer naar de basislijnniveaus in een paar dagen, wat de hypertensieve aanval modelleert die wordt gezien bij acuut geslotenhoekglaucoom. Bovendien wordt het IOD-herstel in het model gevolgd door continue glaucoomneurodegeneratie, wat nuttig is voor toekomstige mechanistische studies van de secundaire degeneratie van RGC's, die optreedt in verschillende gevallen van humaan glaucoom ondanks adequate controle van IOD.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) en goedgekeurd door de Ethische Commissie voor het gebruik van dieren in wetenschappelijke experimenten van het Health Sciences Center, Federale Universiteit van Rio de Janeiro (protocol 083/17). In het huidige werk werden Lister Hooded-ratten van beide geslachten gebruikt, 2-3 maanden oud en met een gewicht van 180-320 g. De procedure kan echter worden aangepast in verschillende rattenstammen van verschillende leeftijdscategorieën.

1. Oculaire hypertensiechirurgie en klinische follow-up

1. Huisdieren in een omgeving met gecontroleerde temperatuur en een licht/donkercyclus van 12 uur (6 uur: licht aan/18 uur: licht uit) met standaard gepelletiseerd gamma-bestraald voer (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brazilië) en water (drievoudig filter, met niet-giftige actieve kool) ad libitum beschikbaar.
2. Bereid een bouillon anesthesiecocktail mengsel bestaande uit drie delen 10% ketaminehydrochloride en één deel 2% xylazinehydrochloride (verdunningsmiddel: steriel water).
3. Houd het dier voorzichtig in bedwang door de dorsale huid vast te houden en induceer anesthesie door intraperitoneale toediening van 1 μl/g lichaamsgewicht van het mengsel (ketamine: 75 mg/kg; xylazine: 5 mg/kg). Controleer na ongeveer 5 minuten op de juiste verdoving door een teenknijpreactie uit te voeren.
4. Verdoof plaatselijk beide oogoppervlakken door proxymetacaïnehydrochloride 0,5% oogdruppel in te druppelen. Wacht 30-60 s en verwijder de resterende oplossing van het voorste deel van de bol door het neus- of laterale bulbaire bindvlies voorzichtig aan te raken met een klein steriel wattenstaafje.
5. Meet de baseline IOP van zowel experimentele als contralaterale controleogen door het dier in een ventrale decubituspositie op de tafel te plaatsen, zodat het hoornvliesoppervlak gemakkelijk toegankelijk is voor de punt van de tonometer.
6. Gebruik een applanatie- of rebound-handtonometer (Figuur 1A). Plaats de punt van de tonometer zo dat deze de centrale hoornvlieszone loodrecht lichtjes raakt. Verwerf en bereken 3-5 betrouwbare, door machines gegenereerde gemiddelden. Elk gemiddelde wordt automatisch door het apparaat berekend na zes succesvolle individuele metingen.
   1. Laad de rebound-tonometer met een sonde en druk eenmaal op de meetknop om hem in te schakelen, terwijl u de punt van het apparaat naar boven plaatst om te voorkomen dat de sonde valt. Na het inschakelen toont het display 00 om aan te geven dat de apparatuur klaar is om te meten.
   2. Plaats het apparaat met de punt van de sonde op een afstand van 1-4 mm van het hoornvlies en voer metingen uit door snel en voorzichtig op de meetknop te drukken, zonder het apparaat te verplaatsen. Elke succesvolle meting wordt geïdentificeerd door een korte pieptoon en na zes keer wordt het gemiddelde weergegeven op het scherm van het apparaat.
      OPMERKING: Ondanks een lange ervaring met applanatietonometer, raden de auteurs het gebruik van een rebound-tonometer aan om de hele procedure te optimaliseren, waardoor een betrouwbare IOD-meting gemakkelijker kan worden verkregen.
7. Plaats het dier op een lichte laterale decubituspositie onder een stereomicroscoop en plan de operatie zorgvuldig door het experimentele oog te inspecteren met een vergroting van 40x. Vergeet niet om het contralaterale controleoog tijdens de procedure gesmeerd te houden door een druppel carmellosenatrium of natriumhyaluronaat in te druppelen.
8. Duw met behulp van een gebogen pincet de experimentele oogbol voorzichtig naar voren om het vaatstelsel bloot te leggen dat 360° van de limbus¹³ omringt. Schroei met de andere hand de bloedvaten rondom het hoornvlies voorzichtig dicht met een oogheelkundige cauterisatie bij lage temperatuur (1,300 ° F; Bovie Medical, VS) (Figuur 1B-E).
   OPMERKING: De genoemde cauterisatie heeft een ronde punt die de limbale vasculatuur in de lengterichting moet raken.
9. Pas op dat u de periferie van het hoornvlies niet dichtschroeit, omdat dit kan leiden tot postoperatieve vertroebeling van het hoornvlies, wat een in vivo beoordeling van de netvliesfunctie uitsluit.
10. Let op het verschijnen van kleine cirkelvormige sporen van cauterisatie op de sclerale limbus, de vernietiging van limbale vasculatuur en pupilverwijding in het geopereerde oog, die tekenen zijn van een succesvolle chirurgische ingreep.
    OPMERKING: Aangezien de limbale vasculatuur van ratten en muizen anatomisch vergelijkbaar is^13,24 en de gebruikte cauterisatie een zachte kleine punt heeft^, kan dit protocol ook voor het muizenoog werken zonder enige aanpassing.
11. Controleer na de operatie de onmiddellijke postoperatieve IOP in beide ogen, zoals beschreven in stap 1.5.
12. Breng een druppel oogheelkundig prednisolonacetaat (1,2 mg/ml) aan en houd dit gedurende ongeveer 40 s in contact met het voorste oppervlak van het experimentele oog, vervang het vervolgens door een oogzalf van antibiotica (oxytetracyclinehydrochloride 30 mg/g plus polymyxine B 10.000 E/g; of ciprofloxacine 3,5 mg/g). Voer een intramusculaire injectie uit met tramadolhydrochloride (enkele dosis; 2 mg/kg) om pijn na de procedure te voorkomen.
13. Volg het herstel van het dier na de anesthesie op de voet, bij voorkeur in een warme omgeving zoals een verwarmingskussen of in de kooi met goed strooisel. Let op het ademhalingspatroon.
14. Voer een dagelijkse klinische follow-up van het experimentele oog uit met lokale medicatie die bestaat uit een niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID, bijv. ketorolac trometamol 0,5% oogdruppel) en antibiotische zalf (bij voorkeur dezelfde die onmiddellijk na de operatie wordt gebruikt).
    OPMERKING: Het gebruik van NSAID in plaats van steroïde anti-inflammatoire oogdruppels wordt aanbevolen omdat deze laatste OHT kunnen induceren en regelmatig worden toegepast voor glucocorticoïd-geïnduceerde glaucoommodellen bij knaagdieren.
    1. Meet onder lichte sedatie (ketamine: 18,75 mg/kg; xylazine: 1,25 mg/kg) de IOD bij voorkeur op dezelfde periode van de dag, om vertekening als gevolg van fysiologische circadiane IOD-fluctuaties te voorkomen.
    2. Let tijdens het oculair onderzoek op zeldzame klinische intercurrenties, zoals hyphema, hoornvliesfibrose of dunner worden van de sclera geassocieerd met uveale verzakking. Hoornvliesoedeem, chemose en conjunctivale hyperemie komen vaak voor, maar zijn tijdelijk.
    3. Merk volledig klinisch herstel op rond postoperatieve dag 7. Limbale revascularisatie begint meestal in de eerste twee dagen na de operatie, in lijn met de verwachte geleidelijke IOD-terugkeer naar de uitgangswaarde.

2. Analyse van de optomotorische respons (OMR)

OPMERKING: Voor deze procedure werd een specifiek systeem gebruikt²⁵.

1. Plaats vier computerschermen in een vierhoek, die een arena afbakenen met een platform in het midden. Geef op de monitoren het beeld weer van een virtuele cilinder met verticaal georiënteerde sinusroosters (afwisselend zwarte en witte strepen), die met een vaste snelheid (12 graden/s) en contrast (100%) rond het platform draaien.
2. Plaats een videocamera boven het platform, zodat de onderzoeker de bewegingen van het dier kan volgen. Voer de test uit in fotopische omstandigheden en stel de software bij voorkeur in op de handmatige/afzonderlijke modus om elk oog afzonderlijk te evalueren.
3. Laat dieren ongeveer 2 minuten wennen op het platform. Houd de rode dradenkruiscursor op het videoframe tussen de ogen van het vrij bewegende dier, aangezien dit het midden van de virtuele cilinder aangeeft (Figuur 1G)²⁵.
4. Observeer de OMR, bestaande uit een reflexief volgen van de kop en nek van het dier, uitgelokt door de roterende roosters. Test de linker en rechter visuele paden door de richtingen van de sinusroosters respectievelijk met de klok mee en tegen de klok in te draaien.
   1. Presenteer in eerste instantie een stimulus met een lage ruimtelijke frequentie (0,042 cycli/graad). Verhoog vervolgens de frequentie geleidelijk totdat de volgbeweging niet meer wordt opgemerkt. De hoogste ruimtelijke frequentie waarin een duidelijke OMR wordt opgewekt, komt overeen met de drempelfrequentie van het geëvalueerde oog.
   2. Als het dier tijdens het onderzoek uiteindelijk van het platform valt, breng het dan onmiddellijk terug naar het platform en hervat de test.

3. Registratie van patroon-elektroretinogram (PERG)

OPMERKING: Het elektroretinogram is opgenomen met behulp van een specifiek systeem voor signaalverwerking en bijbehorende software voor opslag en analyse van de golfvormen.

1. Dieren diep verdoven door intramusculaire injectie van ketaminehydrochloride en xylazinehydrochloride (respectievelijk 75 mg/kg en 5 mg/kg). Diepe anesthesie (chirurgisch vlak) vermindert de kans op artefacten door onwillekeurige spierbewegingen of alternatieve geluidsbronnen tijdens het onderzoek. Controleer op de juiste verdoving door een teenknijpreactie uit te voeren.
   OPMERKING: De genoemde anesthetica hebben geen invloed op de amplitude van de respons²⁶. Aangezien een kleine naald die in het hoornvlies werd ingebracht als actieve elektrode werd gebruikt, heeft intramusculaire anesthesie de voorkeur in plaats van intraperitoneale, omdat het gemakkelijker is om opnieuw te injecteren in het geval dat de rat een boosterdosis nodig heeft (1/2 van de aanvangsdosis), met een kleinere kans om de positie van de elektrode te wijzigen en dus te leiden tot meer reproduceerbare records tijdens het hele experiment, die tot 60 minuten kan duren.
2. Verdoof het hoornvlies plaatselijk met een druppel proxymetacaïnehydrochloride 0,5% en houd het andere oog bevochtigd met oogheelkundige smeermiddelen.
3. Steek de actieve elektrode (roestvrijstalen naald 0,25 mm × 15 mm) voorzichtig in de temporale periferie van het hoornvlies. Steek bovendien de referentie- en aardelektroden (roestvrijstalen naald 0,4 mm × 37 mm) in respectievelijk het onderhuidse weefsel van de ipsilaterale temporale canthus en in een van de achterpoten (Figuur 1I).
4. Stel voor PERG de stimulus in op een zwart-wit reserveschaakbord, afwisselend met 15 omkeringen/s met een constante gemiddelde luminantie (250 cd/m2). Stel het banddoorlaatfilter in op 1 Hz-100 Hz.
   OPMERKING: De snelle omkerende stimulus genereert de steady-state PERG, een stabiele en reproduceerbare sinusoïde die de golfcomponent verzamelt die hoogstwaarschijnlijk geassocieerd is met RGC bio-elektrische respons: NII-afbuiging van de transiënte toestand PERG.
5. Plaats het dier op 20 cm van het stimulusscherm (LCD-monitor 0,58 m; Figuur 1I), bewaak de basislijn van het signaal en start de PERG-acquisitie door op de knop Analyse op het acquisitiesysteem te drukken.
6. Houd de dieren tijdens de procedure aangepast aan het omgevingslicht (wit licht van ~140 lux). Hier werden zes verschillende ruimtelijke frequenties (in cycli per graad: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) in willekeurige volgorde gepresenteerd.
   OPMERKING: De software die wordt gebruikt voor signaalverwerking voert automatisch middeling uit. Het gemiddelde van 200-300 individuele golven werd als voldoende beschouwd om zich te onderscheiden van de ruis en de golfamplitude te analyseren.

4. Kwantificering van retinale ganglioncellen somas

OPMERKING: De volgende procedure is voor het kwantificeren van RGC-soma's, gebaseerd op immunohistochemische kleuring van retinale flat-mounts met een antilichaam tegen het hersenspecifieke homeobox/POU-domeineiwit 3A (Brn3a).

1. Proefdieren onderwerpen aan euthanasie van cervicale dislocatie, voorafgegaan door inademing van kooldioxide om bewusteloosheid te veroorzaken.
2. Ontleed onmiddellijk na euthanasie beide ogen onder een stereomicroscoop met een getande tang en een gebogen schaar.
3. Voer een zorgvuldige dissectie uit, zodat zowel het distale deel van de extraoculaire spieren als de karbonkel aan de bol blijven vastzitten, aangezien dit belangrijke oriëntatiepunten zijn voor de topografische oriëntatie van het netvlies (beschreven in stap 4.5). Probeer een stuk van de oogzenuw die aan de wereldbol vastzit zo lang mogelijk te bewaren voor toekomstige analyse.
4. Plaats de ogen na enucleatie in een oplossing van 1 ml van 4% paraformaldehyde (4% PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PBS) en bewaar deze gedurende 24 uur voor een goede chemische fixatie.
5. Scheid het netvlies van de rest van de oogweefsels.
   1. Plaats de oogbol onder een ontleedmicroscoop in een petrischaal bedekt met 1x PBS en let op belangrijke oriëntatiepunten zoals neuskarbonkel, vaatscheuren en sclerale afdrukken van vortexaders voor een goede topografische oriëntatie²⁷.
   2. Penetreer de voorste oogkamer vanaf het centrale hoornvlies met behulp van een getande tang en een gebogen schaar (westcott). Maak twee radiale sneden in het superieure (dorsale) aspect van de sclera, in de richting van het sclerale foramen van de oogzenuw, om het dorsale kwadrant van de oogbol af te bakenen.
   3. Scheid het hoornvlies van de rest van de bol door middel van een longitudinale 360° snede bij de sclerale limbus. Verwijder de lens en de iris en beperk het dorsale retinale kwadrant met dezelfde sclerale radiale afbakeningen als hierboven beschreven (stap 4.5.2).
   4. Maak het netvliesweefsel voorzichtig los van het vaatvlies en de sclera, vermijd zowel willekeurige snijwonden in het weefsel als uiteindelijk topografisch verlies van oriëntatie.
   5. Scheid het corpus ciliare van retinale ora serrata. Verwijder voorzichtig het resterende glasvocht uit de netvliesbeker met behulp van zowel een gebogen niet-getande pincet als een gebogen schaar (trek aan het glasvocht en ontleed het dicht bij het interne beperkende membraan) en een kleine borstel.
      OPMERKING: Het verwijderen van glasvocht is een belangrijke stap om een sterk en schoon immunohistochemisch signaal te verkrijgen.
6. Breng geïsoleerde netvliezen over in een kweekplaat met 24 putjes (één netvlies per putje) met 1 ml 1x PBS en houd het binnenste netvlies naar boven gericht.
7. Permeabiliseer weefsel door 3x gedurende 10 minuten te wassen met een niet-ionische oppervlakteactieve stof 0,5% verdund in 1x PBS (0,3 ml). Houd het weefsel vervolgens zachtjes schuddend in 5% runderserumalbumine (BSA) in niet-ionogene oppervlakteactieve stof 2% en 1x PBS (blokkerende oplossing; 0,25 ml) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
8. Bereid tijdens stap 4.7 de primaire Brn3a-antilichaamoplossing door 1:200 te verdunnen in niet-ionogene oppervlakteactieve stof 0,5% en 1x PBS plus 5% BSA, en bewaar deze bij 4 °C.
9. Na 60 minuten weefselblokkering netvliezen incuberen in 0,2 ml primaire antilichaamoplossing bij 4 °C gedurende 72 uur met zacht schudden.
10. Was het weefsel 3x gedurende 10 minuten met 1x PBS en incubeer het weefsel vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in 0,2 ml van de secundaire antilichaamoplossing verdund 1:750 in 1x PBS plus 5% BSA.
11. Incubeer het weefsel verder gedurende 10 minuten in een nucleaire tegenvlekoplossing voor fluorescerende kernkleuring. Sluit de immunohistochemie af met een laatste wasstap met 1x PBS (0,3 ml) 3x herhaald.
12. Breng het netvlies over met behulp van twee kleine borstels op glazen microscoopglaasjes, waarbij u het glasvocht naar boven houdt. Plaats het dorsale retinale kwadrant omhoog op de microscoopglaasjes (eerder afgebakend in stap 4.5.3). Maak nog twee radiale sneden in de richting van de oogzenuwkop om de andere 3 kwadranten (nasaal, ventrale en temporale) af te bakenen.
    NOTITIE: De snijmaten staan niet vast. Ze mogen niet te kort zijn om een efficiënte afplatting van het netvlies op het objectglaasje te belemmeren en mogen niet te lang zijn zodat het het foramen van de oogzenuw bereikt en het afgebakende retinale kwadrant volledig scheidt van de rest van het weefsel.
13. Breng ten slotte 0,2 ml antifade-montagemedium aan op een glazen dekglaasje en plaats dit op het plat gemonteerde netvlies voor microscopische weefselanalyse. Om de dichtheid van RGC's te schatten, onderzoekt u de platte monturen onder een confocale epifluorescentiemicroscoop met behulp van een 40x/1.3-objectief.
14. Maak voor elk kwadrant van het netvlies acht foto's: twee van het centrale netvlies (~0,9 mm van de optische schijf), drie van het midden van het netvlies (~2,0 mm van de optische schijf) en drie van het perifere netvlies (~3,7 mm van de optische schijf), in totaal 32 foto's per netvlies. Gebruik de FIJI-software om Brn3a-positieve cellen te tellen en de gemiddelde celdichtheid te schatten.

5. Onderzoek van de oogzenuw

1. Verwijder na euthanasie en enucleatie van de oogbol (stappen 4.1-4.3) het proximale segment van het intraorbitale deel van de oogzenuw (1-2 mm), inclusief een deel van het intraoculaire gedeelte, en plaats de monsters onmiddellijk in injectieflacons/buisjes met 0,2-0,3 ml koud fixeermiddel (2,5% glutaaraldehyde-oplossing in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4)) gedurende 2 uur.
   OPMERKING: De volgende stappen voor de verwerking van de oogzenuw worden uitgevoerd in dezelfde injectieflacons/buisjes als stap 5.1
2. Was het materiaal 3x gedurende 5 min met koude 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Post fixeer weefsel gedurende 1 uur onder zacht schudden in een oplossing van 1,0% osmiumtetroxide in 0,8% kaliumferrocyanide en 5 nM calciumchloride verdund in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer bij 4 °C (0,1-0,2 ml).
3. Was oogzenuwfragmenten 3x gedurende 5 min met koude 0,1 M natriumcacodylaatbuffer en vervolgens met koud gedestilleerd water, 3x gedurende 1 min. Bewaar het materiaal een nacht onder voorzichtig schudden in een oplossing van 1,0% uranylacetaat in gedestilleerd water voor kleuring bij 4 °C (0,1-0,2 ml). Was fragmenten 3x met koud gedestilleerd water.
4. Uitdroging van het weefsel geleidelijk met een gegradueerde acetonreeks (elk 0,5 ml), met daaropvolgende vervangingen van de volgende verdunningen in gedestilleerd water: 2x 7 min incubatie in 15% ijskoude aceton; 2x 7 min incubatie in 30% ijskoude aceton; 2x 7 min incubatie in 50% ijskoude aceton; 2x 7 min incubatie in 70% ijskoude aceton; 2x 7 min incubatie in 80% ijskoude aceton; 2x 7 min incubatie in 90% ijskoude aceton; 2x 15 min incubatie in 100% aceton bij kamertemperatuur (RT).
5. Voer 3 infiltratie-/inbeddingsstappen uit, met daaropvolgende vervanging van de volgende oplossingen: 1 deel epoxyhars: 2 delen aceton (totaal volume: 0,5 ml), bij RT gedurende 12 uur; 1 deel epoxyhars: 1 deel aceton (totaal volume: 0,5 ml), bij RT gedurende 12 uur; 2 delen epoxyhars: 1 deel aceton (totaal volume: 0,5 ml), bij RT gedurende 12 uur. Infiltreer ten slotte het weefsel in pure epoxyhars bij RT gedurende 24 uur.
6. Verwijder monsters uit de monsterdrager, breng ze over naar inbeddingsmallen en laat ze gedurende 48 uur polymeriseren bij 60 °C. Snijd transversale halfdunne secties (300-400 nm) van de oogzenuwfragmenten met behulp van een ultramicrotoom, verzamel ze en breng ze over op een microscoopglaasje. Kleurs secties met toluïdineblauw en beeld de optische microscoop af met een vergroting van 100x.
7. Voer voor ultrastructurele analyse ultradunne doorsneden (70 nm) uit, verzamel ze op koperen roosters en kleur ze met uranylacetaat en loodcitraat. Bestudeer de secties in een transmissie-elektronenmicroscoop.

Resultaten

De kwantitatieve variabelen worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Met uitzondering van de vergelijking van de IOD-dynamiek tussen OHT en controlegroepen (Figuur 1F), werd statistische analyse uitgevoerd met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Sidak. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Figuur 1 illustreert chirurgische stappen...

Discussie

Limbale plexus cauterisatie (LPC) is een nieuw post-trabeculair model met het voordeel dat het zich richt op gemakkelijk toegankelijke vasculaire structuren waarvoor geen conjunctivale of pendissectie nodig is^17,28. Anders dan het cauterisatiemodel van vortexaders, een gerenommeerd OHT-model gebaseerd op de chirurgische stoornis van choroïde veneuze drainage, wordt niet verwacht dat veneuze congestie de IOD-stijging in het LPC-model zal beïnvloeden, aangezien lim...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetone	Isofar	201	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Roestvrijstalen naald 0,25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0,5%
Calcium chloride	Vetec	560	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Laagtemperatuur oogheelkundig cauter
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-fenylindole; blauwe fluorescente nucleaire tegenkleuring; emissie bij 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0,5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxyhars gebruikt voor elektronenmicroscopie, samengesteld uit een mengsel van vier reagentia: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)fenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0,15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (modelnummer)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secundaire antilichaamoplossing
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, voor electroretinogram opname
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocale epifluorescentiemicroscoop
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3,5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	Systeem voor electroretinogram opname
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primaire antilichaamoplossing
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software voor electroretinogram signaalverwerking
Optomotry	CerebralMechanics	-	Systeem voor optomotorische responsanalyse
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Roestvrijstalen naalden 0,4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolonacetaat 0,12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0,5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10.000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digitaal applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Verre rood-fluorescente nucleaire tegenkleuring; emissie bij 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Niet-ionogene oppervlakteactieve stof
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Gebruikt voor elektronenmicroscopie weefselvoorbereiding (stap 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereomicroscoop voor chirurgie en retinale dissectie