Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63446

⸱

1 maart 2022

 , 
1Department of Pharmaceutical Biology, Julius-von-Sachs-Institute, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Samenvatting

De rhizosfeer herbergt een zeer complexe microbiële gemeenschap waarin plantenwortels voortdurend worden uitgedaagd. Wortels staan in nauw contact met een grote verscheidenheid aan micro-organismen, maar studies naar bodemgedragen interacties lopen nog steeds achter op die op bovengrondse organen. Hoewel sommige inentingsstrategieën voor het infecteren van modelplanten met modelwortelpathogenen in de literatuur worden beschreven, blijft het moeilijk om een uitgebreid methodologisch overzicht te krijgen. Om dit probleem aan te pakken, worden precies drie verschillende wortelinentingssystemen beschreven die kunnen worden toegepast om inzicht te krijgen in de biologie van wortel-microbe interacties. Ter illustratie werden Verticillium-soorten (namelijk V. longisporum en V. dahliae) gebruikt als wortelindringende modelpathogenen. De methoden kunnen echter gemakkelijk worden aangepast aan andere wortelkoloniserende microben - zowel pathogeen als gunstig. Door het xyleem van de plant te koloniseren, vertonen vasculaire bodemschimmels zoals Verticillium spp. een unieke levensstijl. Na wortelinvasie verspreiden ze zich acropetaal via de xyleemvaten, bereiken ze de scheut en veroorzaken ze ziektesymptomen. Drie representatieve plantensoorten werden gekozen als modelgastheren: Arabidopsis thaliana, economisch belangrijk koolzaad (Brassica napus) en tomaat (Solanum lycopersicum). Stap-voor-stap protocollen worden gegeven. Representatieve resultaten van pathogeniciteitstests, transcriptionele analyses van markergenen en onafhankelijke bevestigingen door reporterconstructen worden getoond. Verder komen de voor- en nadelen van elk inentingssysteem uitgebreid aan bod. Deze bewezen protocollen kunnen helpen bij het bieden van benaderingen voor onderzoeksvragen over wortel-microbe interacties. Weten hoe planten omgaan met microben in de bodem is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën om de landbouw te verbeteren.

Inleiding

Natuurlijke bodems worden bewoond door een verbazingwekkend aantal microben die neutraal, schadelijk of gunstig kunnen zijn voor planten1. Veel plantpathogenen worden door de grond gedragen, omringen de wortels en vallen het ondergrondse orgaan aan. Deze micro-organismen behoren tot een grote verscheidenheid aan clades: schimmels, oomyceten, bacteriën, nematoden, insecten en sommige virussen 1,2. Zodra de omgevingsomstandigheden infectie bevorderen, zullen gevoelige planten ziek worden en de gewasopbrengsten afnemen. De effecten van klimaatverandering, zoals de opwarming van de aarde en weersextremen, zullen het aandeel van door de bodem overgedragen plantpathogenen vergroten3. Daarom zal het steeds belangrijker worden om deze destructieve microben en hun impact op de voedsel- en diervoederproductie, maar ook op natuurlijke ecosystemen te bestuderen. Bovendien zijn er microbiële mutualisten in de bodem die nauw interageren met wortels en de groei, ontwikkeling en immuniteit van planten bevorderen. Wanneer ze geconfronteerd worden met ziekteverwekkers, kunnen planten actief specifieke tegenstanders in de rhizosfeer rekruteren die de overleving van de gastheer kunnen ondersteunen door pathogenente onderdrukken 4,5,6,7. Mechanistische details en routes die betrokken zijn bij gunstige wortel-microbe interacties zijn echter vaak nog onbekend6.

Het is daarom essentieel om het algemene begrip van wortel-microbe interacties uit te breiden. Betrouwbare methoden voor het inenten van wortels met bodemgebonden micro-organismen zijn nodig om modelstudies uit te voeren en de bevindingen over te brengen naar landbouwtoepassingen. Gunstige interacties in de bodem worden bijvoorbeeld bestudeerd met Serendipita indica (voorheen bekend als Piriformospora indica), stikstofbindende Rhizobium spp., of mycorrhizaschimmels, terwijl bekende bodemgedragen plantpathogenen Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. en Verticillium spp.1 omvatten. De laatste twee zijn schimmelgeslachten die wereldwijd verspreid zijn en vaatziekten veroorzaken2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan honderden plantensoorten infecteren - grotendeels tweezaadlobbigen, waaronder kruidachtige eenjarigen, houtachtige vaste planten en veel gewasplanten 2,8. Schimmeldraden van Verticillium komen de wortel binnen en groeien zowel intercellulair als intracellulair naar de centrale cilinder om de xyleemvaten te koloniseren 2,9. In deze vaten blijft de schimmel het grootste deel van zijn levenscyclus. Omdat het xyleemsap voedselarm is en plantaardige afweermiddelen bevat, moet de schimmel zich aanpassen aan deze unieke omgeving. Dit wordt bereikt door de afscheiding van kolonisatie-gerelateerde eiwitten die de ziekteverwekker in staat stellen om te overleven in zijn gastheer10,11. Na het bereiken van de wortelvasculatuur kan de schimmel zich acropetaal in de xyleemvaten verspreiden naar het gebladerte, wat leidt tot systemische kolonisatie van de gastheer 9,12. Op dit punt wordt de plant negatief beïnvloed in de groei 9,10,13. Zo komen groeiachterstand en gele bladeren voor, evenals voortijdige senescentie 13,14,15,16.

Een lid van dit geslacht is Verticillium longisporum, dat sterk is aangepast aan brassicaceous gastheren, zoals het agronomisch belangrijke koolzaad, bloemkool en de modelplant Arabidopsis thaliana12. Verschillende studies combineerden V. longisporum en A. thaliana om uitgebreide inzichten te krijgen in door de bodem overgedragen vaatziekten en de resulterende wortelafweerreacties 13,15,16,17. Eenvoudige gevoeligheidstests kunnen worden gerealiseerd met behulp van het V. longisporum / A. thaliana-modelsysteem en er zijn gevestigde genetische bronnen beschikbaar voor beide organismen. Nauw verwant aan V. longisporum is de ziekteverwekker Verticillium dahliae. Hoewel beide schimmelsoorten een vergelijkbaar vasculair levensstijl- en invasieproces uitvoeren, zijn hun voortplantingsefficiëntie van wortels tot bladeren en de uitgelokte ziektesymptomen bij A. thaliana verschillend: terwijl V. longisporum meestal vroege veroudering induceert, resulteert V. dahliae-infectie in verwelking18. Onlangs presenteerde een methodologische samenvatting verschillende wortelinentingsstrategieën voor het infecteren van A. thaliana met V. longisporum of V. dahliae, wat hielp bij het plannen van experimentele opstellingen19. In het veld veroorzaakt V. longisporum af en toe aanzienlijke schade bij de productie van koolzaad12, terwijl V. dahliae een zeer breed gastheerbereik heeft dat bestaat uit verschillende gekweekte soorten, zoals wijnstok, aardappel en tomaat8. Dit maakt beide pathogenen economisch interessante modellen om te bestuderen.

De volgende protocollen gebruiken dus zowel V. longisporum als V. dahliae als modelwortelpathogenen om mogelijke benaderingen voor wortelinentingen te illustreren. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), koolzaad (Brassica napus) en tomaat (Solanum lycopersicum) werden gekozen als model gastheren. Gedetailleerde beschrijvingen van de methodologieën zijn te vinden in de onderstaande tekst en de bijbehorende video. Voor- en nadelen voor elk inentingssysteem worden besproken. Al met al kan deze protocolverzameling helpen om een geschikte methode te vinden voor specifieke onderzoeksvragen in de context van wortel-microbe interacties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Media voor schimmelculturen en planteninentingssystemen

  1. Vloeibare aardappel dextrose bouillon (PDB): Bereid 21 g/l PDB in ultrapuur water in een hittestabiele kolf.
  2. Vloeibare Czapek Dextrose Bouillon (CDB): Bereid 42 g/L CDB in ultrapuur water in een hittestabiele kolf.
  3. Medium voor het inentingssysteem van de petrischaal: Bereid een hittestabiele kolf voor met 1,5 g/l Murashige en Skoog medium (MS) en 8 g/l agar in ultrapuur water.
    OPMERKING: Vermijd suiker in dit medium omdat dit zal leiden tot overmatige schimmelgroei na inenting.
  4. Medium voor het inentingssysteem op basis van plastic bekers: Bereid een hittestabiele kolf voor met 4,4 g/l MS, 0,2 g/l MgSO4, 1 g/l KNO3, 0,5 g/l 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES) en 6,0 g/l agar in ultrapuur water en stel de pH in op 5,7 met 5 M KOH.
    OPMERKING: Vermijd suiker in dit medium omdat dit zal leiden tot overmatige schimmelgroei na inenting.
  5. 1/4 MS medium: Bereid 1,2 g/L MS in ultrapuur water.
  6. Gebruik de autoclaaf om alle bovenstaande oplossingen te steriliseren. Doe de glazen kolven in de mand, sluit het deksel en steriliseer gedurende 15 min bij 121 °C en 98,9 kPa.

2. Sterilisatie van het oppervlak van plantenzaden

OPMERKING: Gebruik het onderstaande protocol altijd om het oppervlak van zaden van Arabidopsis, koolzaad en tomaat te steriliseren voorafgaand aan het zaaien.

  1. Breng de zaden over in een reactiebuis van 2 ml. Plaats de buis in een exsiccator met een inwendige capaciteit van 5,8 L.
  2. Genereer chloorgas in de exsiccator door 6 ml 33% zoutzuur (HCl) toe te voegen aan 100 ml 12% waterig natriumhypochloriet (NaClO).
  3. Sluit onmiddellijk het deksel van de exsiccator en incubeer de zaden gedurende 3 uur in het gas.

3. Het entmateriaal bereiden met Verticillium sporen (aseksueel afgeleid conidia)

OPMERKING: Kweek V. dahliae (stam JR2) op dezelfde manier als V. longisporum (stam Vl43)17,18,19. Zorg ervoor dat alle apparatuur en media kiemvrij zijn en dat alle stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap om het entmateriaal axeen te houden.

  1. Vul 150 ml vloeibare PDB (stap 1.1) in een chicaneskolf van 500 ml en vul het medium aan met 500 mg/l cefotaxime.
  2. Voeg Verticillium conida uit de glycerol-stockopslag toe aan het VOB-medium. Sluit de kolf met een steriele schuimstop.
  3. Incubeer de cultuur gedurende 7-10 dagen in een donkere doos bij kamertemperatuur (RT) onder continu, horizontaal schudden (roterende shaker; 60 rpm). Dit resulteert in kleine, witte myceliabolletjes.
  4. Verwijder het PDB-supernatant voorzichtig en gooi het weg. Het grootste deel van de mycelia moet in de kolf blijven.
  5. Voeg 100 ml vloeibare CDB (stap 1.2) toe aan de mycelia in de chicaneskolf en vul het medium aan met 500 mg/l cefotaxime.
  6. Incubateer nog eens 4-5 dagen in een donkere doos bij RT onder continu, horizontaal schudden (roterende shaker, 60 rpm) om sporulatie te induceren. Het supernatant zal geelachtig grijs worden als conidia worden vrijgegeven.
  7. Filtreer een deel (5-10 ml) van de conidia-bevattende vloeistof door een filterpapier (deeltjesretentieniveau van 8-12 μm) in een steriele opvangbuis van 50 ml. Dit scheidt sporen van mycelia.
  8. Bepaal de sporenconcentratie met behulp van een celtelkamer en een microscoop. Verdun met kiemvrij 1/4 MS medium in ultrapuur water totdat de onderstaande sporenconcentraties zijn verkregen.
    OPMERKING: Onder de microscoop zijn de conidia van V. longisporum meestal langgetrokken en 7,1-8,8 μm groot, terwijl V. dahliae conidia korter zijn (3,5-5,5 μm) en vrij bolvormig20.
  9. Gebruik deze vers geoogste conidia als entmateriaal. Zorg ervoor dat de experimenten altijd worden uitgevoerd met vers geoogste conidia en niet met bevroren voorraden, omdat invriezen het aantal levensvatbare sporen aanzienlijk vermindert19.
  10. Voor langdurige opslag vriest u de sporen in als hooggeconcentreerde sporenoplossing (ongeveer 1 x 108 sporen/ml) in 25% glycerol bij -80 °C (bewaarbaar tot 1 jaar). Gebruik voor de volgende experimenten deze glycerolvoorraden om het VOB-medium in stap 3.2 te enten.

4. Een steriel in vitro inentingssysteem op basis van petrischalen

OPMERKING: Zorg er voor het petrischaalsysteem17 voor dat alle apparatuur en media kiemvrij zijn en dat alle stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap.

  1. Giet na het autoclaveren het medium (zie stap 1.3) in petrischalen.
  2. Na het uitharden van het medium, verpak de petrischalen opnieuw in een steriele plastic zak en bewaar ze ondersteboven in de koelkast (4-10 °C). Een gekoeld medium helpt om glijden van het medium in de volgende stappen te voorkomen.
  3. Snijd en verwijder een infectiekanaal en het bovenste derde deel van het gestolde medium met een scalpel (figuur 1A). Vermijd het krijgen van vloeistof of lucht onder het agar medium tijdens het snijden; anders zal het medium wegglijden en het infectiekanaal sluiten.
  4. Verdeel 50-100 oppervlakte-gesteriliseerde Arabidopsis zaden met een steriele pipetpunt op het gesneden bovenoppervlak. Plaats de zaden in de hoek waar het gesneden agaroppervlak in contact komt met de wand van de petrischaal, zodat wortels tussen het medium en de petrischaalwand kunnen groeien. Dit zal de inenting later vergemakkelijken.
  5. Sluit de petrischaaltjes en sluit ze af met luchtdoorlatend plakband om gasuitwisseling mogelijk te maken.
  6. Na stratificatie gedurende 2 dagen in de duisternis bij 4 °C, plaatst u de platen verticaal in een geschikt rek en kweekt u de planten bij 22 °C ± 1 °C onder lange dagomstandigheden (16 uur licht / 8 uur donker) in een groeikamer.
  7. Wanneer de meerderheid van de wortels het infectiekanaal (ongeveer 9-11 dagen oude zaailingen) bereikt, legt u de platen horizontaal, opent u ze en voegt u 500 μL vers geoogst Verticillium conidia toe met een concentratie van 4 x 105 sporen / ml rechtstreeks in het infectiekanaal, zodat de vloeistof gelijkmatig in het kanaal wordt verdeeld.
  8. Bereid op dezelfde manier controleplaten voor door 500 μL van een schijnoplossing toe te voegen in plaats van sporen (kiemvrij 1/4 MS-medium).
  9. Incubeer de platen een paar minuten horizontaal totdat de vloeistof is ingeweekt en niet kan uitlekken wanneer de platen weer verticaal worden geplaatst. Sluit vervolgens het deksel en sluit de platen af met luchtdoorlatend plakband.
  10. Incubeer de platen verticaal in de groeikamer. Bedek eventueel de worteldelen met zwarte papieren dozen om wortels en door de grond overgedragen schimmel donkerder te maken (zie19).
  11. Voer de analyses uit op de gewenste tijdstippen na inenting, afhankelijk van de onderzoeksvraag (raadpleeg de figuurlegendes voor de exacte tijdspunten die hier worden gebruikt). Hieronder volgen enkele suggesties.
    1. Snijd de bladeren van de wortels en oogst beide afzonderlijk. Haal de agar-strips uit de petrischaaltjes om gemakkelijk bij de wortels te komen en trek ze voorzichtig uit de agar met een tang. Vries al het plantmateriaal onmiddellijk in vloeibare stikstof.
      1. Maal de monsters in vloeibare stikstof. Extraheer totaal DNA uit 100 mg bladmateriaal om via een kwantitatieve PCR (qPCR) de hoeveelheid schimmel-DNA ten opzichte van planten-DNA te bepalen (zie19).
      2. Maal de monsters in vloeibare stikstof. Neem 100 mg plantaardig materiaal en extraheer totaal RNA. Voer kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR) uit om de expressie van plantengenen (of schimmelgenen) tijdens besmetting te bepalen (zie19).
    2. Verwijder voorzichtig de wortels van de agar om letsel te voorkomen en onderzoek ze onder de fluorescerende microscoop.
      1. Bepaal de inductie van markergenen in plantenreporterlijnen (bijv. Luciferase, β-glucuronidase of fluorescerende reporters 17,19,21).
      2. Visualiseer schimmelvoortplanting bij de wortel door gebruik te maken van schimmelreporterlijnen (bijv. V. longisporum constitutief tot expressie van verbeterd groen fluorescerend eiwit, Vl-sGFP 9) of door kleuringstechnieken (bijvoorbeeld door middel van 5-broom-4-chloor-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminide (X-beta-D-Glc-Nac)18).

5. Een steriel in vitro inentingssysteem georganiseerd met plastic bekers

OPMERKING: Zoals vermeld in de eerste beschrijving van deze techniek19, moet u ervoor zorgen dat alle apparatuur en media kiemvrij zijn en dat alle stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap.

  1. Gebruik transparante plastic bekers met een totaal volume van 500 ml en steriliseer ze in een 70% -75% ethanolbad gedurende ten minste 20 minuten. Droog de cups in de laminaire flowkap.
  2. Giet het medium met autoclaaf (zie stap 1.4) in de plastic bekers. Voeg eventueel cefotaxime (eindconcentratie van 50 mg/l) toe aan het geautoclaveerde medium om bacteriële besmettingen te voorkomen. Gebruik 150 ml medium per kopje voor experimenten met Arabidopsis of meer medium (250-300 ml per kopje) voor experimenten met grotere plantensoorten (koolzaad, tomaat).
  3. Plaats een plastic laag (eerder gesteriliseerd door gedurende 20 minuten in 70%-75% ethanol te broeden) op het medium voordat het stolt (figuur 1B).
    OPMERKING: Deze plastic laag bevat vier geprefabriceerde gaten op de hoeken voor het plaatsen van oppervlakte-gesteriliseerde zaden. Hierdoor hebben de zaden toegang tot het medium. Later voorkomt deze scheidingslaag dat de bladeren het schimmelbevattende medium raken, zodat de microben de bladeren niet direct kunnen aanvallen en het wortelpad moeten nemen. Een ander gat bevindt zich in het midden, waardoor het infectiekanaal kan worden doorgesneden.
  4. Wanneer het medium is gestold, snijdt u de agar met een scalpel door het geprefabriceerde middengat tot een diepte van ongeveer 1,5 cm. Verwijder de gesneden agar om een infectiekanaal te creëren waarin de schimmelsporen later kunnen worden toegevoegd.
  5. Krab het agarmedium enigszins met een pipetpunt in de vier kleinere gaten om de gestolde huid te onderbreken (hierdoor kunnen de zaden water opnemen uit het waterige agarmedium). Plaats de zaadjes met een pipetpunt in de kleinere gaatjes.
  6. Sluit de plastic beker met een tweede, omgekeerde plastic beker en sluit af met luchtdoorlatend plakband. De tape moet gasuitwisseling mogelijk maken.
  7. Na stratificatie gedurende 3 dagen in het donker bij 4 °C, incubeer de bekersystemen onder 12 uur licht / 12 uur duisternis (Arabidopsis, koolzaad) of 16 uur licht / 8 uur duisternis (tomaat) in groeikamers bij een constante temperatuur van 22 ° C en 60% vochtigheid.
  8. Volg de aanbevolen leeftijd van planten voor inenting: 21 dagen voor Arabidopsis; 5-7 dagen voor koolzaad; 12 dagen voor tomaat.
  9. Ent planten met Verticillium door 1 ml conidia-oplossing (aanbevolen concentratie: 4 x 105 sporen/ml) toe te voegen aan het infectiekanaal. Om controlemonsters te bereiden, voegt u 1 ml mock-oplossing zonder sporen (kiemvrij 1/4 MS-medium) toe aan het kanaal.
  10. Voer de analyses uit op de gewenste tijdstippen na inenting, afhankelijk van de onderzoeksvraag (raadpleeg de figuurlegendes voor de exacte tijdspunten die hier worden gebruikt). Hieronder volgen enkele suggesties.
    1. Maak foto's van de planten met een digitale camera van bovenaf en houd de afstand voor elke foto gelijk. Kwantificeer het bladoppervlak (bijvoorbeeld met ImageJ22 of BlattFlaeche17,19; gebruik de lengte van de cups om de schaal in te stellen) en vergelijk geïnfecteerde en controlegroepen. Categoriseer de ontwikkeling van ziektesymptomen (bijvoorbeeld kleinere, meer gelige of necrotische bladeren).
      OPMERKING: Als er stengels op Arabidopsis zijn, verwijder ze dan om betere foto's van de rozetten te krijgen.
    2. Verwijder de wortels en bepaal de biomassa (vers gewicht) van scheuten uit geïnfecteerde en controleer monsters door weging. Bepaal het relatieve verse gewicht19.
    3. Verzamel de monsters voor moleculaire analyses als volgt.
    4. Arabidopsis: Verwijder stengels als die er zijn. Snijd de rozetten aan de basis van de wortels. Zorg ervoor dat u al het wortelmateriaal uit het monster uitsluit en hele rozetten oogst. Combineer 4-5 rozetten van verschillende planten in één monster en vries het bladmateriaal in vloeibare stikstof in.
    5. Trek de wortels voorzichtig uit het medium met een tang, druk erop en dep ze met een papieren handdoek om agarresten te verwijderen en combineer 4-5 wortels van verschillende planten in één monster. Vries onmiddellijk in vloeibare stikstof.
    6. Koolzaad/tomaat: Snijd stengelsegmenten van de hypocotyl (bijv. 1 cm lang; neem altijd hetzelfde stengelgebied). Combineer materiaal van 4-5 planten in elk monster en vries het in vloeibare stikstof.
    7. Maal de monsters in vloeibare stikstof. Extraheer totaal DNA uit 100 mg van het blad- of stengelmateriaal om via qPCR de hoeveelheid schimmel-DNA ten opzichte van planten-DNA te bepalen (zie19).
    8. Maal de monsters in vloeibare stikstof, neem 100 mg plantaardig materiaal en extraheer totaal RNA. Voer qRT-PCR uit om de expressie van plantengenen (of schimmelgenen) bij besmetting te bepalen (zie19).

6. Een inentingssysteem op basis van de grond in potten

  1. Meng aarde en zand grondig in een volumetrische verhouding van 3:1 (grond: zand) om het substraat van de wortels te spoelen. Giet het mengsel in een autoclaafzak. Als het mengsel te droog is, voeg dan een geschikte hoeveelheid water toe en meng het door het substraat. Stoom bij 80 °C gedurende 20 minuten in een autoclaaf om microbiële besmettingen te minimaliseren.
    OPMERKING: Vermijd verhitting tot meer dan 80 °C, omdat dit de organische bodemvoedingsstoffen kan beïnvloeden.
  2. Vul potten met het grond-zandmengsel en breng ze over in trays. Voeg water toe aan de trays ongeveer 1/3 van de hoogte van een pot, zodat het grond-zandmengsel grondig doordrenkt raakt met water. Bovendien besproeit u het substraat met een spuitfles om natte startomstandigheden te garanderen.
  3. Zaai 3-4 zaden in elke pot (figuur 1C) en zorg ervoor dat de zaden voldoende afstand van elkaar hebben. Bewaar ze 3 dagen in het donker bij 4 °C voor stratificatie om de kieming te synchroniseren.
    OPMERKING: Kweek een overmaat aan planten vooraf, wat een selectie van planten van vergelijkbare grootte mogelijk maakt voor de inentingsexperimenten en afwijkingen als gevolg van individuele verschillen vermindert.
  4. Laat de zaailingen groeien onder lange dagomstandigheden (16 uur licht / 8 uur duisternis; constante temperatuur van 22 °C; 60% vochtigheid) met regelmatig water geven.
  5. Volg de aanbevolen leeftijd van planten voor inenting: 21 dagen voor Arabidopsis, 7 dagen voor koolzaad en 10 dagen voor tomaat. Kies planten van vergelijkbare grootte om de "worteldipinenting" uit te voeren 15,17,23,24. Haal de grond uit de potten en graaf de wortels voorzichtig uit.
  6. Was alleen de wortels voorzichtig in een waterreservoir en houd de rozetten uit het water. Incubeer de gewassen wortels gedurende 60 minuten in een petrischaaltje met de Verticillium-sporenoplossing (aanbevolen concentratie: 2 x 106 sporen/ml). Incubeer voor de niet-geïnfecteerde controlegroep de wortels gedurende 60 minuten in de mock-oplossing zonder sporen (kiemvrij 1/4 MS-medium).
  7. Bereid nieuwe potten voor met vochtige, met stoom gesteriliseerde grond (80 °C gedurende 20 min) zonder zand. Gebruik een pipetpunt om in elke pot één gat in het midden van de grond te maken.
  8. Plaats de wortels direct in het gat (breng slechts één plant per pot over). Zorg ervoor dat u na het inbrengen van de wortels de gaten voorzichtig bijvult met aarde. Vermijd het persen van de grond, anders kan verpotten stresssymptomen veroorzaken zoals paarse bladeren.
  9. Kweek geïnfecteerde en controlegroepen onder lange dagomstandigheden (16 uur licht / 8 uur donker; een constante temperatuur van 22 ° C; 60% vochtigheid) met regelmatig water geven.
  10. Voer de analyses uit op de gewenste tijdstippen na inenting, afhankelijk van de onderzoeksvraag (raadpleeg de figuurlegendes voor de exacte tijdspunten die hier worden gebruikt). Hieronder volgen enkele suggesties.
    1. Maak foto's van de planten met een digitale camera van bovenaf en houd de afstand voor elke foto gelijk. Kwantificeer het bladoppervlak (bijvoorbeeld met ImageJ22 of BlattFlaeche17,19; gebruik de diameter van de potten om de schaal in te stellen) en vergelijk geïnfecteerde en controlegroepen. Categoriseer de ontwikkeling van ziektesymptomen (bijvoorbeeld kleinere, meer gelige of necrotische bladeren)13.
      OPMERKING: Het verwijderen van stengels van Arabidopsis vergemakkelijkt het maken van foto's van de rozetten.
    2. Verwijder de wortels en bepaal de biomassa (vers gewicht) van scheuten uit geïnfecteerde en controleer monsters door weging. Bepaal het relatieve verse gewicht19.
    3. U kunt ook de planthoogte meten of schimmeluitgroei uit stengelsegmenten categoriseren om de ernst van de ziekte te evalueren13.
    4. Verzamel monsters voor moleculaire analyses als volgt.
    5. Arabidopsis: Verwijder de stengels. Snijd de rozetten bij de wortelkroon. Combineer 4-5 rozetten van verschillende planten in één monster. Vries het bladmateriaal in vloeibare stikstof in.
      OPMERKING: In het geval van wortels is het moeilijk om ze voldoende uit de grond te reinigen zonder genexpressie door wassen te herprogrammeren.
    6. Koolzaad/tomaat: Snijd stengelsegmenten van de hypocotyl (bijv. 1 cm lang; neem altijd hetzelfde stengelgebied). Combineer materiaal van 4-5 planten in één monster en vries het in vloeibare stikstof.
    7. Maal de monsters in vloeibare stikstof. Extraheer totaal DNA uit 100 mg blad- of stengelmateriaal om via qPCR de hoeveelheid schimmel-DNA ten opzichte van planten-DNA te bepalen (zie19).
    8. Maal de monsters in vloeibare stikstof, neem 100 mg plantaardig materiaal en extraheer totaal RNA. Voer qRT-PCR uit om de expressie van plantengenen (of schimmelgenen) bij besmetting te bepalen (zie19).

7. Analyseren van de gegevens

  1. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie (± SD) op basis van de biologische replicaties.
  2. Bereken de relatieve waarden door alle resultaten van de geïnfecteerde groep te delen door het resultaat van de controle. Geef het gemiddelde bijvoorbeeld weer als "ten opzichte van mock" of "relative to wild-type".
  3. Bepaal statistische significantie tussen groepen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Compilatie van de drie inentingssystemen en individuele stappen in de protocollen. Deze figuren illustreren de systemen met de modelplant Arabidopsis thaliana. Voor andere plantensoorten moet de timing worden aangepast. Oranje vakken markeren, waarvoor latere analyses het meest worden aanbevolen met het betreffende systeem. (A) Voor het inentingssysteem in petrischalen17, giet het medium en laat het stollen. Bewaar de borden een nacht in de koelkast. Snijd en verwijder vervolgens het bovenste derde deel en het infectiekanaal (IC) met een scalpel (witte gebieden in de illustratie werden verwijderd van de agar, terwijl blauwachtige gebieden de agar vertegenwoordigen). Leg de zaden op het snijvlak en sluit de petrischaaltjes. Plaats na de stratificatie de platen verticaal en laat de planten groeien. Zodra de meeste wortels het infectiekanaal hebben bereikt, voegt u de sporenoplossing met een pipet rechtstreeks in het kanaal toe. Zorg ervoor dat de oplossing gelijkmatig is verdeeld. Sluit de petrischaaltjes en incubeer ze verticaal in een groeikamer. Benaderingen die kunnen volgen zijn expressionele analyse met kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR), microscopie met reporterlijnen en kwantificering van microbieel DNA. (B) Voor het inentingssysteem in plastic bekers19, giet het medium en breng de scheidende plastic laag over met de geprefabriceerde gaten (vier kleine gaten in de hoeken voor het plaatsen van de zaden en een groot gat in het midden voor het infectiekanaal). Laat het medium stollen. Snijd en verwijder het agarmedium in het middelste gat met een scalpel om het infectiekanaal (IC) te verkrijgen. Krab het medium in de kleinere gaatjes en breng de zaden over. Sluit de beker met een omgekeerde beker en sluit af met luchtdoorlatende tape (gesymboliseerd in geel). Laat de planten groeien. Voeg voor inenting de sporenoplossing met een pipet rechtstreeks in het infectiekanaal toe. Sluit het systeem en ga verder met de teelt in de groeikamer. Benaderingen die kunnen volgen zijn expressionele analyse met qRT-PCR, kwantificering van microbieel DNA en bepaling van vers gewicht, bladoppervlak of andere ziektekenmerken. (C) "Worteldipinenting"15,17,23,24: voor het inentingssysteem op de bodem, potten vullen met een mengsel grond:zand. Breng de zaden over en laat de zaailingen groeien. Graaf planten van vergelijkbare grootte en was de wortels in water. Leg de gewassen wortels in een petrischaaltje met de oplossing met de sporen. Plaats na incubatie enkele planten in potten met aarde. Benaderingen die kunnen volgen zijn expressionele analyse in bladeren met qRT-PCR, kwantificering van microbieel DNA en bepaling van vers gewicht, bladoppervlak of andere ziektekenmerken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens het protocol werden de planten gekweekt en ingeënt met V. longisporum (stam Vl4325) of V. dahliae (isolaat JR218). Verschillende scenario's werden ontworpen om de effectiviteit te bewijzen en om enkele mogelijkheden van de gegeven protocollen te benadrukken. Representatieve uitkomsten worden getoond.

Expressionele inductie van genen die betrokken zijn bij de antimicrobiële indol-glucosinolaat (IG) biosynthese is...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege de enorme opbrengstverliezen veroorzaakt door fytopathogenen in de bodem1, is een verbetering van landbouwstrategieën of gewasvariëteiten vereist. Het beperkte inzicht in de pathogenese van bodemziekten belemmert de ontwikkeling van resistentere planten. Onderliggende pathomechanismen moeten worden onderzocht, waarvoor een robuust methodologisch platform nodig is. Gerapporteerde inentingsprocedures hebben aangetoond dat multifactoriële gebeurtenissen in wortel-microbe interacties goed kunn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen Tim Iven en Jaqueline Komorek voor eerder werk aan deze methoden, de groep van Wolfgang Dröge-Laser (Afdeling Farmaceutische Biologie, Universiteit van Würzburg, Duitsland) voor het leveren van de apparatuur en de middelen die nodig zijn voor dit werk, en Wolfgang Dröge-Laser evenals Philipp Kreisz (beide Universiteit van Würzburg) voor kritische proeflezing van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar (Gelrite)Carl RothNr. 0039alle systemen die hier worden beschreven vereisen Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-typeNASC stockCol-0 (N1092)
AutoclaafSystecVE-100
BlattFlaecheDatinf GmbHBlattFlaechesoftware om bladoppervlakten te bepalen
Brassica napus wild-typezie Floerl et al., 2008rapid-cycling rapegenoom ACaacc
Cefotaxime natriumDuchefaC0111
Chicanery-kolf 500 mLDuran Group / neoLabE-1090Erlenmeyerkolf met vier ribbels
Verzamelbuizen 50 mLSarstedt62.547.254114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth mediumDuchefaC1714
Digitale cameraNikonD3100 18-55 VR
Exsiccator (droogkast)Duran Group200 DN, 5,8 LAfdichting met deksel om chloorgas vast te houden
FluorescentiemicroscoopLeicaLeica TCS SP5 II
HClCarl RothP074.3
KNO3Carl RothP021.1≥ 99 %
KOHCarl Roth6751
LeukoporBSN medical GmbH2454-00 APniet-geweven tape 2,5 cm x 9,2 m
MES (2-(N-morfolino)ethansulfonzuur)Carl Roth4256.2Puffer ≥ 99 %
MgSO4Carl RothT888.1Magnesiumsulfaat-Heptahydraat
Murashige & Skoog medium (MS)DuchefaM0222MS inclusief vitaminen
NaClOCarl Roth9062.1
Percival groeikamersCLF Plant Climatics GmbHAR-66L2
Petri-schalenSarstedt82.1473.001grootte ØxH: 92 × 16 mm
Kunststofbekers (500 mL, transparant)Pro-pac, salad boxx5070afmetingen: 108 × 81 × 102 mm
Geplooide cellulosefilterHartensteinFF12deeltjesretentieniveau 8–12 μm
poly klima-groeikamerpoly klima GmbHPK 520 WLED
Aardappel Dextrose Broth mediumSIGMA AldrichP6685voor microbiologie
PottenPöppelmann GmbHTO 7 D of TO 9,5 DØ 7 cm respectievelijk Ø 9,5 cm
PromMYB51::YFPzie Poncini et al., 2017MYB51 reporterlijnYFP (dwz 3xmVenus met NLS)
Reactiebuisjes 2 mLSarstedt72.695.400PCR Prestatie getest
Roterende (orbitale) shakerEdmund BühlerSM 30 C control
Zand (vogelzand)Pet Bistro, Müller Holding786157
AardeEinheitserde spezialSP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-typezie Chavarro-Carrero et al., 2021Type: Moneymaker
Thoma celtellingkamerMarienfeld642710diepte 0,020 mm; 0,0025 mm2
Ultrapuur water (Milli-Q gezuiverd water)MERKIQ 7003/7005water verkregen na zuivering
Verticillium dahliaezie Reusche et al., 2014isolaat JR2
Verticillium longisporumZeise en von Tiedemann, 2002stam Vl43

Referenties

  1. Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
  2. Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97(2013).
  3. Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
  4. Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
  5. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156(2018).
  6. Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
  7. Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988(2021).
  8. Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
  9. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  10. Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129(2008).
  11. Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876(2020).
  12. Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
  13. Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
  14. Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
  15. Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
  16. Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
  17. Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
  18. Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
  19. Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57(2021).
  20. Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
  21. Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
  24. Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
  25. Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
  26. Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
  27. Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
  28. Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
  29. Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
  30. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Wortelinoculatieinfectie van plantenwortelsinteracties tussen wortels en microbenVerticillium-soortenpathogeniteitsassaysexpressie van markergenenArabidopsis thalianabodemgebaseerd systeeminoculatie door wortelonderdompeling
Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.