Method Article

Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

DOI:

10.3791/63448

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we twee modificaties van de DNA-vezeltest om enkelstrengs DNA-hiaten te onderzoeken bij het repliceren van DNA na laesie-inductie. De S1-vezeltest maakt de detectie van post-replicatieve hiaten mogelijk met behulp van het ssDNA-specifieke S1-endonuclease, terwijl de gap-filling assay visualisatie en kwantificering van gap repair mogelijk maakt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De DNA-vezeltest is een eenvoudige en robuuste methode voor de analyse van replicatievorkdynamica, gebaseerd op de immunodetectie van nucleotide-analogen die worden opgenomen tijdens DNA-synthese in menselijke cellen. Deze techniek heeft echter een beperkte resolutie van een paar duizend kilobases. Bijgevolg zijn post-replicatieve enkelstrengs DNA (ssDNA) gaten zo klein als een paar honderd basen niet detecteerbaar door de standaardtest. Hier beschrijven we een gemodificeerde versie van de DNA-vezeltest die gebruik maakt van de S1-nuclease, een enzym dat specifiek ssDNA splitst. In aanwezigheid van post-replicatieve ssDNA-openingen zal het S1-nuclease de openingen richten en splitsen, waardoor kortere tracties worden gegenereerd die kunnen worden gebruikt als uitlezing voor ssDNA-hiaten op lopende vorken. Deze post-replicatieve ssDNA-hiaten worden gevormd wanneer beschadigd DNA continu wordt gerepliceerd. Ze kunnen worden gerepareerd via mechanismen die zijn losgekoppeld van genoomreplicatie, in een proces dat bekend staat als gap-filling of post-replicative repair. Omdat gap-filling mechanismen DNA-synthese onafhankelijk van de S-fase omvatten, kunnen wijzigingen in het DNA-vezeletiketteringsschema ook worden gebruikt om gap-filling events te monitoren. Al met al zijn deze modificaties van de DNA-vezeltest krachtige strategieën om te begrijpen hoe post-replicatieve hiaten worden gevormd en opgevuld in het genoom van menselijke cellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Baanbrekende werken hebben bewijs geleverd van de accumulatie van post-replicatieve enkelstrengs (ssDNA) hiaten bij behandeling met DNA-schadelijke stoffen in bacteriën1 en menselijke cellen 2,3. Tijdens de replicatie van beschadigde DNA-sjablonen kan de DNA-synthesemachine de laesies omzeilen door gebruik te maken van specifieke translesiesynthese DNA-polymerasen of door sjabloonschakelmechanismen. Als alternatief kan het replisoom ook gewoon de laesie overslaan en een ssDNA-opening achterlaten, om later te worden gerepareerd. Meer recent toonde een studie duidelijk aan dat behandeling....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omdat de studie menselijke cellen gebruikt, werd het werk goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituut voor Biomedische Wetenschappen aan de Universiteit van São Paulo (ICB-USP, goedkeuringsnummer # 48347515.3.00005467) voor het onderzoek met menselijke monsters.

OPMERKING: De hier beschreven protocollen werden gebruikt in eerdere publicaties met kleine wijzigingen 14,16,28. Hier ligt de focus op het gebruik van ultraviolet licht C (UVC) als DNA-beschadigend middel. Andere DNA-schadelijke stoffen zoals cisplatine en hydroxyurea zijn ech....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de S1 Fiber-assay, als behandeling met een genotoxisch middel leidt tot post-replicatieve ssDNA-hiaten, zullen de totale lengtes van DNA-vezels uit met S1 behandelde kernen korter zijn bij behandeling met DNA-schade in vergelijking met onbehandelde monsters en monsters die werden behandeld met het genotoxische middel, maar niet werden onderworpen aan S1-splitsing (figuur 1).

Als alternatief, als behandeling met het S1-nuclease de lengte van DNA-vezels in vergel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische stappen van het standaard DNA-vezeltestprotocol werden besproken in een eerdere publicatie32. Hier beschrijven we aangepaste versies van de standaard DNA-vezeltest om de aanwezigheid van postreplicerende ssDNA-hiaten te onderzoeken, evenals hun reparatie door het vullen van gaten, aanvankelijk beschreven in14. In de context van post-replicatieve ssDNA gap aanwezigheid, zou het gebruik van de S1-nuclease in het S1 Fiber-protocol hoogstwaarschijnlijk geschikt zijn n.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in het C.F.M.M.-laboratorium wordt ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brazilië, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 en 2017/05680-0) in het kader van het International Collaboration Research van FAPESP en de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO, Nederland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazilië, Grants # 308868/2018-8] en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazilië, Finance Code 001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid, GlacialSynth64-19-7Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxideSynth1336-21-6Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-
Antibody Mouse anti-BrdUBecton Disckson347580-
Antibody Rat anti-BrdUAbcam Ab6326-
Biological security hoodPachanePA 410Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma-AldrichA3294Or similar
Cell scraperThermo Scientific179693Or similar
CldUMillipore-SigmaC6891-
Cloridric acidSynth7647-01-0Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)Zeiss-Or similar
Cover glass (or coverslips)Thermo Scientific152460Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High GlucoseLGC/GibcoBR30211-05/12100046Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)Sigma-AldrichE5314Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200Zeiss-Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco12657-029Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific 311013-998-074Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jarSigma-AldrichS5516Or similar
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5Or similar
IduMillipore-SigmaI7125-
Magnesium ChlorideSynth7791-18-6Or similar
MethanolMerck67-56-1Or similar
Microscope slidesDenvilleM1021Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico)Synth1132-61-2Or similar
NocodazoleSigma-Aldrich31430-18-9-
PBS (Phosphate Buffer Saline)Life Thechnologies3002Or similar
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Or similar
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzaeInvitrogen18001-016Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)BioRad161-0302Or similar
Sodium Acetate TrihydrateSigma-Aldrich6131-90-4Or similar
Sodium ChlorideSynth 7647-14-5Or similar
SucroseSigma-Aldrich57-50-1Or similar
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1Or similar
Triton X-100Synth9002-93-1Or similar
TrypsinGibco25200072Or similar
Tween 20Sigma-AldrichP1379Or similar
UVC LampNon Specific-Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV RadiometerVilber Loumart-Or similar
Zinc AcetateSigma-Aldrich557-34-6Or similar

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Fiber AssayReplication Fork DynamicsPost Replicative GapsS1 NucleaseSingle Stranded DNAGap Filling AssayDNA Replication StressGenome IntegrityImmunodetection MethodDNA Damage Repair

Related Articles