Method Article

Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

DOI:

10.3791/63448

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we twee modificaties van de DNA-vezeltest om enkelstrengs DNA-hiaten te onderzoeken bij het repliceren van DNA na laesie-inductie. De S1-vezeltest maakt de detectie van post-replicatieve hiaten mogelijk met behulp van het ssDNA-specifieke S1-endonuclease, terwijl de gap-filling assay visualisatie en kwantificering van gap repair mogelijk maakt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De DNA-vezeltest is een eenvoudige en robuuste methode voor de analyse van replicatievorkdynamica, gebaseerd op de immunodetectie van nucleotide-analogen die worden opgenomen tijdens DNA-synthese in menselijke cellen. Deze techniek heeft echter een beperkte resolutie van een paar duizend kilobases. Bijgevolg zijn post-replicatieve enkelstrengs DNA (ssDNA) gaten zo klein als een paar honderd basen niet detecteerbaar door de standaardtest. Hier beschrijven we een gemodificeerde versie van de DNA-vezeltest die gebruik maakt van de S1-nuclease, een enzym dat specifiek ssDNA splitst. In aanwezigheid van post-replicatieve ssDNA-openingen zal het S1-nuclease de openingen richten en splitsen, waardoor kortere tracties worden gegenereerd die kunnen worden gebruikt als uitlezing voor ssDNA-hiaten op lopende vorken. Deze post-replicatieve ssDNA-hiaten worden gevormd wanneer beschadigd DNA continu wordt gerepliceerd. Ze kunnen worden gerepareerd via mechanismen die zijn losgekoppeld van genoomreplicatie, in een proces dat bekend staat als gap-filling of post-replicative repair. Omdat gap-filling mechanismen DNA-synthese onafhankelijk van de S-fase omvatten, kunnen wijzigingen in het DNA-vezeletiketteringsschema ook worden gebruikt om gap-filling events te monitoren. Al met al zijn deze modificaties van de DNA-vezeltest krachtige strategieën om te begrijpen hoe post-replicatieve hiaten worden gevormd en opgevuld in het genoom van menselijke cellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Baanbrekende werken hebben bewijs geleverd van de accumulatie van post-replicatieve enkelstrengs (ssDNA) hiaten bij behandeling met DNA-schadelijke stoffen in bacteriën1 en menselijke cellen 2,3. Tijdens de replicatie van beschadigde DNA-sjablonen kan de DNA-synthesemachine de laesies omzeilen door gebruik te maken van specifieke translesiesynthese DNA-polymerasen of door sjabloonschakelmechanismen. Als alternatief kan het replisoom ook gewoon de laesie overslaan en een ssDNA-opening achterlaten, om later te worden gerepareerd. Meer recent toonde een studie duidelijk aan dat behandeling met genotoxische middelen leidt tot ssDNA-hiaten in eukaryoten door gebruik te maken van elektronenmicroscopie om de specifieke structuur van replicatietussenproducten te visualiseren4. De vorming van deze gebieden van post-replicatieve hiaten werd aanvankelijk voorgesteld als een eenvoudig resultaat van de semi-discontinue modus van DNA-replicatie2. In dit geval kan een laesie op de achterblijvende streng de verlenging van een Okazaki-fragment blokkeren, maar vorkprogressie wordt op natuurlijke wijze gered door het volgende Okazaki-fragment, waardoor een ssDNA-opening achterblijft. Verdere studies toonden echter aan dat de vorming van gaten op de leidende streng ook mogelijk is, zoals voor het eerst aangetoond bij bacteriën5. In eukaryoten bleek PRIMPOL, een uniek DNA-polymerase met primase-activiteit, in staat om de DNA-synthese stroomafwaarts van een replicatieblokkerende laesie te herstarten door zijn repriming-activiteit 6,7,8,9,10,11. De PRIMPOL primase-activiteit kan dus de vorming van postreplicerende ssDNA-hiaten in de leidende streng verklaren bij behandeling met een DNA-beschadigend middel in menselijke cellen12. Niettemin vereiste de detectie van deze hiaten en het repareren van spleten tot voor kort indirecte of tijdrovende benaderingen zoals elektronenmicroscopie4 of op plasmide gebaseerde assays13. Het gebruik van het ssDNA-specifieke S1-nuclease om hiaten in menselijke cellen te detecteren, werd meer dan veertig jaar geleden gepionierd door vroege studies, met behulp van sucrosegradiënttechnieken 2,3. Meer recent heeft onze groep het gebruik van dit nuclease toegepast om ssDNA te detecteren bij het repliceren van DNA (post-replicatieve hiaten) met behulp van andere methoden zoals DNA-vezel en komeettests14. Deze nieuwe benaderingen maakten de weg vrij voor de huidige golf van studies over post-replicatieve hiaten. Hier beschrijven we een strategie van het gebruik van S1-nuclease om postreplicatieve ssDNA-hiaten te detecteren door DNA-vezeltest en leggen we uit hoe een differentieel etiketteringsschema in het DNA-vezelprotocol de studie van de reparatie van deze hiaten mogelijk kan maken.

De DNA-vezeltest is een krachtige techniek die door een groeiend aantal laboratoria is gebruikt en waardevolle inzichten heeft opgeleverd in replicatievorkdynamiek en replicatiestressresponsmechanismen. In het kort is deze techniek gebaseerd op de sequentiële opname van nucleotide-analogen (zoals CldU -5-chloor-2'-deoxyuridine- en IdU -5-jood-2'-deoxyuridine) in het replicerende DNA. Na het oogsten worden cellen gelyseerd en verspreiden DNA-moleculen zich op een positief gecoate glazen dia. CldU en IdU worden vervolgens gedetecteerd door specifieke antilichamen, die in een fluorescerende microscoop kunnen worden gevisualiseerd als tweekleurige vezels. Ten slotte worden de lengtes van de IdU- en CldU-kanalen gemeten om eventuele veranderingen in de DNA-replicatiedynamiek als gevolg van DNA-schade-inductie te identificeren. Deze techniek kan worden gebruikt om verschillende verschijnselen te onderzoeken, zoals vork stalling, vorkvertraging, ontluikende DNA-afbraak en variaties in de frequentie van oorsprong die wordt afgevuurd15,16.

Een beperking van de DNA-vezeltest is de resolutie van een paar kilobases. Omdat post-replicatieve ssDNA-hiaten zich in het bereik van honderden basen kunnen bevinden, is het onmogelijk om deze hiaten rechtstreeks te visualiseren met het standaard DNA-vezelprotocol. De aanwezigheid van ssDNA-hiaten bij het repliceren van DNA in menselijke cellen die zijn behandeld met genotoxische middelen is eerder indirect betrokken geweest. Bijvoorbeeld, de observatie van ssDNA zoals beoordeeld door rekrutering van het ssDNA-bindende eiwit, replicatie-eiwit A (RPA), in cellen buiten de S-fase, of de vorming van ssDNA zoals gedetecteerd door alkalische DNA-afwikkeling in combinatie met de afwezigheid van langdurige vorkblokkering door DNA-vezeltest 12,17,18,19,20,21 werd toegeschreven aan de accumulatie van ssDNA-hiaten. Bovendien induceren postreplicatieve ssDNA-hiaten een ATR-afhankelijk G2 / M-fasecontrolepunt en arresteren cellen behandeld met replicatiegif 18,19,20,21,22.

Het S1-nuclease degradeert enkelstrengs nucleïnezuren die 5'-fosforylmono- of oligonucleotiden afgeven en heeft een 5-keer hogere affiniteit met ssDNA in vergelijking met RNA. Dubbelstrengs nucleïnezuren (DNA:DNA, DNA:RNA of RNA:RNA) zijn resistent tegen het S1-nuclease, behalve wanneer ze in extreem hoge concentraties worden gebruikt. De S1-nuclease splijt ook dubbelstrengs DNA in het enkelstrengsgebied veroorzaakt door een nick, gap, mismatch of lus. Het S1-nuclease is dus een ssDNA-specifiek endonuclease dat in staat is om ssDNA-openingen te splijten, waardoor uiteindelijk dubbelstrengsbreukenvan 23,24 worden gegenereerd. Het toevoegen van stappen voor S1-nucleasevertering aan het DNA-vezelprotocol maakt dus indirect de detectie van postreplicatieve ssDNA-hiaten mogelijk. In aanwezigheid van hiaten zal de behandeling van blootgestelde kernen met het S1-nuclease voorafgaand aan DNA-verspreiding kortere kanalen genereren als gevolg van S1-splitsing van ssDNA die inherent aanwezig is bij hiaten14. Dienovereenkomstig is traktaatverkorting de uitlezing voor ssDNA-hiaten met behulp van deze aanpak. In vergelijking met het standaard DNA-vezelprotocol vereist de DNA-vezel met het S1-nuclease slechts twee extra stappen: blootstelling aan kernen (celpermeabilisatie) en behandeling met het S1-nuclease. Het is belangrijk op te merken dat passende controles verplicht zijn, zoals monsters die zijn behandeld met het genotoxische middel maar zonder het S1-nuclease en monsters die zijn behandeld met het S1-nuclease zonder het genotoxische middel. Het protocol zelf, inclusief de integratie van analogen, S1-behandeling en verspreiding, kan in één dag worden uitgevoerd en vereist geen uitzonderlijk materiaal. Het vereist alleen de thymidine-analogen, het gezuiverde S1-nuclease, de juiste primaire en secundaire antilichamen en een fluorescerende microscoop. Over het algemeen detecteert de DNA-vezel die de S1-nuclease gebruikt ssDNA-hiaten op lopende replicatievorken met behulp van een relatief eenvoudige aanpak.

De postreplicatieve ssDNA-hiaten die zijn gevormd als gevolg van replicatiestressresponsmechanismen kunnen worden gerepareerd (of opgevuld) door verschillende mechanismen, waaronder translesie-DNA-synthese of sjabloonschakeling, in een proces dat gap-filling of post-replication repair (PRR)25 wordt genoemd. Deze processen vinden plaats achter de voortschrijdende vorken, waarbij replicatie-onafhankelijke DNA-synthese 14,26,27 betrokken is. Op basis van deze bevindingen kan een etiketteringsschema worden uitgevoerd dat verschilt van de standaard DNA-vezeltest om gap-filling events in de G2-fase directte visualiseren 14,16,26,28. In het bijzonder kan één thymidine-analoog worden gebruikt om de replicatievork te labelen op het moment van genotoxische behandeling en postreplicatieve ssDNA-gapvorming, terwijl een ander thymidine-analoog kan worden gebruikt om gap-filling events te labelen. In dit protocol worden cellen gelabeld met een eerste thymidine-analoog (IdU, bijvoorbeeld) onmiddellijk na of gelijktijdig met genotoxische behandeling gedurende 1 uur, zodat het ontluikende DNA wordt gelabeld op het moment van gap-vorming. Nocodazol wordt toegevoegd na behandeling gedurende ergens tussen 12-24 uur om cellen in G2 / M te stoppen, waardoor de volgende S-fase wordt voorkomen. Voor de laatste 4 uur nocodazolbehandeling wordt een tweede thymidine-analoog (CldU, bijvoorbeeld) toegevoegd aan de media om te worden opgenomen tijdens het vullen van gaten. Belangrijk is dat deze test alleen kan worden gebruikt om gap-filling events in G2 te detecteren, omdat het gap-filling signaal van CldU niet kan worden onderscheiden van een signaal als gevolg van CldU-integratie in replicerend DNA in de S-fase. Daarom, om het achtergrondsignaal te minimaliseren, moet de timing van CldU-opname na schade-inductie samenvallen met wanneer het grootste deel van de celpopulatie de G2-fase14 binnengaat. Daarom zal deze timing variëren afhankelijk van de cellijn en de behandelingsomstandigheden. Het optimaliseren van de progressie van de celcyclus voorafgaand aan het gebruik van deze test wordt geadviseerd. Co-kleuring van deze thymidine-analogen maakt de visualisatie mogelijk van gap-filling (PRR) tracts (CldU-patches) bovenop ontluikend DNA (IdU-kanalen) gesynthetiseerd tijdens de genotoxische behandeling wanneer ssDNA-hiaten werden gegenereerd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omdat de studie menselijke cellen gebruikt, werd het werk goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituut voor Biomedische Wetenschappen aan de Universiteit van São Paulo (ICB-USP, goedkeuringsnummer # 48347515.3.00005467) voor het onderzoek met menselijke monsters.

OPMERKING: De hier beschreven protocollen werden gebruikt in eerdere publicaties met kleine wijzigingen 14,16,28. Hier ligt de focus op het gebruik van ultraviolet licht C (UVC) als DNA-beschadigend middel. Andere DNA-schadelijke stoffen zoals cisplatine en hydroxyurea zijn echter ook met succes gebruikt28. Dit protocol kan worden uitgevoerd in een reeks cellijnen, waaronder U2OS, HEK293T, menselijke fibroblasten en andere 14,28,29. Het is essentieel om de experimentele vraag te bepalen voordat dit protocol wordt uitgevoerd. De DNA-vezeltest met het S1-nuclease (hierna S1 Fiber genoemd) wordt gebruikt om de aanwezigheid van postreplicerende ssDNA-hiaten te detecteren, terwijl de gap-filling (of PRR) assay wordt uitgevoerd om gap-filling events in de G2-fase te kwantificeren. Dus, als de aanwezigheid van post-replicatieve ssDNA-hiaten wordt geanalyseerd, moet de onderzoeker sectie 2 (S1 Fiber experimentele opstelling) uitvoeren en direct doorgaan naar sectie 4 (DNA-vezelvoorbereiding door verspreiding) van het protocol. Bij het analyseren van gap-filling events moet de onderzoeker direct overgaan tot sectie 3 (Gap-filling (PRR) experimental setup).

1. Reagentia en setup

  1. Thymidine-analogen: Resuspendeer 5-Jood-2'-deoxyuridine (IdU) en 5-Chloor-2'-deoxyuridine (CldU) in 1 N NH4OH tot een eindconcentratie van 100 mM. Filtreer de analogen door een steriel spuitfilter (0,2 μm), aliquot, en bewaar ze bij -20 C.
  2. Antilichamen: Primaries - anti-BrdU rat (Biorad) en anti-BrdU muis (BD); Secondaries - anti-rat Alexa Fluor 488 en anti-muis Alexa Fluor 594.
  3. Cellulaire permeabilisatie CSK100 buffer voor de S1 Fiber: Voeg 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7,2], 300 mM sucrose en 0,5% Triton X-100 toe in gedestilleerd H2O.
  4. S1-nucleasebuffer [pH 4,6]: Voeg 30 mM natriumacetaat [pH 4,6], 10 mM zinkacetaat, 50 mM NaCl en 5% glycerol toe aan H2O.
    OPMERKING: De S1-nucleasebuffer moet een uiteindelijke pH van 4,6 hebben, omdat de S1-activiteit met 50% daalt bij een pH > 4,9.
  5. Aliquot en bewaar bij -20 °C het S1-nuclease gezuiverd van A. oryzae , voorverwaterd in de door de fabrikant verstrekte S1-nucleaseverdunningsbuffer.
  6. Reconstitueer het nocodazol in DMSO tot een eindconcentratie van 2 mM voor het vullen van gaten. Test.
  7. Lysisbuffer: Voeg 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA en 0,5 % SDS toe in H2O.
  8. Bereid fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  9. Bereid PBS-T voor door 0,1% Tween-20 in PBS toe te voegen.
  10. Bereid 5% Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS.
  11. Bereid 0,1% BSA in PBS.
  12. Bereid PBS-T-BSA voor door 1% BSA toe te voegen aan PBS-T.
    OPMERKING: Gebruik een epifluorescente microscoop met een kwik- of xenonlamp met een 510 nm golflengte en 42 nm bandbreedte GFP (FITC, Alexa Fluor 488) emissiefilter en een 624 nm golflengte en 40 nm bandbreedte Texas Red (Alexa Fluor 594) emissiefilter of een confocale microscoop met een 488-nm lijn (blauwe) laser om groene fluorescentie te detecteren (gedetecteerd tussen 510 en 560 nm) en een 561-nm lijn (gele) laser om rode fluorescentie te detecteren ( gedetecteerd tussen 575 en 680 nm). Onderdompelingsobjectief (40x, 63x of 100x).

2. S1 Fiber experimentele setup (2 dagen)

  1. Dag 1: Plaat 4 putten voor elke cellijn: ± UVC en ± S1-nuclease met cellen op 70-90% samenvloeiing.
    OPMERKING: Het experiment kan worden uitgevoerd in een formaat zo klein als een 12-well plaat. In dit geval worden alle oplossingen gebruikt bij 0,5 ml / put.
  2. Dag 2: Bereid verse IdU op 20 μM en CldU op 200 μM in voorverwarmde (37 °C) celkweekmedia.
  3. Adem de kweekmedia op en voeg onmiddellijk de media toe met 20 μM IdU en incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 (celincubator) gedurende precies 20 minuten.
  4. Was de cellen snel met voorverwarmd (37 °C) PBS tweemaal.
  5. Bestraal de cellen met 20 J/m2 UVC. Gebruik onbehandelde cellen als besturingselementen.
  6. Voeg onmiddellijk de media met 200 μM CldU toe en incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 (celincubator) gedurende precies 60 minuten.
    OPMERKING: IdU- en CldU-etikettering kan worden uitgewisseld, maar de concentratie van het tweede analoog moet 5-10 keer hoger zijn dan het eerste analoge. De timing van de analoge incubatie kan worden aangepast aan het gebruikte genotoxische middel, maar de tijd van de tweede analoge incubatie moet lang genoeg zijn om voldoende tijd voor gap-vormingte garanderen 14,16. Als u een DNA-beschadigend medicijn gebruikt, voeg het medicijn dan samen met CldU 28,29,30 toe.
  7. Was de cellen tweemaal met voorverwarmd (37 °C) PBS.
  8. Permeabiliseer de cellen met de CSK100-buffer gedurende 8-10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: Succesvolle permeabilisatie kan worden gecontroleerd onder een brightfield-microscoop waar alleen kernen waarneembaar moeten zijn
  9. Was de kernen voorzichtig met PBS (giet 0,5 ml langs de zijkant van elke put, slechts enkele seconden).
  10. Was de kernen voorzichtig met S1-buffer (giet 0,5 ml langs de zijkant van elke put, slechts enkele seconden).
  11. Incubeer de kernen met S1-buffer met S1-nuclease (20 U/ml) of zonder (als controle) gedurende 30 minuten bij 37 °C (celincubator).
  12. Aspirateer de S1-buffer en voeg 0,1% BSA toe in PBS.
  13. Schraap de kernen en breng ze over in een goed geannoteerde buis van 1,5 ml. Houd buizen de hele tijd op ijs.
    OPMERKING: Succesvolle loslating van kernen kan worden gecontroleerd onder een brightfield microscoop.
  14. Pellet de kernen: centrifugeer bij ~4600 x g gedurende 5 min, bij 4 °C.
    OPMERKING: Anders dan de standaard DNA-vezeltest, kunnen de kernen niet worden geteld, dus overweeg het initiële aantal cellen dat is verguld. Als alternatief kan een extra put die niet is onderworpen aan permeabilisatie worden gebruikt om het celgetal te schatten met behulp van een hemocytometer of een celteller.
  15. Resuspendeer de pellets goed in PBS in een concentratie van ~1500 cellen/μL, plaats de buisjes op ijs en ga over tot DNA-vezelpreparatie door (sectie 4) protocol onmiddellijk te verspreiden

3. Gap-filling (PRR) experimentele setup (3 dagen)

  1. Dag 1: Plaat 2 putten voor elke cellijn: ± UVC met cellen op ~70% confluency.
  2. Dag 2: Bereid verse IdU op 20 μM in voorverwarmde (37 °C) celkweekmedia.
  3. Bestraal de cellen met 20 J/m2 UVC.
  4. Voeg onmiddellijk de media toe met 20 μM IdU en incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 (celincubator) gedurende precies 60 minuten.
  5. Was de cellen tweemaal met voorverwarmd (37 °C) PBS.
  6. Voeg onmiddellijk de media toe met 200 ng / ml nocodazol en incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 (celincubator) gedurende 12-24 uur (timing van deze stap moet consistent worden gehouden tussen experimenten).
    OPMERKING: De concentratie nocodazol moet mogelijk worden aangepast aan de gebruikte cellijn. Als u een genotoxisch geneesmiddel gebruikt, incubeer de cellen dan met IdU ± geneesmiddel28.
  7. Dag 3: Aspirateer de kweekmedia, voeg de media toe met 20 μM CldU + nocodazol en incubeer gedurende de laatste 4 uur nocodazolbehandeling, bij 37 °C, 5% CO2 (celincubator).
  8. Was de cellen met voorverwarmd (37 °C) PBS.
  9. Voeg trypsine toe en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 °C, 5% CO2 (celincubator) om cellen los te maken.
  10. Voeg hetzelfde volume celkweekmedia toe en verzamel cellen (media + trypsine) in een op de juiste manier geannoteerde buis van 1,5 ml. Houd de buizen de hele tijd op ijs.
  11. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een celteller.
  12. Pellet de cellen: centrifugeer bij ~350 x g gedurende 5 min, bij 4 °C.
  13. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in PBS op ~ 1500 cellen / μL. Houd de cellen op ijs en start de DNA-vezelvoorbereiding door het protocol onmiddellijk te verspreiden (dag 3 of 4).

4. DNA-vezelvoorbereiding door verspreiding (~ 1 uur voor 12 dia's)

  1. Annoteer de microscoopglaasjes met een carbonpotlood en leg ze plat op een dienblad.
  2. Tik op de onderkant van de buis om homogenisatie te garanderen.
  3. Voeg 2 μL cellen toe aan de bovenkant van de bijbehorende dia.
    OPMERKING: Er kunnen twee druppels worden toegevoegd, een aan de bovenkant van de dia en een andere in het midden van de dia.
  4. Voeg 6 μL van de lysisbuffer toe en laat de cellen ongeveer 5 keer op en neer pipetteren (vermijd het maken van bubbels).
  5. Trek de druppel een klein beetje naar de onderkant van de glijbaan met de pipetpunt (om het pad van de druppelverspreiding te begeleiden).
  6. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT om de kernen te lyseren.
    OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer en de tijd van lysis kunnen worden aangepast als het lysaat te snel droogt of, als alternatief, niet genoeg droogt. Het lysisbuffervolume kan variëren van 5-7 μL en de timing kan tussen 4-10 minuten vallen.
  7. Kantel de glijbaan op ongeveer 20-40° en laat de druppel zich met een constante, lage snelheid naar de bodem van de glijbaan verspreiden.
  8. Laat de glijbaan drogen bij RT in het donker (10-15 min).
  9. Bereid de fixatieoplossing vers voor: Meng methanol: ijsazijn in een verhouding van 3:1.
  10. Dompel de dia's onder in een pot met de bevestigingsoplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij RT om DNA op de dia's te bevestigen.
    LET OP: Methanol is zeer giftig en moet onder een chemische kap worden bewaard. Gooi weg in een geschikte container.
  11. Droog de dia's bij RT in het donker en bewaar bij 4 °C beschermd tegen licht totdat ze vlekken.

5. Immunostaining van DNA-vezels (~ 6 h)

  1. Was de dia's twee keer met PBS gedurende 5 minuten.
  2. Denatureer het DNA met vers bereide 2,5 M HCl gedurende 40-60 min bij RT.
    LET OP: Om 2,5 M HCl te bereiden, giet zuur in water en nooit het tegenovergestelde. Dit is een exotherme reactie waardoor het iets opwarmt.
  3. Was de dia's met PBS drie keer gedurende 5 minuten.
  4. Blok met 5% BSA (kan worden bewaard bij 20 °C voor maximaal drie toepassingen) eerder verwarmd bij 37 °C gedurende 30-60 min bij 37 °C.
  5. Verwijder de overtollige vloeistof uit dia's door zachtjes op een papier te tikken.
  6. Voeg 30 μL primaire antilichamen (muis anti-BrdU 1/20 (voor IdU) en rat anti-BrdU 1/100 (voor CldU) verdund in PBS-T-BSA) toe aan de dia's dropwise en plaats een coverslip bovenop. Incubeer gedurende 1-1,5 uur bij RT in een donkere, vochtige kamer.
  7. Plaats de dia's 1-2 minuten in een pot met PBS en verwijder vervolgens voorzichtig de coverslips.
  8. Was met PBS-T drie keer in een pot gedurende 5 minuten en plaats de dia's vervolgens in PBS.
  9. Verwijder de overtollige vloeistof door zachtjes op een papier te tikken.
  10. Voeg 30 μL secundaire antilichamen (anti-muis Alexa Fluor 594 en anti-rat Alexa Fluor 488 verdund op 1/75 in PBS-T-BSA.) toe aan de dia's dropwise en plaats een coverslip bovenop. Incubeer gedurende 45-60 minuten bij RT in een donkere, vochtige kamer.
  11. Plaats de dia's 1-2 minuten in een pot met PBS en verwijder vervolgens voorzichtig de coverslips.
  12. Was met PBS-T drie keer in een pot gedurende 5 minuten en plaats de dia's vervolgens in PBS.
  13. Verwijder de overtollige vloeistof door zachtjes op een papier te tikken.
  14. Voeg 20 μL van het montagereagens druppelsgewijs toe aan de dia's en leg er een deklip op. Vermijd bubbels.
  15. Laat de dia's drogen op RT in het donker en bewaar ze vervolgens bij 4 °C (of -20 °C voor een langere bewaring).

6. Beeldacquisitie en -analyse (~ 1 uur per monster)

OPMERKING: Voor beide protocollen kan een epifluorescentiemicroscoop worden gebruikt. Voor de gap-filling (PRR) assay wordt het gebruik van een confocale microscoop echter sterk aanbevolen voor de verhoogde resolutie van de beelden.

  1. Plaats een druppel dompelolie (microscoopspecifiek) in de buurt van de bovenkant van de dia waar de cellen zijn gelyseerd en vind de focus met behulp van het groene kanaal door groene stippen op de achtergrond te zoeken (40x, 63x en 100x doelstellingen kunnen worden gebruikt).
  2. Zoek de hoofdconcentratie van vezels en ga naar de randen om goed verspreide niet-overlappende individuele vezels te vinden met slechts één kanaal om de regio's voor de afbeeldingen te selecteren en mogelijke vertekening te voorkomen.
  3. Maak ongeveer 15-20 foto's per dia naast de hele dia op de groene en rode kanalen en voeg de twee kanalen samen om bicolor DNA-vezels te verkrijgen.
    OPMERKING: Als u een confocale microscoop gebruikt, maak dan foto's met een hoge resolutie (1024 x 1024 pixels) en gebruik pinhole-waarden in de buurt van 1 voor zowel rode als groene fluorescentie.
  4. Gebruik ImageJ (gratis software van de NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) voor IdU- en CldU-kanaallengtemetingen.
    1. Open een afbeelding door deze naar het vak ImageJ te slepen.
    2. Gebruik de schaalbalk die door de microscoopsoftware wordt gegenereerd (correct gekalibreerd) om de lengte om te zetten in micrometers. Gebruik het gereedschap Rechte lijn door het5e pictogram van links naar rechts in het vak ImageJ te selecteren om de schaalbalk in de verstrekte micrometers van de afbeelding te meten en een meting in pixels te verkrijgen. Klik op Analyseren > Schaal instellen en vervang de "afstand in pixels" door het juiste getal en de "lengte-eenheid" door μm.
    3. Selecteer in het vak ImageJ het gereedschap Gesegmenteerde lijn door met de linkermuisknop van links naar rechts ophet 5e pictogram te klikken en vervolgens de tweede optie van boven naar beneden te selecteren.
    4. Teken het exacte pad van het rode (IdU) of groene (CldU) traktaat door met de linkermuisknop te klikken en stop de tekening door met de rechtermuisknop te klikken. Druk op de M-knop op het toetsenbord om de lengte te meten.
    5. Analyseer voor de S1-vezel alleen rood-groen (tweekleurige vezels)16. Meet rode en groene traktaatlengtes van ten minste 150 vezels van verschillende foto's door de rode en groene traktaatmetingen voor elke individuele vezel bij te houden.
    6. Meet voor de gap-filling assay alleen de lengte van IdU (rode) kanalen die ten minste 1 CldU (groene) vlek bevatten, maar geen continue CldU-kleuring. Scoor minstens 10-15 IdU-traktaten van verschillende foto's met ten minste 1 CldU-patch.
      OPMERKING: Andere software kan worden gebruikt voor de analyses, zoals Zeiss LSM Image Browser.
  5. Voor de S1-vezels plott u de Lengte van de IdU-traktaten, de lengte van de CldU-traktaten en de verhoudingen (CldU / IdU of vice versa) in afzonderlijke afbeeldingen als scatter dot plots met medianen.
  6. Meet gap-filling events als eenheden van "per-kilobase density", deel het totale aantal CldU (PRR, groene) vlekken op een bepaalde lengte van IdU (rood) kanaal door de totale lengte van het rode kanaal in kilobases (uitgaande van 1 μm = 2,59 kilobases31). Plot vervolgens de gegevens als scatter dot plots met medianen.
  7. Voer in beide experimenten statistische analyse uit tussen twee monsters met behulp van Mann-Whitney (niet-parametrische test) en tussen meer dan twee monsters met Kruskal-Wallis, gevolgd door dunn's meervoudige vergelijkingstest.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de S1 Fiber-assay, als behandeling met een genotoxisch middel leidt tot post-replicatieve ssDNA-hiaten, zullen de totale lengtes van DNA-vezels uit met S1 behandelde kernen korter zijn bij behandeling met DNA-schade in vergelijking met onbehandelde monsters en monsters die werden behandeld met het genotoxische middel, maar niet werden onderworpen aan S1-splitsing (figuur 1).

Als alternatief, als behandeling met het S1-nuclease de lengte van DNA-vezels in vergel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische stappen van het standaard DNA-vezeltestprotocol werden besproken in een eerdere publicatie32. Hier beschrijven we aangepaste versies van de standaard DNA-vezeltest om de aanwezigheid van postreplicerende ssDNA-hiaten te onderzoeken, evenals hun reparatie door het vullen van gaten, aanvankelijk beschreven in14. In de context van post-replicatieve ssDNA gap aanwezigheid, zou het gebruik van de S1-nuclease in het S1 Fiber-protocol hoogstwaarschijnlijk geschikt zijn n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in het C.F.M.M.-laboratorium wordt ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brazilië, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 en 2017/05680-0) in het kader van het International Collaboration Research van FAPESP en de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO, Nederland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazilië, Grants # 308868/2018-8] en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazilië, Finance Code 001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Azijnzuur, GlaciaalSynth64-19-7Alternatief, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
AmmoniumhydroxideSynth1336-21-6Of soortgelijk
Antibody anti-muis IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-
Antibody Muis anti-BrdUBecton Disckson347580-
Antibody Rat anti-BrdUAbcam Ab6326-
Biologische veiligheidskaapPachanePA 410Gebruik kap aanwezig in het laboratorium
BSA (Rundserum Albumine)Sigma-AldrichA3294Of soortgelijk
CelschraperThermo Scientific179693Of soortgelijk
CldUMillipore-SigmaC6891-
ZoutzuurSynth7647-01-0Of soortgelijk
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 of 9)Zeiss-Of soortgelijk
Dekglas (of deksels)Thermo Scientific152460Alternatief, Olen - Kasvi Dekglas (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - Hoge glucoseLGC/GibcoBR30211-05/12100046Gebruik kweekmedium specifiek voor de gebruikte cellijn.
EDTA (Ethyleen-diaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat)Sigma-AldrichE5314Of soortgelijk
Epifluorescentiemicroscoop Axiovert 200Zeiss-Of soortgelijk
FBS (Fetaal Rundserum)Gibco12657-029Of soortgelijk
Forma Series II Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific 311013-998-074Gebruik celincubator aanwezig in het laboratorium
GlasplaatpotSigma-AldrichS5516Of soortgelijk
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5Of soortgelijk
IduMillipore-SigmaI7125-
MagnesiumchlorideSynth7791-18-6Of soortgelijk
MethanolMerck67-56-1Of soortgelijk
MicroscoopglazenDenvilleM1021Alternatief, Olen - Kasvi Microscoopglazen - K5-7105 OF Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfónico)Synth1132-61-2Of soortgelijk
NocodazolSigma-Aldrich31430-18-9-
PBS (Fosfaat Buffer Saline)Life Thechnologies3002Of soortgelijk
Penicilline-StreptomycineGibco15140122Of soortgelijk
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930Elke antifade moutant-oplossing voor immunofluorescentie kan worden gebruikt
S1 nuclease gezuiverd uit Aspergillus oryzaeInvitrogen18001-016Verdun de S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease verdunningsbuffer geleverd door de fabrikant, verdeel in porties en bewaar bij -20 °C
SDS (Natrium Dodecyl Sulfaat)BioRad161-0302Of soortgelijk
Natriumacetaat TrihydraatSigma-Aldrich6131-90-4Of soortgelijk
NatriumchlorideSynth 7647-14-5Of soortgelijk
SucroseSigma-Aldrich57-50-1Of soortgelijk
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1Of soortgelijk
Triton X-100Synth9002-93-1Of soortgelijk
TrypsineGibco25200072Of soortgelijk
Tween 20Sigma-AldrichP1379Of soortgelijk
UVC LampNiet Specifiek-Essentieel: emissielengte van 254 nm
VLX-3W UV RadiometerVilber Loumart-Of soortgelijk
ZinkacetaatSigma-Aldrich557-34-6Of soortgelijk

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071(2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255(2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833(2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Fiber AssayReplication Fork DynamicsPost Replicative GapsS1 NucleaseSingle Stranded DNAGap Filling AssayDNA Replication StressGenome IntegrityImmunodetection MethodDNA Damage Repair

Related Articles