Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie

Samenvatting

Hier beschrijven we een reeks methoden voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met membranen van cellen of microvesicles.

Samenvatting

In het menselijk lichaam vinden de meeste van de belangrijkste fysiologische reacties die betrokken zijn bij de immuunrespons en bloedstolling plaats op de membranen van cellen. Een belangrijke eerste stap in elke membraanafhankelijke reactie is binding van eiwit op het fosfolipidemembraan. Een benadering voor het bestuderen van eiwitinteractie met lipidembranen is ontwikkeld met behulp van fluorescerend gelabelde eiwitten en flowcytometrie. Deze methode maakt de studie van eiwit-membraaninteracties mogelijk met behulp van levende cellen en natuurlijke of kunstmatige fosfolipide blaasjes. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en beschikbaarheid van reagentia en apparatuur. Bij deze methode worden eiwitten gelabeld met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Er kunnen echter zowel zelfgemaakte als commercieel verkrijgbare, fluorescerend gelabelde eiwitten worden gebruikt. Na conjugatie met een fluorescerende kleurstof worden de eiwitten geïncubeerd met een bron van het fosfolipidemembraan (microvesicles of cellen) en worden de monsters geanalyseerd door flowcytometrie. De verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om de kinetische constanten en het evenwicht K_d te berekenen. Bovendien is het mogelijk om het geschatte aantal eiwitbindingsplaatsen op het fosfolipidemembraan te schatten met behulp van speciale kalibratieparels.

Inleiding

Biomembranen scheiden de inwendige inhoud van dierlijke cellen en extracellulaire ruimte. Merk op dat membranen ook microvesicles omringen die zijn gevormd tijdens de levenscyclus van de cel en organellen. Het celmembraan bestaat voornamelijk uit lipiden en eiwitten. Membraaneiwitten voeren signaal-, structurele, transport- en kleeffuncties uit. De lipide bilayer is echter ook essentieel voor de onderlinge relatie van de dierlijke cel met de extracellulaire ruimte. Dit artikel stelt een methode voor om de perifere interactie van externe eiwitten met het lipidemembraan te bestuderen.

Het meest treffende voorbeeld van reacties op de buitenste membraanlaag van een dierlijke cel is de bloedstollingsreactie. Een belangrijk kenmerk van bloedstolling is dat alle hoofdreacties plaatsvinden op de fosfolipidemembranen van cellen en microvesicles die uit deze cellen voortkomen en niet in het plasma ^1,2,3. Membraanafhankelijke reacties omvatten het proces van het starten van coagulatie (op de celmembranen van het subendotheel, ontstoken endotheel of geactiveerde immuuncellen, met de deelname van een weefselfactor), alle reacties van de belangrijkste cascade-activering van factoren IX, X, protrombine; activering van factor XI door trombine (op de membranen van geactiveerde bloedplaatjes, erytrocyten, lipoproteïnen en microvesicles); reacties van de eiwit C-route; inactivatie van stollingsenzymen (op de membranen van endotheelcellen met de deelname van trombomodulinecofactoren, endotheeleiwit C-receptor, heparansulfaat); en contactwegreacties (op membranen van bloedplaatjes en sommige microvesicles met de deelname van onbekende cofactoren). Het is dus onmogelijk om bloedstolling te onderzoeken zonder de interactie van verschillende plasma-eiwitten met het membraan van bloedcellen te bestuderen.

Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode voor het karakteriseren van de interactie van eiwitten met lipidemembranen van cellen of microvesicles. Deze aanpak werd aanvankelijk voorgesteld om de interactie van bloedplasma met bloedplaatjes en kunstmatige fosfolipideblaasjes te bestuderen. Bovendien interageren de meeste van de bestudeerde eiwitten direct met negatief geladen membraanfosfolipiden, met name met fosfatidylserine ^4,5. Bovendien zijn er eiwitten waarvan de interactie met het membraan wordt gemedieerd door speciale receptoren⁶.

Een belangrijk vermogen van flowcytometrie is het onderscheiden van vrije en gebonden liganden zonder extra scheiding. Dit kenmerk van cytometrie maakt de studie van ligand-evenwichtsbinding op het eindpunt mogelijk en helpt bij het uitvoeren van continue kinetische metingen. De techniek is ongekunsteld en vereist geen complexe monstervoorbereiding. Flowcytometrie wordt actief gebruikt om de dynamiek van de interactie tussen fluorescerende peptiden, receptoren en G-eiwitten in intacte en detergent-permeabele neutrofielen kwantitatief te bestuderen⁷. Deze benadering is ook van toepassing voor het onderzoeken van eiwit-DNA-interacties en de kinetiek van endonuclease-activiteit in realtime⁸. In de loop van de tijd werd deze methode gebruikt om eiwit-eiwitinteracties met hoge affiniteit kwantitatief te bestuderen met gezuiverde lipideblaasjes⁹, of, meer in het algemeen, met membraaneiwitten uitgedrukt in een zeer efficiënt Sf9-celexpressiesysteem¹⁰. Kwantitatieve methoden zijn ook beschreven voor het karakteriseren van eiwit-liposoom interacties met behulp van flowcytometrie voor transmembraaneiwitten¹¹.

Deze techniek maakt gebruik van zelfgemaakte kalibratieparels om te voorkomen dat in de handel verkrijgbare kralen worden^{gebruikt 7}. De eerder gebruikte kalibratieparels⁷ waren bedoeld om te werken met fluoresceïne, wat het assortiment toegankelijke fluorescerende liganden op de eiwitten aanzienlijk beperkte. Bovendien biedt dit artikel een nieuwe manier om kinetische gegevens te verkrijgen en te analyseren voor een redelijke tijdsresolutie. Hoewel deze methode wordt beschreven voor kunstmatige fosfolipide blaasjes, zijn er geen duidelijke beperkingen voor het aanpassingsvermogen aan cellen, natuurlijke blaasjes of kunstmatige fosfolipide blaasjes met een andere lipidesamenstelling. De hierin beschreven methode maakt het mogelijk de parameters van interactie (k_aan, k_uit) en evenwicht (K_d) te schatten en vergemakkelijkt de kwantitatieve karakterisering van het aantal eiwitbindingsplaatsen op het membraan. Merk op dat deze techniek een geschatte schatting geeft van het aantal bindingsplaatsen. De voordelen van de methode zijn de relatieve eenvoud, toegankelijkheid en aanpasbaarheid aan inheemse cellen en natuurlijke en kunstmatige microvesicles.

Protocol

1. Fluorescerende eiwitetikettering

1. Materiaalvoorbereiding
   1. Bereid 1 M natriumbicarbonaatbuffer, pH 9,0, bewaar het bij 4 °C en gebruik het binnen een week.
   2. Bereid 1,5 M hydroxylaminehydrochloridebuffer, pH 8,5, onmiddellijk voor gebruik.
   3. Bereid een 10 mg/ml oplossing van fluorescerende kleurstof (zie de tabel met materialen) in dimethylsulfoxide.
      OPMERKING: Deze oplossing kan een maand worden bewaard bij -20 °C in het donker.
   4. Bereid oplossingen van gezuiverde antilichamen of andere eiwitten op 1-10 mg / ml.
      OPMERKING: Vermijd buffers die ammoniumionen of primaire amines bevatten. Vervang de buffers die Tris of glycerol bevatten door fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door dialyse. Noch natriumazide (≤3 mM) noch thimerosal (≤1 mM) zullen de conjugatiereactie significant beïnvloeden.
   5. Incubeer het gelfiltratiemedium (zie de tabel met materialen) voor eiwitzuivering in PBS 's nachts bij kamertemperatuur of gedurende 2 uur bij 60 °C. Breng het gelfiltratiemedium aan op spinkolommen met membranen van 0,2 μm.
2. Bereken de hoeveelheid reactieve kleurstof die voor elke reactie moet worden gebruikt op basis van de concentratie eiwit die moet worden geëtiketteerd met behulp van Eq (1).
   
   Waarbij_V-kleurstof het volume van de kleurstofvoorraadoplossing is; C_pr, V_pr en MW_pr = de concentratie, het volume en het molaire gewicht van het eiwit; MW_kleurstof is het molaire gewicht van de kleurstof; 100 is een eenheidsomrekeningsfactor; MR is de molaire verhouding van kleurstof tot eiwit in het reactiemengsel.
   OPMERKING: De volgende MR's worden aanbevolen voor IgG-etiketteringsreacties: MR = 40 als het antilichaam 1-3 mg / ml is of MR = 30 als het antilichaam 4-10 mg / ml is. Voor stollingsfactoren wordt meestal MR = 5 gebruikt.
3. Conjugatiereactie
   1. Meng in een reactiebuis de eiwitoplossing met een 10x lager volume van 1 M bicarbonaatoplossing.
   2. Voeg de vereiste hoeveelheid fluorescerende kleurstof (zie stap 1.2) toe onder continu roeren.
   3. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur, beschermd tegen licht en met continu roeren.
   4. Voeg voor elke 200 μL eiwitoplossing 5 μL 1,5 M hydroxylaminehydrochloride toe.
   5. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten, beschermd tegen licht en met continu roeren.
4. Bereid de spinkolom voor.
   1. Voeg 500 μL gelfiltratiemedium voor eiwitzuivering toe aan een kolom. Centrifugeer de kolom gedurende 3 minuten bij 1.000 × g.
   2. Gooi de buffer uit de opvangbuis. Als de kolom niet vol is, voeg dan meer gelfiltratiemedium toe en centrifugeer de kolom gedurende 3 minuten bij 1.000 × g. Herhaal deze stap totdat de kolom vol is.
5. Zuivering
   1. Centrifugeer het reactiemengsel (vanaf stap 1.3.5) gedurende 5 minuten bij 17.000 × g en verwijder het neerslag.
   2. Breng het supernatant over naar de spinkolom met gelfiltratiemedium. Laat de oplossing intrekken in het gelbed.
   3. Gebruik een lege opvangbuis voor de spinkolom en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 1.000 × g. Verzamel na centrifugatie het gelabelde eiwit uit de verzamelbuis.
6. Bepaling van de mate van etikettering
   1. Corrigeer voor de bijdrage van de kleurstof aan de absorptie bij A₂₈₀ door de absorptie van vrije kleurstof bij 280 nm (A₂₈₀) en de λ_max voor de kleurstof (A_max) te meten (zie Eq (2)).
      (2)
   2. Meet de absorptie van het eiwit-kleurstofconjugaat bij 280 nm (A₂₈₀) en de λ_max voor de kleurstof (A_max) en bereken de eiwitconcetratie met behulp van Eq (3).
      (3)
      Waarbij ε_M de molaire extinctiecoëfficiënt van het eiwit bij 280 nm is; d = de optische padlengte tijdens de meting van de absorptie; CF is de bijdrage van de kleurstof aan de absorptie bij A₂₈₀ (stap 1.6.1).
   3. Bereken de mate van labeling (DOL) met behulp van Eq (4).
      (4)
      Waarbij ε _M-kleurstof de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof bij λ_max nm is; d = de optische padlengte tijdens de meting van de absorptie; _C-eiwit is de concentratie van het eiwit (stap 1.6.2).

2. Bereiding van fosfolipide blaasjes

1. Bereiding en opslag van het lipidenmengsel
   1. Combineer de lipiden in de juiste verhouding (fosfatidylserine/fosfatidylcholine in een verhouding van 20 mol% tot 80 mol%).
   2. Droog het lipidenmengsel na lyofilisatie of verdamping en bewaar het onder een inerte atmosfeer in glazen ampullen.
2. Productie van lipidefilms
   1. Open de ampul en resuspendeer het lipidenmengsel in een kleine hoeveelheid (~ 100 μL) chloroform.
      OPMERKING: Gebruik niet te veel chloroform omdat het niet volledig verdampt.
   2. Voeg DiIC16(3) toe aan ethanol bij 0,2 mol%. Breng het lipidenmengsel over in een kolf met ronde bodem. Verdeel het mengsel dun over de zijkanten van de kolf door het te draaien. Droog de lipidenmix gedurende 30 minuten onder een argonstroom.
3. Hydratatie van het lipidenmengsel
   1. Voeg een voldoende warme (~55 °C) waterige buffer (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) toe in een volume dat overeenkomt met de verwachte lipideconcentratie aan de kolf met de lipidenfilm. Incubeer het mengsel met vortexing op 55 °С gedurende 30 minuten voor volledige hydratatie.
   2. Plaats de monsterbuis in een vriezer of warme thermostaat om de lipidensuspensie 3-5 vries-dooicycli te laten ondergaan.
4. Vorming van lipideblaasjes door extrusie
   1. Bereid de extruder voor volgens de instructies van de fabrikant. Warm alle extrudercomponenten op tot de faseovergangstemperatuur van het lipidenmengsel.
   2. Vul een van de extruderspuiten met het gehydrateerde lipidenmengsel. Wacht 5-10 minuten tot de temperatuur van de lipidensuspensie in evenwicht is met de temperatuur van de extruder.
   3. Extrudeer het lipidenmengsel minstens 10 keer door het membraan. Plaats voor de uiteindelijke extrusie de lipidensuspensie in de alternatieve spuit en zoek naar een verandering in uiterlijk van een enigszins vage naar een heldere oplossing.
   4. Bewaar het resulterende mengsel van lipideblaasjes bij 4 °C, bij voorkeur in een inerte atmosfeer van argon of stikstof, gedurende 3-4 dagen. Niet in de vriezer bewaren.

3. Isolatie van bloedplaatjes uit volbloed

1. Verzamel volbloed van gezonde donoren in buizen die 3,2% natriumcitraat bevatten.
2. Voeg prostaglandine E1 (PGE1) (1 μM) en apyrase (0,1 U/ml) toe aan het bloed, gevolgd door centrifugatie bij kamertemperatuur bij 100 × g gedurende 8 minuten.
3. Neem na centrifugatie het bloedplaatjesrijke plasma en voeg natriumcitraatoplossing (106 mM, pH 5,5) toe aan een plasma/citraatverhouding van 3:1. Centrifugeer het plasma bij kamertemperatuur bij 400 × g gedurende 5 min.
4. Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellet in 300 μL tyrodebuffer zonder BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glucose, pH 7,4). Zuiver de bloedplaatjes uit plasma-eiwitten door gelchromatografie op het gelfiltratiemedium voor bloedplaatjeszuivering (zie de materiaaltabel).

4. Detectie van eiwit - lipide interactie door flowcytometrie

1. Kinetische bindingsexperimenten
   1. Verdunde fosfolipide blaasjes (vanaf stap 2.4.4) in de buffer van Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glucose, 0,5% BSA, pH 7,4) tot een concentratie van 1 μM en een totaal volume van 250 μL.
   2. Meng fluorescerend gelabelde stollingsfactor X (fX-fd) uit stap 1 bij een concentratie van 500 nM met de fosfolipide blaasjes uit stap 4.1.1 in een verhouding van 1:1 (uiteindelijke blaasjesconcentratie 0,5 μM, fX-fd-concentratie is 250 nM fX) tot een totaal volume van 500 μL.
   3. Injecteer onmiddellijk de 500 μL van de gemengde suspensie (~ 20 min voor analyse met een lage stroomsnelheid) in de flowcytometer. Gebruik een laag debiet en zorg ervoor dat de drempelwaarde voor kanaal FL2 (exсitatie 488 nm, emissiefilter 585/42 nm) als waarde 200 is. Meet de gemiddelde fluorescentie in kanaal FL4 (exсitatie 633 nm, emissiefilter 660/20) voor de fluorescentiekleurstof uit de materiaaltabel.
      OPMERKING: Kies een cytometer zonder autosampler. Dit versnelt het proces van injectie van het monster in de meetcel.
   4. Wanneer verzadiging van binding is bereikt (geen significante toename van fluorescentie binnen 5 minuten), verdunt u het monster snel 20-voudig met de buffer van Tyrode en controleert u de dissociatie totdat de basisfluorescentie is bereikt (volledige dissociatie) of totdat een plateau is bereikt (geen significante afname van fluorescentie binnen 5 minuten).
      OPMERKING: Voeg als controle 10 μM EDTA toe en controleer de volledige dissociatie gedurende 5 minuten.
2. Evenwichtsbindingsexperimenten
   OPMERKING: Gebruik de kinetische curve van binding om de tijd tot verzadiging te bepalen; de tijd voor verzadiging voor fX-fd en kunstmatige blaasjes is 20 min.
   1. Incubeer kunstmatige fosfolipide blaasjes (5 μM) voor de bindingstest met verschillende concentraties fX-fd (van 0 tot 1.000 nM) in de buffer van Tyrode gedurende 20 minuten.
   2. Verdun elk monster vanaf stap 4.2.1 met 20x tot een eindvolume van 200 μL met de buffer van Tyrode. Analyseer onmiddellijk het verdunde monster door flowcytometrie binnen 30 s. Gebruik de instellingen uit stap 4.1.3.
      OPMERKING: Gebruik als controle voor niet-specifieke binding vergelijkbare monsters met EDTA (10 μM) en incubeer ze gedurende 5 minuten.

5. Analyse van flowcytometriegegevens

1. Exporteer experimenten in FSC-formaat van cytometrie data acquisitie software naar cytometer software voor data-analyse (zie de Tabel van Materialen). Kies | | exporteren FCS-bestanden. Open FSC-bestanden in cytometersoftware voor gegevensanalyse door de bestanden op de computer te selecteren en naar de werkruimte van het programma te slepen.
2. Identificeer voor gating van de microvesicles het gebied van microvesicles door de fluorescentie van de lipofiele kleurstof DiIC₁₆ (3). Gebruik menuopdrachten of plotknop in het werkblad om dot plot SSC te maken van FL2 (dye DilC₁₆(3)) in logcoördinaten. Kies de knop Rechthoekige poort om een gatgebied te tekenen, zodat gebeurtenissen uit een monster zonder blaasjes niet in dit gebied worden opgenomen (figuur 1B,C).
3. Analyseer de kinetische experimenten.
   1. Maak een dot-plot met behulp van de coördinaten van fluorescentie (FL4) in de loop van de tijd voor het gebied van de blaasjes (dubbelklik in het gebied van blaasjes in stap 5.2)
   2. Exporteer de gegevens over de verandering in fluorescentie in de loop van de tijd in csv-indeling. Voorbeeld | kiezen Klik met de rechtermuisknop op | | exporteren Kies FL4 en Tijd in parameters | Selecteer map voor het opslaan van | Selecteer CSV-indeling | Exporteren.
   3. Open het CSV-bestand in een statistische software (zie de materiaaltabel). Bereken een eenvoudig voortschrijdend gemiddelde van fluorescentie en tijd voor elke 1.000 gebeurtenissen.
   4. Benader een grafiek van de afhankelijkheid van de eenvoudige voortschrijdende gemiddelde fluorescentie op tijd onder de aanname van exponentiële afhankelijkheid (Analysis > Fitting >Nonlinear Curve Fit) en gebruik deze om de kinetische associatieconstante te berekenen met behulp van Eq (5).
      (5)
      waarbij [X^B] de gebonden factorconcentratie op elk moment van de tijd (door de gebruiker gedefinieerde eenheden) is volgens het eenvoudig voortschrijdend gemiddelde uit stap 5.3.3; [X] is de toegevoegde factorconcentratie; [X]_max = de maximale gebonden factorconcentratie; k is de associatieconstante; t is de tijd.
   5. Herhaal dezelfde reeks acties (5.3.1-5.3.4) om de kinetische dissociatieconstante te berekenen met behulp van Eq (6).
      (6)
      Waarbij [X^B] de gebonden factorconcentratie op elk moment van de tijd is; [X]₀ is de gebonden factorconcentratie op het beginmoment; k de dissociatieconstante is; t is de tijd.
4. Evenwichtsbindingstest
   1. Bepaal de gemiddelde fluorescentie van fX-fd in het gebied van de blaasjes voor elke geselecteerde concentratie fX-fd.
   2. Benader de afhankelijkheid van de gebonden factor fluorescentie van de concentratie van de toegevoegde factor in de aanname van eenvoudige binding op één locatie. Bereken de gemiddelde bindingsparameters met behulp van Eq (7) uit minimaal drie onafhankelijke herhalingen.
      (7)
      Waarbij [X^B] de gebonden factorconcentratie is; [X] is de toegevoegde factorconcentratie; n^x = het schijnbare aantal bindingsplaatsen per blaasje; K_d is de schijnbare dissociatieconstante.

6. Fluorescentie-intensiteit omzetten in het gemiddelde aantal bindingsplaatsen

1. Bereid gekalibreerde kralen voor.
   1. Incubeer gelgefilterde bloedplaatjes (zie stap 3.3) met A23187 (10 μM) in aanwezigheid van CaCl₂ (2,5 mM) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Voeg aan de geactiveerde bloedplaatjes de verschillende concentraties fX-fd (0 tot 1.000 nM) toe. Voeg 2% v/v formaldehyde toe en incubeer gedurende 1 uur. Stop de reactie door de bloedplaatjes te incuberen met 3 M glycine en 5% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Zuiver het mengsel van de niet-gereageerde kleurstof. Centrifugeer de bloedplaatjes gedurende 5 minuten bij 400 × g, verwijder het supernatant en resuspeneer de pellet in de buffer van Tyrode (met 0,5% BSA).
      OPMERKING: Herhaal stap 6.1.3 drie keer.
2. Meet eerst het fluorescentieniveau van de kalibratieparels in elk monster met behulp van een spectrofluorometer (voor fluorescerende kleurstof uit de materiaaltabel excitatie 633 nm, emissie 670 nm) en vervolgens met behulp van de flowcytometer (in kanaal FL4: excitatie 633 nm, emissiefilter 660/20). Bepaal met behulp van een celteller het aantal kralen in elk monster.
3. Converteer de fluorescentie-intensiteit van elk respectievelijk kraalmonster naar de concentratie oplosbare fluorescerende kleurstof met behulp van een spectrofluorometer. Herbereken de fluorescerende kleurstofconcentratie voor het aantal fluorofoormoleculen met behulp van Eq (8).
   (8)
   Waarbij N_x het aantal fluorofoormoleculen is; C = de fluorescerende kleurstofconcentratie; N_A is de constante van Avogadro; N_A = 6.02214076×10²³ mol ^-1.
4. Maak een afhankelijkheidsgrafiek van de gemiddelde fluorescentie van de kralen in een flowcytometer (stap 6.2) van het aantal fluorofoormoleculen (zie stap 6.3) voor elk monster met behulp van statistische software (zie de tabel met materialen). Deze afhankelijkheid benaderen op basis van regelproportionaliteit (analyse | Montage | Pasvorm lineair). Bereken op basis van de benadering in Eq (9) de conversiefactor van de gemiddelde fluorescentie naar bindingsplaatsen.
   (9)
   Waarbij MF de gemiddelde fluorescentie van kralen door flowcytometrie is; Nx is het aantal fluorofoormoleculen per kraal; CF vertegenwoordigt de conversiefactor van de gemiddelde fluorescentie naar bindingsplaatsen. CF en b worden verkregen uit de resultaten van het passen van de grafiek door lineaire proportionaliteit.
5. Bereken het schijnbare aantal bindingsplaatsen per vesicle van belang met behulp van Eq (10).
   (10)
   Waarbij nx het schijnbare aantal bindingsplaatsen per vesikel van belang is; MF is de gemiddelde fluorescentie van de blaasjes van belang door flowcytometrie; CF en b zijn conversiefactoren van de Eq (8).

Resultaten

De hierin beschreven flowcytometriemethode wordt gebruikt om de binding van plasmastollingseiwitten aan geactiveerde bloedplaatjes te karakteriseren. Daarnaast werden fosfolipide blaasjes PS:PC 20:80 toegepast als modelsysteem. Dit artikel richt zich vooral op kunstmatige fosfolipide blaasjes als voorbeeld. De parameters van de cytometer, met name de spanning van de fotomultiplicatorbuis (PMT) en de compensatie moeten worden geselecteerd voor elk specifiek hulpmiddel, het onderzoeksobject (cellen, kunstmatige of natuurli...

Discussie

De voorgestelde methode kan worden aangepast voor een ruwe karakterisering van de interactie van eiwitten met fosfolipidemembranen uit verschillende bronnen en samenstellingen. De hier beschreven kwantitatieve flowcytometrie geeft toe aan oppervlakteplasmonresonantie (SPR) in verschillende parameters. In het bijzonder heeft het een lagere gevoeligheid en tijdresolutie en vereist het fluorescerende etikettering van eiwitten. Fluorescerende etikettering kan leiden tot een verandering in conformatie en verlies van activitei...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A37573	fluorescente kleurstof
Apyrase uit aardappelen	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
runde serumalbumine	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Calciumchloride, watervrij, poeder, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescentie Spectrometer	Agilent
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchloraat)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
EDTA dinatriumzout	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		cytometrie data-acquisitiesoftware
FlowJo	Tree Star		cytometersoftware voor data-analyse
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Enzyme research	HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride	Panreac	141914.1209
L-α-fosfatidylcholine (Hersenen, Varkens)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-α-fosfatidylserine (Hersenen, Varkens) (natriumzout)	Avanti Polar Lipids	840032P
Magnesiumchloride	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Statistische software
Fosfaatbufferoplossing (PBS) Tabletten, Biotechnologiekwaliteit	VWR Life Science AMRESCO	97062-732
Kaliumchloride	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandine E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	gel filtratiemedium voor eiwitzuivering
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	gel filtratiemedium voor trombocyten zuivering
Natriumbicarbonaat	Corning	61-065-RO
Natriumchloride	Sigma Aldrich	S3014-500G
Natriumfosfaat monobasicum	Sigma Aldrich	S3139-250G
Spin kolommen met membraan 0,2 µm	Sartorius	VS0171
Trinatriumcitraat dihydraat	Sigma Aldrich	S1804-1KG