Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde colorimetrische test die gemakkelijk in de meeste laboratoria kan worden geïmplementeerd.
Methodenartikel
Meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
IJzer is een essentiële micronutriënt. Zowel ijzerstapeling als tekort zijn zeer schadelijk voor de mens en het weefselijzergehalte wordt fijn gereguleerd. Het gebruik van experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -deficiëntie is van groot belang geweest voor het bevorderen van de kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase. De meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels wordt gewoonlijk uitgevoerd met atomaire absorptiespectroscopie of met een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantronlinereagens. Al vele jaren wordt de colorimetrische test gebruikt voor het meten van het niet-heemijzergehalte in een breed scala aan dierlijke weefsels. In tegenstelling tot atomaire absorptiespectroscopie, sluit het de bijdrage van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen uit. Bovendien vereist het geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur en kan het dus gemakkelijk in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd. Ten slotte kan de colorimetrische test op cuvette-basis zijn of worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. Het huidige werk biedt een goed ingeburgerd protocol dat geschikt is voor de detectie van veranderingen in weefselijzerniveaus in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort.
Inleiding
IJzer is een essentiële micronutriënt, die nodig is voor de functie van eiwitten die betrokken zijn bij cruciale biologische processen zoals zuurstoftransport, energieproductie of DNA-synthese. Belangrijk is dat zowel ijzeroverschot als ijzertekort zeer schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid en dat weefselijzerniveaus nauwkeurig worden gereguleerd. Abnormale ijzerabsorptie via de voeding, ijzertekort, herhaalde bloedtransfusies en chronische ontsteking zijn veel voorkomende oorzaken van ijzergerelateerde aandoeningen die miljarden mensen wereldwijd treffen1,2,3.
Experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -tekort zijn instrumenteel geweest om onze kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase4 te bevorderen. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die de afgelopen twee decennia is geboekt, blijven veel belangrijke aspecten ongrijpbaar. In de komende jaren zal de nauwkeurige meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels een cruciale stap blijven om het onderzoek op het gebied van ijzerbiologie te bevorderen.
De meeste laboratoria kwantificeren weefselijzer met atomaire absorptiespectroscopie (AAS), inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS), of een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantrontrolinereagens. Dit laatste is gebaseerd op de oorspronkelijke methode beschreven door Torrance en Bothwell meer dan 50 jaar geleden5,6. Hoewel vervolgens een variant van deze methode werd ontwikkeld met ferrozine als alternatief voor bathofenanthroline7, blijft dit laatste het meest geciteerde chromogene reagens in de literatuur.
De gekozen methode is vaak afhankelijk van de beschikbare expertise en infrastructuur. Hoewel AAS en ICP-MS gevoeliger zijn, blijft de colorimetrische test veel gebruikt omdat het de volgende belangrijke voordelen biedt: i) het sluit de bijdrage uit van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen; ii) het vereist geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur; en iii) de oorspronkelijke test op basis van cuvette kan worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. De colorimetrische benadering die in dit werk wordt gepresenteerd, wordt routinematig gebruikt om veranderingen in weefsel niet-heemijzerniveaus te kwantificeren in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort, van knaagdieren tot vissen en fruitvlieg. Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde, colorimetrische test die de meeste laboratoria gemakkelijk te implementeren zouden moeten vinden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
C57BL/6 muizen werden commercieel aangekocht en hepcidine-null (Hamp1−/−) muizen op een C57BL/6 achtergrond8 waren een vriendelijk geschenk van Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrijk). Dieren werden gehuisvest in de i3S-dierenfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden, in een temperatuur- en lichtgecontroleerde omgeving, met vrije toegang tot standaard knaagdier chow en water. Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax) werd gekocht van een commerciële viskwekerij en gehuisvest in de ICBAS-dierenfaciliteit, in een temperatuur- en lichtgecontroleerde omgeving, en dagelijks ad libitum gevoed met standaard zeebaarsvoer. Alle procedures met gewervelde dieren zijn goedgekeurd door de i3S Animal Ethics Committee en de nationale autoriteit, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informatie over commerciële reagentia, apparatuur en dieren wordt vermeld in de tabel met materialen.
1. Oplossingsvoorbereiding
OPMERKING: Hanteer en bereid alle reagentia en oplossingen voor met ijzervrij glaswerk of plastic wegwerpartikelen. Sta niet toe dat metalen laboratoriummaterialen (bijv. roestvrijstalen spatels) in contact komen met een reagens of oplossing, vanwege het risico op ijzerverontreiniging. Zorg ervoor dat herbruikbaar glaswerk ijzervrij is. Was de materialen gedurende 30-60 minuten met het juiste laboratoriummiddel, spoel met gedeïoniseerd water, week een nacht in een 37% salpeterzuuroplossing verdund 1:3 met gedeïoniseerd water, spoel opnieuw met gedeïoniseerd water en laat drogen.
- Zuurmengsel: Voeg 10 g trichloorazijnzuur toe aan 82,2 ml 37% zoutzuur in een glazen fles, los grondig op en stel het uiteindelijke volume in op 100 ml met gedeïoniseerd water. Schud voor gebruik. Als alternatief, gebruik slechts 37% zoutzuur voor weefselvertering.
OPMERKING: De oplossing is ten minste 2 maanden stabiel wanneer deze wordt bewaard in donkerbruine glazen reagensflessen.
LET OP: Zoutzuur en trichloorazijnzuur zijn corrosief en geconcentreerde vormen geven giftige zure dampen af. Draag te allen tijde beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van zuren. Vermijd het inademen ervan en hanteer altijd zuren onder een zuurkap. - Verzadigd natriumacetaat: Voeg 228 g watervrij natriumacetaat toe aan 400 ml gedeïoniseerd water in een glazen fles en roer 's nachts bij kamertemperatuur. Laat de oplossing rusten en een dag neerslaan. Als er geen neerslag optreedt, blijf dan kleine hoeveelheden natriumacetaat toevoegen. Bewaar de oplossing in een glazen fles.
- Chromogeenreagens: Voeg voor de bereiding van 1 ml chromogeenreagens 1 mg 4,7-difenyl-1,10-fenanthroline disulfonzuur dinatriumzout toe aan 500 μL gedeïoniseerd water en 10 μL geconcentreerd (100%) thioglycolzuur en los grondig op. Vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Bereid zoveel chromogeenreagens als nodig is. De oplossing is 1 maand stabiel wanneer deze wordt beschermd tegen licht. - Werkend chromogeenreagens (WCR): Voeg 1 volume van het chromogeenreagens toe aan 5 volumes verzadigd natriumacetaat en 5 volumes gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik. - Standaardoplossing voor voorraadijzer: Om een 20 mM stockijzeroplossing te bereiden, plaatst u 111,5 mg carbonylijzerpoeder in een maatkolf van 250 ml met 5.480 μL 37% zoutzuur. Laat een nacht oplossen bij kamertemperatuur (of incubeer in een kokend waterbad). Maak vervolgens de oplossing aan tot een eindvolume van 100 ml met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: De standaardoplossing kan voor onbepaalde tijd worden bewaard wanneer deze wordt opgeslagen in een goed afgesloten vat. - Working Iron Standard Solution (WISS): Voeg 13,5 μL 37% zoutzuur toe aan 500 μL gedeïoniseerd water. Voeg 10 μL van de Stock Iron Standard Solution toe en vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemeten met AAS).
OPMERKING: De werkoplossing moet op de dag van gebruik vers worden bereid.
2. Drogen van monsters
- Snijd een weefselmonster van 10-100 mg met een scalpelmesje. Weeg het nauwkeurig in een analytische/precisiebalans over een klein stukje parafilm (Fresh Weight).
- Plaats het stukje weefsel met behulp van een plastic pincet in een 24-wells plaat (ongelidd om waterverdamping mogelijk te maken) en laat het drogen op een standaard incubator bij 65 °C gedurende 48 uur.
- U kunt ook een magnetronvergistingsoven in het laboratorium gebruiken voor het drogen van weefselmonsters. Plaats met een plastic pincet het gewogen stuk tissue in een ijzervrije teflonbeker en droog het in de magnetron. Stel de bedrijfsparameters in volgens de handleiding van het instrument.
OPMERKING: Als referentie worden de bedrijfsparameters voor het drogen van levermonsters met behulp van de specifieke digestieoven (zie Tabel met materialen) weergegeven in tabel 1. - Plaats met behulp van een plastic pincet elk gedroogd stukje weefsel over een klein stukje parafilm in een analytische / precisiebalans en weeg het nauwkeurig (Drooggewicht).
3. Monster zure spijsvertering
- Breng met behulp van een plastic pincet elk gedroogd stuk weefsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 1 ml van het zuurmengsel toe en sluit de microcentrifugebuis. Bereid een zuur blanco op dezelfde manier, behalve dat het weefsel wordt weggelaten.
LET OP: Het zuurmengsel is corrosief en geeft giftige dampen af. Draag beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van het zuurmengsel. Vermijd het inademen en behandel het altijd onder een zuurkast. - Verteer de weefsels door de microcentrifugebuizen gedurende 20 uur in een incubator bij 65 °C te incuberen.
- Breng na afkoeling tot kamertemperatuur 500 μL van het heldere (gele) zuurextract (supernatant) over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een micropipette met plastic uiteinden. Als het niet mogelijk is om een duidelijk supernatant te verkrijgen, voer dan een korte centrifugatiespin uit.
LET OP: Het bovennatuurlijk is zeer zuur. Draag beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van de supernatanten. Hanteer ze altijd onder een zuurkast.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de zure extracten onmiddellijk worden gebruikt voor de colorimetrische test of worden ingevroren bij -20 °C voor later gebruik. Ontdooi bevroren monsters volledig tot kamertemperatuur en vortex ze voor gebruik.
4. Kleurontwikkeling
- Bereid chromogeenreacties zoals aangegeven in tabel 2 in microcentrifugebuizen van 1,5 ml of, voor een hogere doorvoer, rechtstreeks in de vlakke bodem, heldere, onbehandelde polystyreenmicroplaten met 96 putten. Bereid alle reacties (zuur blanco, standaard en monster) ten minste in tweevoud voor.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
5. Absorptiemeting
- Meet de absorptie van monsters in een spectrofotometer of plaatlezer bij een golflengte van 535 nm tegen een gedeïoniseerde waterreferentie. Platen kunnen ongelidd of afgedekt worden gelezen. Verwijder in de dekselbehuizing eventuele condensatie die ontstaat als gevolg van het vrijkomen van zure dampen uit het deksel vlak voor de meting om mogelijke interferentie met de absorptiemeting te voorkomen.
OPMERKING: De optische absorptie van de zuur blanco afgelezen tegen gedeïoniseerd water (referentie) moet minder dan 0,015 zijn; de optische absorptie van de standaard en de monsters moet tussen 0,100 en 1,000 liggen. Voor monsters met een zeer hoog of zeer laag ijzergehalte moeten de volumes zuurextract (supernatant) en diH2O mogelijk worden aangepast (tabel 2): als de absorptie groter is dan 1,0, gebruik dan een kleiner monstervolume (supernatant); wanneer de absorptie lager is dan 0,1, gebruik dan een hoger volume van het supernatant. Het monstervolume (Vsmp) wordt in aanmerking genomen bij de berekening van het weefselijzergehalte van elk monster (zie stap 6).
6. Berekening van het weefselijzergehalte
- Bereken het ijzergehalte van niet-heemweefsel met de volgende vergelijking:
Weefselijzer (μg/g droog weefsel) =
AT = absorptie van het testmonster
AB = absorptie van zuur blank
AS = absorptie van standaard
Fes = ijzerconcentratie van WISS (μg Fe/ml)
W = gewicht van de droge stof (g)
Vsmp = monstervolume (variabel volume supernatant in tabel 2 omgerekend naar ml)
Vf = eindvolume van het zuurmengsel na incubatie gedurende de nacht bij 65 °C (overeenkomend met het zuurvolume plus het volume droge stof in ml; als de monstergewichten niet significant verschillen, ga dan uit van een constant volume ≈ 1 ml)
Vstd = ijzerstandaardvolume (volume WISS in tabel 2 omgerekend naar ml)
Vrv = eindreactievolume (totaal volume in tabel 2 omgerekend naar ml)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cuvette versus 96-well microplate vergelijking
De meting van weefsel niet-heemijzer door reactie met een bathofenantronline-reagens dat oorspronkelijk door Torrance en Bothwell is beschreven5,6 is gebaseerd op het gebruik van een spectrofotometer voor absorptiemeting. Daarom zijn de volumes die worden gebruikt in de chromogeenreactie compatibel met de grootte van een gewone spectrofotometer cuvette. Het huidige werk beschrijft een methodeaanpa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels wordt verstrekt, met behulp van een aanpassing van de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische test die oorspronkelijk werd beschreven door Torrance en Bothwell5,6. De kritische stappen van de methode zijn het drogen van weefselmonsters; eiwitdenaturatie en afgifte van anorganisch ijzer door zure hydrolyse; reductie van ijzer (Fe3 +) tot de ijzertoestand (Fe2 +...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door nationale fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., in het kader van het project UIDB/04293/2020.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 well UV transparante plaat | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytische balans | Kern | ABJ 220-4M | |
| Watervrij natriumacetaat | Merck | 106268 | |
| Bathophenantroline sulfonaat (4,7-Difenyl-1,10-fenantroline disulfonzuur) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 muizen (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl ijzerpoeder, ≥99,5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Wegwerp cuvettes in polymethylmethacrylaat (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Dubbel gedestilleerd, steriel water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescentie microplaat lezer | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Zoutzuur, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microgolfspijsverteringsoven en witte teflonbekers | CEM | MDS-2000 | |
| Salpeterzuur | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Knaagdierenvoer | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Eiwit Knaagdier Onderhoudsvoer bevattende 175 mg/kg ijzer |
| Zeebaars (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Zeebaarsvoer | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Enkelstraals UV-Vis spectrofotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolzuur | Merck | 100700 | |
| Trichloroazijnzuur | Merck | 100807 |
Referenties
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297(2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen