$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Cyanobacteriën zijn prokaryote organismen die fotosynthese gebruiken als energiebron 1,2. Het onderzoek richt zich steeds meer op cyanobacteriële soorten. Verschillende cyanobacteriën kunnen worden getransformeerd met DNA3. Genen kunnen bij deze soorten worden uitgeschakeld of overexpressie krijgen. De transformatie is echter beperkt tot enkele soorten 4,5,6,7,8,9,10,11, en het kan moeilijk zijn om transformatie vast te stellen in stammen uit kweekcollecties of het wild 8. Stammen van de filamenteuze soort Phormidium lacuna (figuur 1) werden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen, waarin omgevingsomstandigheden, zoals zoutconcentraties of temperatuur, in de loop van de tijd fluctueren. Deze filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden gebruikt als modelorganismen voor de orde Oscillatoriales12 waartoe ze behoren.
Tijdens proeven met genoverdracht door elektroporatie13,14 werd ontdekt dat P. lacune kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie15. In dit proces wordt DNA op natuurlijke wijze opgenomen door sommige cellen. In vergelijking met andere transformatiemethoden 16,17 heeft natuurlijke transformatie het voordeel dat er geen extra hulpmiddelen nodig zijn die de procedure kunnen bemoeilijken. Elektroporatie vereist bijvoorbeeld de juiste cuvetten, intacte draden en selectie van de juiste spanning. P. lacune is momenteel het enige Oscillatoriales-lid dat vatbaar is voor natuurlijke transformatie. Omdat het oorspronkelijke protocol is gebaseerd op elektroporatieprotocollen, bevatte het nog steeds verschillende wasstappen die mogelijk onnodig zijn. Verschillende benaderingen werden getest om het protocol te vereenvoudigen, wat leidde tot het hier gepresenteerde transformatieprotocol.
De genoomsequentie is essentieel voor verdere moleculaire studies op basis van gen knock-out of overexpressie. Hoewel genoomsequenties binnen korte tijd kunnen worden verkregen met sequencingmachines van de volgende generatie, kan de extractie van DNA moeilijk zijn en afhankelijk van de soort. Bij P. lacune werden verschillende protocollen getest. Vervolgens werd een op gemodificeerde cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) gebaseerde methode vastgesteld, wat resulteerde in een aanvaardbare zuiverheid van DNA en DNA-opbrengsten van elke zuiveringscyclus voor voortgezet werk in het laboratorium. Het genoom van vijf stammen zou met dit protocol gesequenced kunnen worden. De volgende logische transformatiestap was het vaststellen van eiwitexpressie in P. lacune.
De sfGFP die in dit protocol als markereiwit wordt gebruikt, kan met elke fluorescentiemicroscoop worden gedetecteerd. Alle promotors die werden getest, konden worden gebruikt voor P. lacuna sfGFP-expressie. Het toenemende aantal stammen dat voortkomt uit transformatie heeft geleid tot de behoefte aan een methode voor het opslaan van de culturen. Dergelijke methoden zijn vastgesteld voor Escherichia coli en vele andere bacteriën18. In standaardprotocollen worden glycerolculturen bereid, overgebracht in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C. Deze methode vereist slechts een paar stappen en is zeer betrouwbaar voor die soorten waarvoor het is vastgesteld. Het standaardprotocol was niet haalbaar voor P. lacune omdat levende cellen niet in alle gevallen konden worden teruggevonden. Toen glycerol echter na het ontdooien werd verwijderd, overleefden cellen van alle onderzoeken. Eenvoudige methoden worden gepresenteerd voor de analyse van de beweeglijkheid van P. lacune, die kan worden gecombineerd met knock-out mutagenese om type IV pili of de rol van fotoreceptoren te onderzoeken. Deze testen verschillen van die van eencellige cyanobacteriën 19,20,21 en kunnen ook nuttig zijn voor andere Oscillatoria.