Methodenartikel

Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 februari 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phormidium lacuna is een filamenteuze cyanobacterie die werd geïsoleerd uit mariene rotspoelen. Dit artikel beschrijft de isolatie van filamenten uit natuurlijke bronnen, DNA-extractie, genoomsequencing, natuurlijke transformatie, expressie van sfGFP, cryoconservatie en motiliteitsmethoden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobacteriën zijn de focus van fundamenteel onderzoek en biotechnologische projecten waarin zonne-energie wordt gebruikt voor de productie van biomassa. Phormidium lacuna is een nieuw geïsoleerde filamenteuze cyanobacterie. Dit artikel beschrijft hoe nieuwe filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen. Het beschrijft ook hoe DNA kan worden geëxtraheerd uit filamenten en hoe de genomen kunnen worden gesequenced. Hoewel transformatie is vastgesteld voor veel eencellige soorten, wordt het minder vaak gemeld voor filamenteuze cyanobacteriën. Een vereenvoudigde methode voor de natuurlijke transformatie van P. lacune wordt hier beschreven. P. lacuna is het enige lid van de orde Oscillatoriales waarvoor natuurlijke transformatie is vastgesteld. Dit artikel laat ook zien hoe natuurlijke transformatie wordt gebruikt om superfolder groen fluorescerend eiwit (sfGFP) tot expressie te brengen. Een endogene cpcB-promotor induceerde ongeveer 5 keer sterkere expressie dan cpc560, A2813 of psbA2-promotors van Synechocystis sp. PCC6803. Verder werd een methode voor de cryopreservatie van P. lacuna en Synechocystis sp.CPP 6803 vastgesteld en worden methoden beschreven voor het beoordelen van de beweeglijkheid in een vloeibaar medium en op agar- en plastic oppervlakken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobacteriën zijn prokaryote organismen die fotosynthese gebruiken als energiebron 1,2. Het onderzoek richt zich steeds meer op cyanobacteriële soorten. Verschillende cyanobacteriën kunnen worden getransformeerd met DNA3. Genen kunnen bij deze soorten worden uitgeschakeld of overexpressie krijgen. De transformatie is echter beperkt tot enkele soorten 4,5,6,7,8,9,10,11, en het kan moeilijk zijn om transformatie vast te stellen in stammen uit kweekcollecties of het wild 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolatie van de natuurlijke omgeving

OPMERKING: Groene algen, diatomeeën, filamenteuze cyanobacteriën en andere microalgen kunnen worden geïsoleerd. Het protocol kan worden gebruikt voor alle microalgensoorten uit steenpoelen die onder laboratoriumomstandigheden groeien. Filamenteuze cyanobacteriën die behoren tot Oscillatoriales kunnen gemakkelijk worden herkend aan hun beweging en filamenteuze vorm. De soort kan in een semipure toestand worden geïdentificeerd door genoomsequencing of 16S rRNA-sequencing.

  1. Breng vloeibare zeewatermonsters over van mariene rotsspoelen (d.w.z. holtes in de rotsachtige kust) in ko....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens de bovengenoemde methoden werden 5 verschillende stammen van P. lacune geïsoleerd uit rotsspoelen en gesequenced (figuur 1 en tabel 1). Alle culturen waren steriel na ~1 jaar subculturering behalve P. lacuna HE10JO. Deze stam is nog steeds besmet met Marivirga atlantica, een mariene bacterie. Tijdens daaropvolgende Helgoland-excursies werden andere filamenteuze cyanobacteriën geïsoleerd uit rotspoelen, die verschillen van P. lacune.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel veel soorten cyanobacteriën beschikbaar zijn uit kweekcollecties 32,33,34,35,36, is er nog steeds vraag naar nieuwe cyanobacteriën uit het wild omdat deze soorten zijn aangepast aan specifieke eigenschappen. P. lacune werd verzameld uit rotsspoelen en is aangepast aan variaties van zoutconcentraties en temperatuur30. Sta.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd ondersteund door het Karlsruher Institute of Technology.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Freshwater SolutionSigma AldrichC3061
BG-11 mediumMerck73816-250ML
BoorzuurMerck10043-35-3H3BO3
CalciumchloridedihydraatCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar met filterschroefdop, steriel, 250 mLGreiner658190
Cell culture flasks Cellstar met filterschroefdop, steriel, 50 mLGreiner601975
Centrifuge LYNX 4000Thermo Scientific75006580en rotor
Centrifuge microstar 17VWR InternationalN/Avoor maximaal 13.000 rpm
Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Kobalt(II)chloride hexahydraatMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Koper(II)sulfaat pentahydraatMerck7758-99-8 CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotineCarl Roth58-85-5 C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA ladder 100 bpNew England BiolabsN3231
Elektrische pipetteringshulp middel accujet-pro SBrand GmbH26360voor pipettering 1-25 mL
EthanolVWR64-17-5C2H6O
Ethyleendiaminetetraazijnzuur disodiumzout dihydraatCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescentiemicroscoop ApoTomeZeiss
Fluorescentiemicroscoop Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Gel documentatie systeem Saffe ImageInvitrogen
Gelelektroforese systeem Mupid-One/-exuADVANCED
Glaswerk, verschillend
GlycerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
IJzer(III)chloride hexahydraatMerck10025-77-1 FeCl3 · 6 H2O
KanamycineSigma-Aldrich25389-94-0
KanamycinesulfaatCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosina, natriumzout (Sarkosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
Lichtbron, fluorescentiebuis L18W/954 daglichtOSRAMcultuur van cyanobacteriën
Lichtbron, LED paneel XL 6500K 140 WBloom StarN/Acultuur van cyanobacteriën, tot 1.000 µmol m-2 s-1
Magnesiumchloride hexahydraatCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Mangaan(II)chloride tetrahydraatServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscoop DM750Zeiss
Midi prep plasmide extractie kit NucleoBond Xtra Midi kitMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDvoor time-lapse opname
Oculair camera EC3Leicavoor continue opname tot 30 s
Oculair camera MikrOkular Full HDBresservoor time-lapse opnames, gekoppeld aan Raspberry Pi minicomputer
Petrischalen polystyrol, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Petrischalen polystyrol, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Fotometer Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Fotometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1.000 µLGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µLGilsonSKU: FA10004M
Kunststof pipetten 10 mL, sterieelGreiner607107
Kunststof buis, sterieel, 15 mLGreiner188271
Kunststof buis, sterieel, 50 mLGreiner227261
Kaliumbromide

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evalua....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Filamenteuze cyanobacteri ncryopreservatiemethodeDNA extractiefluorescentiemicroscopiemobiliteitsassaykanamycine resistentiepromotervergelijking

Gerelateerde artikelen