Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

DOI:

10.3791/63481

⸱

3 februari 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario, Universidad de Córdoba, 3i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 4IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor isolatie, concentratie en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit cyanobacteriële culturen. Benaderingen voor het zuiveren van blaasjes uit culturen op verschillende schalen, afwegingen tussen methodologieën en overwegingen voor het werken met veldmonsters worden ook besproken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyanobacteriën zijn een diverse groep fotosynthetische, Gram-negatieve bacteriën die een cruciale rol spelen in wereldwijde ecosystemen en dienen als essentiële biotechnologische modellen. Recent werk heeft aangetoond dat zowel mariene als zoetwatercyanobacteriën extracellulaire blaasjes produceren - kleine membraangebonden structuren die vrijkomen uit het buitenoppervlak van de microben. Hoewel blaasjes waarschijnlijk bijdragen aan diverse biologische processen, blijven hun specifieke functionele rollen in de cyanobacteriële biologie grotendeels onbekend. Om onderzoek op dit gebied aan te moedigen en te bevorderen, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het isoleren, concentreren en zuiveren van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes. Het huidige werk bespreekt methodologieën die met succes blaasjes hebben geïsoleerd uit grote culturen van Prochlorococcus, Synechococcus en Synechocystis. Methoden voor het kwantificeren en karakteriseren van blaasjesmonsters van deze stammen worden gepresenteerd. Benaderingen voor het isoleren van blaasjes van aquatische veldmonsters worden ook beschreven. Ten slotte worden ook typische uitdagingen bij de zuivering van cyanobacteriële blaasjes, methodologische overwegingen voor verschillende downstream-toepassingen en de afwegingen tussen benaderingen besproken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn bolvormige structuren, variërend tussen ~ 20-400 nm in diameter, vrijgegeven door vrijwel alle organismen in hun omgeving 1,2,3. Blaasjes worden begrensd door een lipide dubbellaag en kunnen zichzelf niet repliceren. Bij Gram-negatieve bacteriën wordt gedacht dat deze structuren voornamelijk ontstaan door het 'blebben' van kleine porties uit het buitenmembraan. Toch kunnen andere processen, waaronder flagellaire beweging, cellyse en afscheiding van zowel binnen- als buitenmembraanmateriaal, ook blaasjes produceren 4,5. EV's kunnen verschillende biomoleculen bevatten, waaronder lipiden, oplosbare en membraaneiwitten, nucleïnezuren en metabolieten, en kunnen dit materiaal tussen cellen transporteren 4,5,6. Gezien deze kenmerken worden EV's bestudeerd om hun mogelijke rol in een breed scala aan biologische processen te begrijpen, waaronder cellulaire communicatie, biofilmvorming, horizontale genoverdracht, gastheer-faagdynamiek en uitwisseling van voedingsstoffen 4,6.

Cyanobacteriën zijn een grote en diverse groep Gram-negatieve bacteriën, waaronder eencellige en filamenteuze organismen. Ze zijn van belang vanuit vele perspectieven, waaronder het begrijpen van hun fysiologie en diversiteit 7,8, de kritieke ecosysteemfuncties die ze dienen 9,10 en hun nut voor biotechnologie11,12. Cyanobacteriën worden aangetroffen in een breed scala aan habitats, hetzij als vrijlevende organismen in mariene, zoetwater- en terrestrische omgevingen, of in symbiotische associaties met mossen, varens, planten of in korstmossen en sponzen13. Ze dienen als cruciale primaire producenten in aquatische ecosystemen, produceren zuurstof en organische koolstof door middel van zuurstofrijke fotosynthese 9,10, en sommige zijn ook in staat om atmosferische stikstof te fixeren7. Mariene en zoetwatercyanobacteriën, waaronder Prochlorococcus, Synechococcus en Synechocystis, produceren EV's onder laboratoriumomstandigheden 14,15,16, en cyanobacteriële blaasjes zijn ook te vinden in natuurlijke omgevingen 14,17. De biologische en ecologische functies van cyanobacteriële blaasjes zijn onbekend, maar verder onderzoek op dit gebied zal waarschijnlijk nieuwe inzichten opleveren in vragen over cyanobacteriële fysiologie, differentiatie, communicatiestrategieën, evolutie en trofische interacties. Bovendien kan het vermogen van cyanobacteriële EV's om verschillende categorieën biomoleculen te dragen commerciële toepassingen hebben18,19.

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het isoleren en karakteriseren van blaasjes uit cyanobacteriële culturen en veldmonsters om een breder onderzoek van cyanobacteriële extracellulaire blaasjesbiologie mogelijk te maken en aan te moedigen. Hoewel de hier beschreven workflow analoog is aan protocollen voor het isoleren en karakteriseren van EV's van andere bacteriën, bevatten cyanobacteriële culturen en veldmonsters doorgaans lagere cel- en blaasconcentraties dan gewoonlijk wordt waargenomen bij gastheer-geassocieerde of pathogene modelsystemen 20,21,22. Studies van cyanobacteriële EV's vereisen dus speciale overwegingen en optimalisaties voor teelt en blaasjesisolatie, die verder variëren tussen stammen en media-achtergronden. Omdat geen enkel protocol even goed zal werken voor alle stammen, groeiomstandigheden en downstream-toepassingen, bieden we meerdere opties en bespreken we de afwegingen, zodat onderzoekers de benaderingen kunnen bepalen die het meest geschikt zijn voor het aanpakken van hun experimentele vragen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cyanobacteriële stammen zijn verkregen uit verschillende kweekcollecties (zie Discussie voor details).

1. Cyanobacteriële teelt

  1. Kweek mariene cyanobacteriën Prochlorococcus en Synechococcus volgens de onderstaande stappen.
    1. Kweek prochlorococcus- en synechococcus-stammen in polycarbonaatkolven met behulp van een geschikt medium zoals Pro99 of SN (zie Materiaaltabel). Zie voor nadere bijzonderheden de eerder gepubliceerde referenties23,24.
    2. Acclimatiseer de culturen door ze te laten groeien over twee tot drie overdrachten (1:20 verdunningen van de cultuur in verse media voor elke passage) onder de gewenste temperatuur- en bestralingsomstandigheden die nodig zijn voor het experiment.
      OPMERKING: Typische groeiomstandigheden 23,25 omvatten temperaturen tussen 15-30 °C bij bestraling tussen 8-150 μmol fotonen m-2 s-1, maar individuele rektoleranties en optima variëren sterk26 en moeten worden ingesteld op basis van richtlijnen uit de relevante instructies voor het verzamelen van culturen of literatuur. Controleer de groeisnelheid met behulp van cultuurfluorescentie of flowcytometrie telt23 en zorg ervoor dat culturen groeien met een consistente steady-state exponentiële snelheid voordat het experiment begint.
    3. Voer een reeks opeenvolgende geleidelijke overdrachten uit van kleinere naar grotere volumes zodra cellen de late exponentiële fase bereiken (bijv. 20 ml < 250 ml < 2 l < 10 l < 20 l).
      OPMERKING: Culturen met een groot volume kunnen niet direct worden geënt uit kleine hoeveelheden startcultuur. Merk op dat grotere culturen de toevoeging van buffers kunnen vereisen (zoals 1 mM HEPES, pH 7,5 of 3,75 mM TAPS, pH 8), samen met aanvullend natriumbicarbonaat of borrelen met steriele lucht24.
  2. Kweek zoetwatercyanobacterie Synechocystis sp. PCC 6803.
    1. Bereid een cultuur van Synechocystis sp. PCC 6803 voor om als entmateriaal te worden gebruikt door het te cultiveren met beluchting (borrelende lucht bij 1 l/min), bij 30 °C, onder een licht van 16 uur (fotonentelling van 50 μmol m-2 s-1) / 8 uur donker regime, tot een optische dichtheid bij 730 nm (OD730) van 1,0 (exponentiële fase) in BG11 medium27.
    2. Ent 30 ml van deze cultuur Synechocystis sp. PCC 6803 in 570 ml BG11 medium tot een OD730 van 0,05 in glazen gaswasflessen van 1 l.
    3. Laat cellen groeien met beluchting, bij 30 °C, onder een licht van 16 uur (fotonentelling van 50 μmol m-2 s-1) / 8 uur donker regime, tot een uiteindelijke OD730 van 1,0-1,5.

2. Scheiding van cyanobacteriële biomassa van de fractie van het kleine deeltje (blaasje)

OPMERKING: Ten eerste wordt het scheiden van cellen van het supernatant door centrifugale pelletering van cellen aanbevolen. Wanneer de kweekvolumes echter te groot zijn om dit mogelijk te maken, is het mogelijk om centrifugering over te slaan en direct over te gaan tot het filteren van hele culturen met behulp van capsulefiltratie (stap 2.4).

  1. Voer centrifugering uit om cellen te scheiden (het beste voor volumes tot ~ 4 L, afhankelijk van de beschikbare centrifugecapaciteit).
    1. Autoclaaf of grondig wassen en reinigen van de centrifugeflessen met type I ultrapure grade water (zie tabel met materialen), zodat er geen restzeep of ander materiaal achterblijft.
    2. Laad kweekmonsters in een passend aantal centrifugeflessen en balanceer ze.
    3. Spin culturen gedurende >10.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Als het supernatant zichtbaar troebel blijft, verhoog dan de centrifugatiecondities tot 20 minuten bij maximale snelheid en probeer het opnieuw.
    4. Decanteer of pipetteer het supernatant voorzichtig in een schoon vat en ga verder met een van de volgende filtratieopties die worden vermeld in stappen 2.2-2.4.
  2. Optie 1: spuitfiltratie uitvoeren met filters van 0,2 μm (voor monstervolumes tot ~50 ml).
    1. Vul een steriele spuit van 50 ml met een grotendeels celvrij kweekmedium en filtreer deze door een polyethersulfonfilter (PES) van 0,2 (of 0,45) μm (PO) (zie Materiaaltabel). Verzamel het filtraat in een schoon, gesteriliseerd recipiënt.
    2. Herhaal deze stap totdat het filter verstopt is (het wordt bijvoorbeeld moeilijk om met de spuit te duwen). Vervang door een nieuw filter en ga door totdat het monster grondig is gefilterd.
  3. Optie 2: voer vacuümfiltratie van 0,2 μm uit (tot ~ 4 l).
    1. Was en reinig het vacuümapparaat grondig met behulp van type I - water van ultrazuivere kwaliteit, sluit het aan op een vacuümvanger en pomp (zie Tabel met materialen).
    2. Plaats een filter van 0,2 μm met een geschikte diameter en klem het vacuümapparaat vast.
    3. Voeg een kleine hoeveelheid kweekmonster toe en zorg ervoor dat de vacuümdruk <10 psi blijft.
    4. Blijf de cultuur in kleine stapjes filteren totdat deze is voltooid. Als de filtratiesnelheid aanzienlijk vertraagt, stop dan het vacuüm en vervang het filter.
    5. Verzamel de <0,2 μm fractie met blaasjes in een schone container.
  4. Optie 3: voer 0,2 μm capsulefiltratie uit (voor monstervolumes > ~ 4 L)
    1. Reinig flexibele slangen en opvangvaten van de juiste grootte door te wassen met water en mild reinigingsmiddel. Spoel het materiaal af met gedestilleerd en gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: Voorafgaand aan het gebruik moet het materiaal worden gespoeld met type I - water van ultrazuivere kwaliteit.
    2. Plaats de te filteren cultuur op een veilige, verhoogde locatie met het uiteindelijke verzamelvat eronder. Sluit een uitstroompoort van 0,2 μm (zie Materialentabel) aan op één stuk buis en plaats deze in een opvangvat.
    3. Plaats een andere slang in het monster, begin met een zwaartekrachtsifon door met een spuit wat monster in de slang te trekken en sluit de slang aan op het capsulefilter. Gebruik de ventilatieopening om overtollige lucht af te voeren en vul de kamer met supernatant.
    4. Laat het materiaal door de capsule bewegen totdat het monster grondig is gefilterd. Als het debiet te langzaam wordt (< ~ 1/10th van het startdebiet, of druppelsgewijs naar buiten komt in tegenstelling tot een continu stromende stroom), wacht of oefen zachte kracht uit met een peristaltische pomp totdat de tegendruk toeneemt. U kunt ook de stroomsnelheden gedeeltelijk herstellen door het filter tijdelijk los te koppelen, opgehoopte biomassa van de instroomzijde terug te brengen met ultraschoon water totdat het materiaal niet langer zichtbaar troebel is en vervolgens het filtratieproces opnieuw te starten.

3. Concentratie van het blaasjesmonster

  1. Optie 1: centrifugale ultrafiltratie uitvoeren voor het concentreren van kleine (<500 ml) monsters.
    1. Spoel de 15-20 ml ultrafiltratie centrifugaalconcentrators naar keuze af met type I - ultrapure grade water.
    2. Laad de concentrators in de centrifuge en draai bij 4.400 x g bij 4 °C. Gooi de doorloop weg en herhaal deze stap nog minstens twee keer.
    3. Laad het bovennatuurlijke monster in met water gespoelde concentrators en draai onder dezelfde omstandigheden. Afhankelijk van de experimentele doelen kan het monsterfiltraat worden weggegooid of verzameld voor verdere concentratie (met concentratoren met een nominale molecuulgewichtslimiet van 3 kDa) en analyse.
    4. Herhaal deze stap totdat het monster is geconcentreerd tot een eindvolume van ~ 15-30 ml.
  2. Optie 2: voer tangentiële stroomfiltratie (TFF) uit voor het concentreren van een groot (>500 ml) monstervolume.
    1. Stel het TFF-apparaat in volgens de richtlijnen van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Bevestig een peristaltische pomp aan de inlaatleiding en plaats verstelbare klemmen op de retentaatlijn. Ontsmet de TFF zoals aanbevolen door de fabrikant en spoel het apparaat vervolgens door met 1 L water van type I - ultrazuivere kwaliteit.
      OPMERKING: De inlaat- en retentaatleidingen moeten in een schoon monsterreservoir (glazen fles) worden geplaatst. Filtraatlijn(en) moet(en) in een afvalvat of -put worden geleid.
    2. Voeg < 0,2 μm filtraat toe aan het monsterreservoir. Verhoog langzaam de pompsnelheid en tegendrukniveaus op de retentaatlijn om de output van de filtraatleidingen te verhogen.
    3. Blijf de TFF uitvoeren en vul het reservoir bij met cultuursupernatant terwijl het materiaal wordt verwijderd. Vermijd het toestaan van de inlaatleiding uit het monster tijdens de verwerking om te voorkomen dat er luchtbellen inbrengen. Zorg ervoor dat de voedingsdruk niet hoger is dan ~10 psi en dat het retentaat in een constant tempo uit de TFF terugstroomt in het reservoir.
    4. Stop met het concentreren van het monster zodra het volume in het reservoir de laagst mogelijke hoeveelheid bereikt die nodig is om de stroom in de inlaatleiding te behouden zonder luchtbellen in te brengen.
    5. Sluit de uitstroomlijn met een klem. Verwijder de tegendruk op de retentaatlijn en recirculeer het geconcentreerde supernatant gedurende ~ 10 minuten door het filter, waardoor de recirculatiesnelheid wordt teruggebracht tot 20-40 ml / min om het herstel te maximaliseren.
    6. Verplaats de retentaatlijn in een schoon vat, verwijder de inlaatleiding uit het monster en verzamel het geconcentreerde materiaal. Win eventueel achtergebleven materiaal in het monsterreservoir terug met behulp van een pipet.
    7. Filtreer het geconcentreerde supernatant door een spuitfilter van 0,2 μm (stap 2.2) om ervoor te zorgen dat er geen cellen achterblijven.
      OPMERKING: Stap 3.2.7 is optioneel.
    8. Bewaar indien nodig het eindconcentraat bij 4 °C gedurende ~ 3 weken voordat u overgaat op vesikelzuivering (stap 4).

4. Vesikel isolatie en zuivering

  1. Pellet direct door ultracentrifugatie volgens de onderstaande stappen.
    1. Plaats het geconcentreerde < 0,2 μm in een schone ultracentrifugebuis. Voeg indien nodig schone media of buffer toe om ervoor te zorgen dat de buis volledig gevuld is.
      OPMERKING: Als het uiteindelijke kweekmonster te groot is om in één buis te passen, pellet het materiaal dan in meerdere buizen om vóór de wasstappen te worden gecombineerd of pellet serieel in dezelfde buis.
    2. Creëer indien nodig een balans en draai op ~ 100.000 x g gedurende 3 uur bij 4 °C.
    3. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet. Hoewel cyanobacteriële blaasjeskorrels enige kleuring kunnen vertonen, zijn ze vaak onzichtbaar.
    4. Was het gepelletiseerde materiaal door verse kweekmedia of wasbuffer zoals 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (zie Discussie) toe te voegen aan de ultracentrifugebuis, meng door zacht pipetteren en draai opnieuw zoals in stap 4.1.2. Herhaal het wasproces een tweede keer.
    5. Resuspend de uiteindelijke pellet in verse cultuur door herhaaldelijk maar voorzichtig op en neer te pipetteren rond de bodem van de buis met een pipet van 1 ml. Breng over naar een schoon vat.
  2. Voer ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt uit.
    1. Bereid iodixanolvoorraden (zie tabel met materialen) voor door een 4x geconcentreerde versie te maken van de voor het monster gewenste bufferachtergrond (zie Discussie).
    2. Meng een deel van de 4x buffer met drie delen van 60% iodixanol bouillon om een 45% iodixanol oplossing te maken.
    3. Verdun 45% iodixanol met volumes van 1x buffer om voorraden gradiëntmedia te creëren bij 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% en 10% uiteindelijke iodixanolconcentraties.
      OPMERKING: De totale benodigde hoeveelheid varieert met de capaciteit van de ultracentrifugerotor/-buizen.
    4. Stel een ultracentrifugedichtheidsgradiënt in door zorgvuldig gelijke hoeveelheden van 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% en 0% ioxidinol in een ultracentrifugebuis te leggen, zodat het volledige volume van de buis wordt gebruikt.
      OPMERKING: Het extracellulaire blaasjesmonster dat moet worden gezuiverd, moet aan de bovenkant van de gradiënt worden geplaatst als onderdeel van de 0% iodixanollaag. Als het uiteindelijke volume van het blaasjesmonster groter is dan de grootte van de 0%-laag, meng dan elk overtollig blaasjemonster met voldoende 45% iodixanol en/of buffer om het vereiste volume van de optiprepvoorraden van 10% of hoger te genereren en gebruik deze op de overeenkomstige plaats in de gradiënt.
    5. Draai de helling op ~100.000 x g bij 4 °C gedurende 6 uur.
    6. Verzamel fracties (meestal 0,5 ml elk voor een gradiënt van ~ 4,5 ml) door zorgvuldig te pipetteren of een fractiecollector te gebruiken (zie Tabel met materialen).
    7. Bepaal de dichtheid van elke fractie (in g/ml) met behulp van een analytische balans en een gekalibreerde pipet om het gewicht van een bekend monstervolume te meten. Verwijder het monster uit de buis, bepaal het gewicht en retourneer het monster direct.
    8. Verdun afzonderlijke fracties in een nieuwe ultracentrifugebuis met schone buffer en was het materiaal zoals vermeld in stap 4.1.2-4.1.4. U kunt ook dialyse- of ultrafiltratiekolommen gebruiken om deeltjes terug te winnen.
      OPMERKING: Cyanobacteriële extracellulaire blaasjes migreren meestal naar drijvende dichtheden van ~ 1,14-1,19 g / ml in iodixanol.
  3. Bewaar de blaasjes bij 4 °C als ze binnen 1-3 weken moeten worden gebruikt. Vries de blaasjes in bij -20 °C of -80 °C indien zij niet langer dan die periode worden gebruikt.

5. Karakterisering van de geïsoleerde blaasjes

  1. Voer negatieve vlektransmissie-elektronenmicroscopie uit (zie Tabel met materialen) (TEM; deeltjesgrootte, structuur, zuiverheid).
    1. Om de beeldkwaliteit te verbeteren, gloeien het oppervlak van een voormalig gecoat TEM-raster met behulp van een gloeiafvoersysteem volgens de richtlijnen van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    2. Breng voorzichtig ~5 μL van het blaasjemonster aan en laat 5 min zitten.
      OPMERKING: Monsters met blaasjesconcentraties >109 ml-1 geven meestal de beste resultaten; meer verdunde monsters zullen weinig blaasjes per afbeelding hebben.
    3. Verwijder het monster door de rand van een raster aan te raken op een stuk schoon filtreerpapier.
    4. Pipetteer een druppel van 20-50 μL van 2% uranylacetaat (zie Materiaaltabel) op een vlak oppervlak bedekt met plastic folie en plaats het rooster er gedurende 2 minuten op drijvend.
    5. Verwijder uranylacetaat met filterpapier en drijf kort op een druppel ultrapuur water om te wassen. Herhaal de waterwas een tweede keer.
      OPMERKING: Het laatste droge raster is klaar voor visualisatie na stap 5.1.5.
  2. Voer ultradunne sectiekleuring uit voor TEM (deeltjesgrootte, interne structuur).
    1. Resuspend de pellet uit stap 4.1.5 met 1 ml 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacellodaatbuffer (pH 7) (zie materiaaltabel) en fixeer het monster gedurende 2 uur bij 4 °C.
    2. Draai bij ~100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
    3. Was de pellet voorzichtig met 0,1 M natriumcacellodaatbuffer (pH 7) en draai vervolgens gedurende 1 uur bij 4 °C op ~100.000 x g .
    4. Bevestig de pellet gedurende 1 uur met 1 ml 1% osmiumtetroxide (zie materiaaltabel) (bereid in 0,1 M natriumkactrodinebuffer) en was vervolgens zoals in stap 5.2.3.
    5. Droog het monster uit met 1 ml van een ascendantreeks ethanol (50%, 70%, 90% en twee keer in absolute ethanol) in stappen van elk 10 minuten bij 4 °C.
    6. Voeg 250 μL epoxyhars (zie materiaaltabel) gemengd met absolute ethanol (1:1) toe aan de pellet en incubeer een nacht bij 4 °C.
    7. Breng de pellet gedurende 24 uur over in 500 μL zuivere hars. Incubeer vervolgens de hars bij 65 °C gedurende 48 uur.
      OPMERKING: De hars is nu klaar voor sectie door ultramicrotoom, volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    8. Kleur de roosters met secties met 2% uranylacetaat (in 50% ethanol) gedurende 5 min. Was de glijbanen voorzichtig onder stromend gedeïoniseerd water gedurende 10-15 s elk. Plaats een druppel loodcitraat (zie Materialentabel) en beits nog eens 5 minuten.
    9. Was zoals voorheen, verwijder het water door het rooster op een filterpapier te deppen en droog de roosters aan de lucht. Visualiseer door TEM volgens de richtlijnen van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
  3. Voer nanodeeltjesvolganalyse (NTA) uit (deeltjesgrootte, concentratie).
    1. Veeg met behulp van lenspapier voorzichtig stof of zichtbaar materiaal van de optische flat. Controleer of alle O-ringen en andere afdichtingen schoon en intact zijn. Schakel het instrument in en start de software op.
    2. Vul de kamer met behulp van een schone spuit met ultrazuiver water. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
    3. Klik op Start Camera en visualiseer het optimale gebied van de kamer over de 'duimafdruk'. Pas de microscooptrap indien nodig horizontaal of verticaal aan, zodat de signaalintensiteit gelijkmatig is over het afgebeelde gebied. Verplaats het beeldgebied horizontaal ten opzichte van de vingerafdruk (naar rechts, naar de verticale lijn) en zoek een gebied in de buurt met een laag achtergrondsignaal.
    4. Schuif de schuifregelaars Schermversterking en Cameraniveau naar het maximum en verlaag vervolgens naar het laagste niveau om de zwakste deeltjes te zien.
      OPMERKING: Typische instellingen voor cyanobacteriële blaasjes gebruiken een schermversterking van 7 en cameraniveau tussen 10-12.
    5. Pas de focus zo nodig aan om ervoor te zorgen dat deeltjes ongeveer even goed zichtbaar zijn over het gezichtsveld. Blijf ultraschoon water door de kamer duwen totdat u visueel hebt bevestigd dat de kamer schoon is.
    6. Verwijder restwater uit de kamer met een andere spuit.
    7. Onderzoek een monster van de media/buffer waarin uw monster zich bevindt om de concentratie van de achtergronddeeltjes te bepalen door de kamer te vullen met media/buffer met een schone spuit van 1 ml.
    8. Selecteer Standaardmeting in de vervolgkeuzelijst SOP . Wijzig de instellingen om ten minste drie technische replica's van elk 60 s-video's te verzamelen. Druk op Script maken en uitvoeren en volg de aanwijzingen. Duw ~100 μL monster in de kamer tussen de replicaten.
    9. Wanneer de acquisitie is voltooid, verwijdert u de resterende buffer met een spuit, spoelt u 3-5 ml ultrazuiver water door de kamer en verwijdert u het resterende water.
    10. Voeg het blaasjemonster toe aan de kamer met behulp van een spuit van 1 ml en bevestig de acquisitie-instellingen. Als het aantal deeltjes niet binnen het lineaire bereik van het instrument ligt (meestal tussen 20-80 deeltjes/frame), moet het monster worden verdund of geconcentreerd. Duw ten minste 500 μL monster in de kamer voordat u gegevens verzamelt.
    11. Verzamel videogegevens zoals in stap 5.3.8 en zorg ervoor dat u de kamer reinigt met ultrazuiver water tussen verschillende monsters.
    12. Verzamel alle volgende monsters van hetzelfde organisme/experiment met behulp van identieke camera-instellingen om de vergelijkbaarheid van de gegevens te garanderen; wijzigingen in de instelling cameraniveau kunnen een aanzienlijk effect hebben op de verkregen eindwaarden.
    13. Bepaal deeltjesparameters met behulp van het analysegedeelte van de software. Selecteer Analyse > Experiment openen en laad het voorbeeldbestand. Selecteer Geselecteerde bestanden verwerken en wacht tot de analyse is voltooid. Zorg ervoor dat u dezelfde detectiedrempel gebruikt voor alle volgende monsters van hetzelfde experiment.
      OPMERKING: Omdat cyanobacteriële blaasjes vaak zwak zijn, moet de detectiedrempel meestal worden aangepast aan de meest gevoelige (laagste) waarde.
  4. Voer dynamische lichtverstrooiing (DLS) uit (deeltjesgrootte, zetapotentiaal).
    1. Filter door een poriegroottefilter van 0,2 μm voor elk monster dat in de DLS gaat om grote deeltjes die de metingen verstoren, af te schermen.
    2. Voeg 1 ml van het medium/de buffer toe aan een schone cuvette om mogelijke aggregaties of andere nanodeeltjes uit de media te onderzoeken. Plaats de cuvette met de matte kant aan de linkerkant in de micro-sampler en sluit het deksel. Laat het monster minstens 5 minuten in evenwicht houden.
    3. Voer de brekingsindex van het materiaal en de materiaalabsorptie in als deze aanzienlijk verschillen van de standaardwaarden voor water.
      OPMERKING: De materiaaleigenschappen zouden zeer weinig invloed hebben als de blaasjes kleiner zijn dan 100 nm. Bij het meten van de oppervlaktepotentiaal (zetapotentiaal) van EV's moeten blaasjes opnieuw worden gesuspendeerd in de oorspronkelijke groeimedia.
    4. Klik op het Configuratiescherm van instrumenten om de metingen te controleren en de gegevensverzameling te starten door op het groene pictogram te klikken. Als de waarden er goed uitzien en uw media/buffer geen aggregaties of andere deeltjes bevat, bent u nu klaar om uw monster te meten.
    5. Voeg 1 ml blaasjesmonster toe aan een schone cuvette en verzamel gegevens zoals vermeld in stap 5.4.4. Verzamel ten minste drie technische replicaties gedurende elk 10 minuten.
  5. Voer lipopolysaccharide (LPS) analyse uit om te bevestigen dat de Gram-negatieve EV's aanwezig zijn in het monster.
    1. Warmte denaturatie blaasjes monster bij 95 °C gedurende 10 minuten in standaard 1x Laemmli monsterbuffer (zie Tabel van materialen).
    2. Incubeer met 0,2 U type XIV-protease van Streptomyces griseus (zie materiaaltabel) bij 37 °C gedurende 30 minuten om verontreinigende glycoproteïnen te verwijderen.
    3. Afzonderlijke behandelde monsters door elektroforese op de denaturering van 16% (w/ v) SDS-polyacrylamide gels volgens het eerder gepubliceerde protocol16.
    4. Om LPS te detecteren, bevlekt u de gel met in de handel verkrijgbare kleurkits of met een aangepaste zilverkleuringstechniek28. Kwantificeer de relatieve LPS-abundantie door densitometrie-analyse van gekleurde gels volgens eerder gepubliceerde referenties29,30.

6. Metingen van de productiesnelheid van blaasjes

  1. Met behulp van nanodeeltjesvolganalyse zoals in stap 5.3, of gelijkwaardige technologie, meet u de deeltjesconcentratie in de groeimedia voor het experiment. Als er een hoog aantal deeltjes wordt gevonden, filter dan door een poriefilter van 0,1 μm en controleer het opnieuw.
    OPMERKING: Om de fout te minimaliseren, moet de media-achtergronddeeltjesconcentratie minder zijn dan 10% van de deeltjesconcentratie in culturen met de laagste dichtheid.
  2. Acclimatiseer de cultuur door cellen te laten groeien gedurende ten minste twee opeenvolgende seriële overdrachten onder de media- en omgevingsomstandigheden die gewenst zijn voor de experimenten zoals in stap 1.1.2. Culturen moeten worden overgedragen terwijl ze zich nog in de exponentiële groeifase bevinden. Ervoor zorgen dat de gemeten cultuurgroeipercentages consistent zijn tussen overdrachten; zo niet, ga dan door met het overdragen van culturen totdat de groeisnelheden reproduceerbaar zijn.
  3. Verzamel tijdsverloopmonsters bij inenting en regelmatig getimede intervallen over de groeicurve in de vroege stationaire fase. Verdeel tijdspunten om minimaal 3-4 monsters te verzamelen over het volledige bereik van exponentiële groei. Voer de volgende stappen uit om op elk tijdstip een monster te nemen.
    1. Filtreer 1 ml of meer cultuur rechtstreeks door een schoon, steriel spuitfilter van 0,2 μm en bewaar het filtraat om de blaasjesconcentratie te meten zoals in stap 5.3. Vries de tijdsverloopmonsters indien gewenst in. Gebruik relatieve fluorescentie om de groeidynamiek van de cultuur te volgen.
    2. Sla een monster van de hele cultuur op om de populatiegrootte te bepalen met behulp van een methode die geschikt is voor het organisme (flowcytometrie; koloniebeplating; of anderszins).
  4. Verkrijg metingen van cellen en blaasjesachtige deeltjes (per ml) op elk tijdstip.
  5. Identificeer de tijdspunten die plaatsvonden tijdens de exponentiële groeifase. Om r te berekenen, het aantal blaasjes geproduceerd per cel per generatie, tussen twee punten tijdens exponentiële groei (meestal het begin en einde van het tijdsverloop), gebruikt u de vergelijking in aanvullend bestand 1.
    OPMERKING: Deze methode is alleen geldig tijdens steady-state groeiomstandigheden; de onderliggende aannames en de afleiding van de berekening worden gedetailleerd beschreven in referentie14.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 geeft een overzicht van het cyanobacteriële blaasjesisolatieproces, waarbij de belangrijkste aspecten van het hier beschreven protocol worden benadrukt. Van bijzonder belang zijn de stappen die de scheiding van cyanobacteriële biomassa van de fractie van kleine deeltjes (blaasjes), het concentreren van het blaasjemonster en de isolatie en zuivering van de blaasjes beschrijven (figuur 1, stappen 2 tot en met 4), die van cruciaal belang zijn voor het verkrijgen van reproduceerbare preparaten van blaasjes. Figuur 2 toont representatieve resultaten van de isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes van de cyanobacterie Synechocystis sp. PCC 6803. Van het buitenmembraan van deze cyanobacterie is aangetoond dat het carotenoïden31 bevat, die een karakteristieke oranje kleuring verlenen aan blaasjesmonsters die zijn verzameld door directe pelleting door ultracentrifugatie (figuur 2A). Zodra de blaaspellet opnieuw is gesuspendeerd, kunnen blaasjes worden onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), hetzij door monsters negatief te kleuren met uranylacetaat (figuur 2B) of door observatie van ultradunne secties (figuur 2C). De grootteverdeling en -concentratie van blaasjes kunnen worden beoordeeld met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) (figuur 2D) en nanodeeltjesvolganalyses (NTA) (figuur 2E). Met het beschreven protocol werden typisch ~3,5 ± 1,0 x 108 nanodeeltjes per ml verkregen in een exponentieel groeiende cultuur van Synechocystis sp. PCC 6803 bij een OD730 van 1,0. Biochemische analyses van geïsoleerde EV's kunnen worden uitgevoerd om de fysieke karakterisering van de geïsoleerde blaasjes aan te vullen. Als voorbeeld werden gezuiverde Synechocystis sp. PCC 6803 blaasjes gescheiden op een SDS-polyacrylamide gel en gekleurd voor lipopolysacchariden (LPS; Figuur 2F). Aangezien LPS specifiek zijn voor het buitenmembraan32, kan LPS-detectie de aanwezigheid van membraangebonden blaasjes valideren en dienen als een marker voor het analyseren van het relatieve blaasjegehalte tussen preparaten van dezelfde stam33. Inspectie van de relatieve abundantie van LPS met een laag versus hoog molecuulgewicht kan wijzen op veranderingen in de samenstelling van de blaasjes tussen monsters34,35.

figure-results-1
Figuur 1: Experimentele procedures die worden gebruikt voor cyanobacteriële EV-isolatie en -karakterisering. Schematische representaties van groeiculturen (1) en scheiding van cyanobacteriële biomassa uit het groeimedium (2). Celvrije monsters met blaasjes worden geconcentreerd (3) en vervolgens worden de EV's geïsoleerd en gezuiverd (4). Afhankelijk van de toepassing kunnen blaasjespreparaten worden gekarakteriseerd met behulp van een of een combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA), dynamische lichtverstrooiing (DLS) en lipopolysaccharide (LPS) profilering (5). RT, kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve resultaten van de extracellulaire vesikelisolatie en karakterisering voor de cyanobacterie Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Foto van de extracellulaire blaaskelkorrel (EV-pellet) verkregen na ultracentrifugatie van het geconcentreerde celvrije extracellulaire medium uit een Synechocystis sp. PCC 6803-cultuur van 600 ml, gekweekt tot een OD730 van 1,0-1,5. Let op de typische oranje kleuring van de blaasjeskorrel afgeleid van de carotenoïden in het buitenmembraan. (B,C) Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) foto's van negatief gekleurde (B) en ultradunne secties (C) van Synechocystis sp. PCC 6803 blaasjesmonsters. Schaalbalken: respectievelijk 200 nm en 50 nm. Monsters werden gevisualiseerd op een transmissie-elektronenmicroscoop die werkte op 80 kV. (D) Typische dynamische lichtverstrooiing (DLS) plot die de verdeling van het blaasjevolume weergeeft als functie van de blaasdiameter (in nm). Gekleurde lijnen geven gegevens aan van drie technische replicaatmetingen van hetzelfde monster. (E) Representatieve nanodeeltjes tracking analyse (NTA) gegevens van Synechocystis extracellulaire vesikel grootteverdeling (in nm). De zwarte lijn geeft het gemiddelde van drie technische replicaties aan en de rode lijnen vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. (F) Lipopolysacchariden (LPS) profiel werd gedetecteerd na het scheiden van het blaasjepreparaat door elektroforese op een 16% (w / v) SDS-polyacrylamide-gel en kleuring met een commerciële LPS-kleuringskit. LPS met een laag en hoog molecuulgewicht, overeenkomend met respectievelijk ruwe en gladde LPS-vormen, zijn detecteerbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Vergelijking om r te berekenen. Het aantal blaasjes dat per cel per generatie tussen twee punten wordt geproduceerd tijdens exponentiële groei (meestal het begin en einde van het tijdsverloop) wordt bepaald met behulp van deze vergelijking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algemene overwegingen
Het protocol (figuur 1) wordt gepresenteerd als een reeks opties om te benadrukken dat er geen 'one-size-fits-all'-methode is voor het werken met cyanobacteriële extracellulaire blaasjes. Geïnteresseerde onderzoekers kunnen de secties van dit protocol gebruiken die compatibel en geschikt zijn voor hun specifieke modelorganisme, experimentele vragen / doelen en beschikbaarheid van apparatuur. Alle blaasjesisolatiebenaderingen brengen compromissen met zich mee en zullen onvermijdelijk resulteren in een zekere mate van vooringenomenheid. Hoewel men moet proberen dit waar mogelijk te minimaliseren, is de meest cruciale overweging om ervoor te zorgen dat de gebruikte gedetailleerde methodologie wordt gerapporteerd volgens de juiste MISEV-richtlijnen (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36.

Cultuurgroei
Cyanobacteriële culturen kunnen gemakkelijk worden verkregen uit een van de vele cultuurcollecties die wereldwijd beschikbaar zijn. Enkele voorbeelden zijn de Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankrijk), de Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Parijs, Frankrijk) en het Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). De cyanobacteriële stam naar keuze moet worden gekweekt in de juiste medium- en omgevingsomstandigheden, die aanzienlijk variëren tussen verschillende stammen. Een lijst van veelgebruikte media voor de teelt van cyanobacteriën is te vinden op websites van cultuurcollecties of andere publicaties 37,38,39.

Het werken met cyanobacteriële extracellulaire blaasjes biedt een aantal unieke uitdagingen in vergelijking met de methodologieën die worden gerapporteerd voor veel typische modellaboratorium heterotrofen. Cyanobacteriële culturen hebben blaasjesconcentraties van ordes van grootte lager dan die gevonden in andere microben zoals Escherichia coli 14,16,40. Deze verschillen, vermoedelijk als gevolg van lagere celdichtheden en/of blaasjesproductiesnelheden, betekenen dat relatief grote culturen (~1-20 L of meer) nodig kunnen zijn om voldoende materiaal op te leveren voor bulkanalyses. Zo worden onderzoekers aangemoedigd om blaasjesopbrengsten van kleinschaligere culturen te testen om te bepalen hoeveel materiaal nodig is om hun gewenste einddoelen te bereiken. Het belang om vast te stellen of de media die voor het experiment worden gebruikt een detecteerbare deeltjesachtergrond hebben, moet ook worden benadrukt voordat met een experiment wordt begonnen, omdat dat materiaal mogelijk de kwantificering van de blaasjespopulatie kan verstoren, de gevoeligheid van de concentratie / grootte van het blaasje kan verminderen of de uiteindelijke blaaskelpreparaten kan verontreinigen.

Een andere uitdaging voor het veld is dat niet alle cyanobacteriën goed of helemaal niet groeien in pure cultuur. Totdat axeen wordt weergegeven, kunnen interpretaties van fysieke blaasjeskenmerken, productiesnelheden of inhoud niet noodzakelijkerwijs leiden tot duidelijke conclusies over blaasjes die door een bepaalde stam in de gemeenschap worden geproduceerd. Onderzoekers wordt ook geadviseerd om te overwegen welke andere soorten deeltjes aanwezig kunnen zijn en mogelijk kunnen worden verward met blaasjes door specifieke nanodeeltjesanalysetools, die niet noodzakelijkerwijs onderscheid kunnen maken tussen verschillende deeltjestypen. Het kan bijvoorbeeld essentieel zijn om te controleren of de gebruikte stam geen profaag heeft, hetzij via genoomsequencing, inductietests of andere middelen, hetzij geen andere soorten deeltjes vrijgeeft. In onze ervaring hebben de meeste cyanobacteriële blaasjes een diameter van <0,2 μm, maar wanneer men naar een nieuwe stam of groeiconditie kijkt, moet men bevestigen of het gebruik van een poriegroot filter van 0,45 μm de grootteverdeling van gezuiverde deeltjes verandert.

Veel aspecten van kweekomstandigheden kunnen de blaasjesproductie en de inhoud ervan beïnvloeden41,42. Daarom moeten de fysische en chemische omstandigheden die worden gebruikt voor kweekgroei (met inbegrip van lichtinstraling, temperatuur en mediasamenstelling) zoveel mogelijk worden gedocumenteerd en gecontroleerd om de reproduceerbaarheid van de resultaten te waarborgen. Bij elke chemische analyse van de inhoud van de blaasjes moet rekening worden gehouden met de samenstelling van de achtergrond, met name bij het uitvoeren van high-throughput-analyses in de stijl van 'omics'. Dit kan vooral van cruciaal belang zijn bij het gebruik van ongedefinieerde media, zoals die op basis van een natuurlijke zeewaterachtergrond of aangevuld met gistextract of trypton. Het gebruik van een gedefinieerd groeimedium kan de voorkeur hebben, afhankelijk van de experimentele doelen.

Onderzoekers moeten de cultuurgroeidynamiek op regelmatige tijdstippen zorgvuldig volgen om ervoor te zorgen dat ze weten waar in de groeifase een bepaalde batchcultuur zich bevindt en niet alleen monsters verzamelen na een willekeurige hoeveelheid tijd. De samenstelling van blaasjes kan variëren tussen groeifasen, met name tussen exponentiële en stationaire fasen41,42. Bijvoorbeeld, ten minste een fractie van blaasjes bemonsterd in de stationaire fase kan ontstaan uit een ander cellulair mechanisme, zoals cellysis, dat niet zal optreden tijdens exponentiële groei. Hoewel dit nog steeds van groot biologisch belang kan zijn, is het essentieel om het monster te kennen. Als een cyanobacteriële cultuur de gewenste groeifase bereikt op een moment dat het niet mogelijk is om direct over te gaan tot monsterconcentratie, wordt aanbevolen de cellen onmiddellijk van de <0,2 μm-fractie te scheiden (met centrifugering en/of directe filtratie van 0,2 μm) en vervolgens het celvrije filtraat bij 4 °C op te slaan. Het materiaal kan op deze manier dagenlang worden opgeslagen met weinig tot geen merkbare invloed op de concentratie of grootteverdeling van blaasjes.

Vesikelzuiveringen
De frequente noodzaak om blaasjes te isoleren van culturen met een aanzienlijk volume is van vitaal belang in de cyanobacteriële blaasjesisolatieworkflow. Bij het werken met grotere hoeveelheden materiaal moeten de blaasjes worden geconcentreerd voordat ze stroomafwaarts scheidingsworkflows uitvoeren. Concentrators (tangentiële flowfiltermembranen of centrifugaalkolommen) met een nominale molecuulgewichtslimiet van 100 kDa worden over het algemeen geadviseerd, omdat ze scheiding mogelijk maken van oplosbaar materiaal met een laag molecuulgewicht terwijl de concentratietijden redelijk blijven, maar 30 kDa-filters worden ook vaak met succes gebruikt. Hoewel verschillende niet-op ultracentrifugatie gebaseerde methoden voor het zuiveren van blaasjes (bijv. Grootte-uitsluitingschromatografie, microfluïdische systemen, affiniteitsvangtechnieken en op neerslag gebaseerde benaderingen) populair worden in het extracellulaire blaasjesveld, kunnen deze benaderingen in onze ervaring resulteren in verminderde opbrengsten en zijn ze meestal onverenigbaar met de benodigde cultuurvolumes.

Onderzoekers moeten rekening houden met de samenstelling van de iodixanolachtergrond en de was- / resuspensiebuffers die worden gebruikt tijdens de zuivering van blaasjes om ervoor te zorgen dat ze compatibel zijn met de gewenste downstream-toepassingen. In veel gevallen kan het uiteindelijke blaasjesmonster worden geresuspendeerd in groeimedia of een gedefinieerde buffer die qua samenstelling vergelijkbaar is met het groeimedium (bijvoorbeeld natuurlijk versus kunstmatig zeewater). Dit is echter mogelijk niet mogelijk met mariene cyanobacteriële blaasjes, die verdere experimentele manipulatie voor analyse vereisen, omdat hoge zoutconcentraties vergelijkbaar met zeewaterniveaus veel enzymatische reacties kunnen remmen. In dergelijke gevallen werken standaard laboratoriumbuffers zoals 0,2 μm gefilterd, 1x PBS meestal goed voor het handhaven van de stabiliteit van mariene cyanobacteriële blaasjes en kunnen ze meer compatibel zijn met downstream experimentele processen.

Dichtheidsgradiëntzuivering kan als optioneel worden beschouwd, afhankelijk van de experimentele doelen en de samenstelling van de cultuur, maar wordt sterk aanbevolen voor het produceren van een strikter zuiver en reproduceerbaar monster. EV-populaties zijn heterogeen en kunnen worden gevonden in een reeks drijvende dichtheden, die verder variëren per stam, groeiomstandigheden en andere factoren 4,5,6. De hierboven genoemde dichtheden vertegenwoordigen die typisch worden gevonden voor blaasjes uit cyanobacteriële culturen en veldmonsters in iodixanol, maar de resultaten in andere stammen kunnen variëren. Andere dichtheidsgradiëntmaterialen zoals sucrose en CsCl kunnen worden gebruikt voor blaasjes, maar ze zullen migreren naar verschillende drijvende dichtheden in deze achtergronden. Verschillende gradiëntmedia-achtergronden kunnen het herstel van lipide-ingesloten virussenbeïnvloeden 43 en kunnen mogelijk het herstel van blaasjes van verschillende stammen beïnvloeden.

Blaasjes kunnen op meerdere punten verloren gaan door de blaasjesisolatie en het gradiëntzuiveringsproces dat hier wordt beschreven, waardoor de opbrengst wordt verminderd en de hoeveelheid uitgangsmateriaal wordt verhoogd die nodig is om een bepaalde uiteindelijke blaasjesopbrengst te bereiken voor downstream-toepassingen. Bijzondere voorzichtigheid is geboden bij het werken met blaasjeskorrels na ultracentrifugatie. Hoewel sommige cyanobacteriële blaasjes carotenoïden of andere verbindingen kunnen bevatten die blaasjesmonsters een zekere mate van pigmentatie kunnen geven (figuur 2), wordt, afhankelijk van de stam of hoeveelheid materiaal, niet noodzakelijkerwijs verwacht dat het de blaasjeskorrel direct kan visualiseren. Houd er rekening mee waar de pellet naar verwachting zal worden gegeven aan het type centrifugerotor dat wordt gebruikt. Indien mogelijk wordt voorgesteld om gezuiverde blaasjesmonsters te onderzoeken door middel van elektronenmicroscopie om de samenstelling van het uiteindelijke teruggewonnen materiaal te verifiëren.

De impact van bewaarcondities op blaasjes en hun inhoud blijft een open vraag. Hoewel het is gebleken dat de opslag geen opmerkelijk effect heeft op de grootte of concentratie van cyanobacteriële blaasjes14, kan de functionaliteit van geïsoleerde blaasjespreparaten in de loop van de tijd veranderen44. Hoewel vries-/dooicycli waar mogelijk moeten worden vermeden, lijkt de impact van vriesmonsters op het totale aantal blaasjes en de totale grootte van blaasjes minimaal te zijn. Men moet zich bewust zijn van het potentieel voor vries-dooicycli om de samenstelling van de blaasjesinhoud te beïnvloeden, zoals de lengte van vesikel-geassocieerde nucleïnezuren of de stabiliteit van eiwitten.

Blaasjes van field samples
De huidige methoden voor het isoleren van extracellulaire blaasjes uit natuurlijke aquatische omgevingen zijn conceptueel en operationeel vergelijkbaar met die welke hier worden beschreven voor culturen met een groot volume. Toch kunnen ze nog grotere hoeveelheden materiaal vereisen. Dergelijke veldmonsters kunnen het verzamelen, filteren en concentreren van honderden tot duizenden liters water omvatten om voldoende materiaal voor analyse te verkrijgen. Afhankelijk van de troebelheid van het gebruikte monster kan het nodig zijn een of meer voorfiltratiestappen vóór het filter van 0,2 μm in te bouwen. Het specifieke TFF-apparaat dat wordt gebruikt, moet geschikt zijn om met dergelijke grote volumes te werken in een redelijke hoeveelheid tijd (idealiter in de orde van uren) en zonder overmatige druk op het monster uit te oefenen. In de praktijk gaat het vaak om het gebruik van een veel groter totaal oppervlak dan kan worden toegepast op op cultuur gebaseerde monsters, evenals buizen met een grotere diameter om verhoogde stroomsnelheden mogelijk te maken. Dit grotere filteroppervlak zal waarschijnlijk leiden tot een marginale toename van deeltjesverliezen in vergelijking met kleinere TFF-opstellingen en een groter eindvolume concentraat; deze zorgen moeten echter worden afgewogen tegen overwegingen van de totale verwerkingstijd. Voor situaties zoals een uitgebreide oceanografische cruise waarbij monsters vele dagen na de bemonstering niet terugkeren naar een laboratorium, raden we aan om de eerste 0,2 μm filtratie- en TFF-stappen in het veld uit te voeren. Dit kleinere volume geconcentreerd materiaal kan vervolgens worden opgeslagen bij 4 °C of -80 °C aan boord (afhankelijk van beschikbaarheid en downstream analytische overwegingen) totdat het wordt teruggebracht naar het laboratorium voor de eindverwerking.

Isolatie en scheiding van extracellulaire blaasjes van andere kleine deeltjes, zowel organisch als anorganisch, kan een uitdaging zijn en methoden voor het scheiden van verschillende deeltjes zijn nog niet perfect. Bijvoorbeeld, iodixanol dichtheid gradiënten kunnen niet gemakkelijk scheiden alle klassen van blaasjes en virussen aanwezig in een bepaald monster. Omdat de soorten verstorende deeltjes en hun fysieke eigenschappen zullen variëren tussen bemonsteringslocaties, is het momenteel onmogelijk om een protocol te bieden dat alle klassen van kleine aquatische deeltjes robuust zal verdelen. Vallen en opstaan zijn essentieel en experimenten met het iodixanol-bereik dat wordt gebruikt in de gradiënt- en ultracentrifugatieomstandigheden zijn vereist om de scheiding te maximaliseren; een verzameling kleinere volume, meer fijn opgeloste dichtheidsfracties kan ook nodig zijn. Afhankelijk van de context kan het gebruik van CsCl-gradiënten in plaats van iodixanol helpen bij het scheiden van omgevingsdeeltjes45. Toch kan de verandering in osmotische omstandigheden leiden tot vooroordelen in de uiteindelijke teruggewonnen producten, zoals hierboven besproken.

Vesicle karakterisering
Nanodeeltjesanalyse-instrumenten zijn nog niet routinematig beschikbaar in microbiologische laboratoriumomgevingen, maar worden steeds meer beschikbaar. Alle methodologieën hebben voor- en nadelen, en we maken geen specifieke goedkeuring van één platform als beter dan alle andere voor cyanobacteriële blaasjeswerk; ze hebben inderdaad allemaal specifieke afwegingen met betrekking tot kosten, resolutie, gebruiksgemak, detectielimieten, compatibiliteit met verschillende groeimedia / bufferachtergronden en reproduceerbaarheid van gegevens. Naast instrumenten op basis van nanodeeltjesvolganalyse die hierboven zijn beschreven, kunnen andere benaderingen, waaronder nanoflowcytometrie, microfluïdische resistieve pulsdetectie en instelbare resistieve pulsdetectie, worden toegepast46,47. Gebruikers moeten voorzichtig zijn om de details van hun beschikbare instrumentatie te leren en te controleren of het goed werkt met hun systeem, omdat we problemen hebben ondervonden bij het gebruik van sommige platforms met op zeewater gebaseerde media. We moedigen het veld aan om te evolueren naar kwantitatieve karakterisering van de grootte van het blaasje, de concentraties en de productiesnelheden. Het meten van blaasjesconcentraties op basis van fundamentele deeltjes per ml, en niet in termen van eiwitgehalte of andere metrieken, zal de integratie van blaasjes in meer kwantitatieve kaders mogelijk maken en onderlinge vergelijkingen tussen stammen en omstandigheden mogelijk maken. Verdere inspanningen om het vermogen om concentratiemetingen voor deeltjes van < 100 nm te kalibreren te verbeteren, zijn nodig.

Het feit dat vesikelproductiesnelheidsmetingen rechtstreeks worden uitgevoerd vanuit 0,2 μm gefilterd cultuursupernatant om deeltjesverliezen te minimaliseren, zou worden geassocieerd met andere zuiveringsstappen die hierboven zijn beschreven. Dit betekent echter wel dat de benadering niet noodzakelijkerwijs onderscheid maakt tussen werkelijke extracellulaire blaasjes en andere kleine deeltjes die in de culturen worden aangetroffen. Alleen het tellen van deeltjes binnen specifieke groottebereiken (bijv. 50-250 nm diameter) kan helpen sommige uitschieters uit te sluiten, maar visuele bevestiging dat gepelleteerde <0,2 μm cultuurinhoud membraangebonden blaasjes lijken te zijn (door TEM of andere benaderingen) is nodig om specifiek te kunnen beweren dat men de productie van blaasjes meet in tegenstelling tot de productie van blaasjesachtige deeltjes.

Een essentiële factor bij de karakterisering van blaasjes is ervoor te zorgen dat het blaasjemonster wordt geanalyseerd in het juiste lineaire gevoeligheidsbereik van het nanodeeltjesanalyseapparaat. Wanneer een monster te geconcentreerd is, is het eenvoudig om dat materiaal met een schone buffer te verdunnen en opnieuw te analyseren. Aan de andere kant kan de relatief lage cel- en/of blaasjesdichtheid van sommige cyanobacteriële culturen soms blaasjespreparaten opleveren die onder de detectielimieten van sommige instrumenten liggen. In gevallen waarin dit gebeurt met bulkblaasjeszuiveringen, kan men overwegen om grotere volumeculturen te kweken, het uiteindelijke materiaal opnieuw te pelleteren en opnieuw uit te geven in een kleiner volume, of te evalueren of er een stap in het isolatieproces is waarbij buitensporige verliezen optreden en kunnen worden beperkt. Bij het meten van de productiesnelheden van blaasjes zijn de oplossingen niet noodzakelijkerwijs zo eenvoudig. Monsters kunnen indien nodig worden geconcentreerd, maar de eerste moet zien of aanpassingen aan de media kunnen leiden tot hogere celdichtheden of dat voldoende geconcentreerde monsters kunnen worden verkregen uit latere tijdstippen tijdens de exponentiële fase waar de concentraties hoger zullen zijn.

Beperkingen
Zoals met elk protocol, heeft blaasjesisolatie met behulp van deze benaderingen duidelijke beperkingen. Deze benaderingen vertrouwen niet op hun garantie dat een volkomen zuivere bereiding van blaasjes zal worden geïsoleerd. Zowel culturen als veldmonsters kunnen andere materialen bevatten, die op dezelfde manier migreren als blaasjes in dichtheidsgradiënten. Toch zijn dit soort aanvullende zuiveringsmethoden op zijn minst essentieel voor het waarborgen van striktheid en reproduceerbaarheid van blaasjesanalyse. Hoewel we blaasjesisolatiebenaderingen beschrijven in de context van cyanobacteriën, zullen culturen van veel andere microben ook blaasjes bevatten in relatief lage concentraties, en de hier beschreven procedures zouden algemeen toepasbaar moeten zijn. Verwacht wordt dat deze methoden niet als een permanent protocol zullen dienen, maar in plaats daarvan als een startpunt voor het stimuleren van toekomstige vooruitgang in het werken met extracellulaire blaasjes van verschillende microben. Toekomstige inspanningen zijn nodig om deze methoden samen te voegen met andere benaderingen, zoals grootte-uitsluitingskolommen of asymmetrische veldstroomfractionering om de discriminatie en scheiding van verschillende categorieën kleine deeltjes uit culturen en omgevingsmonsters te verbeteren. We zijn ook hoopvol dat deze technieken kunnen blijven evolueren naast verbeteringen in nanodeeltjeskarakteriseringstechnologieën om heterogeniteit binnen blaasjespopulaties, hun inhoud en hun exacte functionele rollen in de omgeving te onderzoeken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de steun van de i3S Scientific Platforms "Biointerfaces and Nanotechnology", en "Histology and Electron Microscopy", een lid van het nationale infrastructuur Portugese Platform voor Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). We bedanken ook Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Universiteit van Córdoba, Spanje) voor het helpen optimaliseren van het ultradunne sectiekleuringsprotocol voor TEM, en Dr. Cecília Durães en Dr. Ana Rita Pinto (Universiteit van Porto, Portugal) voor de analyse van het volgen van nanodeeltjes.

Dit werk werd gefinancierd door de Amerikaanse National Science Foundation (OCE-2049004 aan SJB), door Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fondsen via het COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, en door Portugese fondsen via Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in het kader van het project POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 aan PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia wordt ook zeer erkend voor de PhD fellowship SFRH / BD / 130478/2017 (SL) en FCT Investigator grant IF / 00256/ 2015 (PO). M.C.M.-M. werd ondersteund door een Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (re-integratiepanel) binnen het Horizon 2020-kaderprogramma (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4Thuis gemaakte buffer---Standaard was-/opslagoplossing die kan worden gebruikt met blaasjes; kan in het laboratorium worden gemaakt of commercieel worden gekocht
2% Uranyl acetate-oplossingElectron Microscopy Sciences22400-2Negatieve kleuring - TEM
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0747Denaturatie van blaasjesmonster vóór proteolyse, vereist voor lipopolysacchariden (LPS) kleuring
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa)MerckUFC9100XXAlternatieve optie voor centrifugale ultrafiltratie
BG11 mediumThuis gemaakt medium---Medium voor het kweken van Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, koper. CF200-CuElectron Microscopy Sciences71150Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) raster
easiGlow Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000Commerciële TEM raster glow discharger
EMbed 812 epoxyharsElectron Microscopy Sciences14120Ultradunne secties - TEM
Filterhouder voor vacuümsysteemThermo Fisher Scientific300-4000Herbruikbare eenheden met filtermembraanondersteuningsplaten
Glutaraldehyde  Grade ISigma-AldrichG5882-10X1mlUltradunne secties - TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) natriumzout]Sigma-AldrichH7006Buffermiddel voor cyanobacteriële groeimedia
Lead Citrate, TrihydrateElectron Microscopy Sciences17800Kleurstof voor gebruik in elektronenmicroscopie
Macrosep Advance Centrifugal Devices met Omega Membrane 100KPallMAP100C36Voor centrifugale ultrafiltratie van kleine volume monsters
Millipore Pellicon 3 TFF ModuleEMD MilliporeXX42P0060 of XX42P0080Alternatieve TFF-optie voor het concentreren van grote volumes monsters
Milli-Q Referentie WaterzuiveringssysteemMerckZ00QSV0WWWaterzuiveringssysteem voor het verkrijgen van type I ultrapuur water
NanoSightMalvern PanalyticalLM14 of NS300Analyse van nanoparticle tracking
Optima L80 XP UltracentrifugeBeckman CoulterL80 XPUltracentrifuge (of soortgelijk model)
OptiPrep / IodixanolSigma-AldrichD1556Dichtheidsgradient media
Osmium Tetroxide Reagent PlusSigma-Aldrich201030Ultradunne secties - TEM
Pall Centramate PE TFF houderPall CorporationFS002K10TFF-module geschikt voor het concentreren van 10s-100s van L monster; vereist extra 30 of 100 kDa filtermodules om te schalen met uw geschatte volumes
Peristaltische pomp Masterflex L/SCole-Parmer07559-07Pomp voor het aansturen van grootschalige TFF-modules
Piston Gradient FractionatorBiocomp Instruments152-001Geautomatiseerde dichtheidsgradiënt fractionering
Polycarbonaat buizen voor de 70 Ti rotorBeckman Coulter355618Herbruikbare ultracentrifuge polycarbonaat aluminium buizen met dopsamenstelling
Pro99 mediumThuis gemaakt medium---Medium voor het kweken van Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain KitThermo Fisher ScientificP20495LPS kleuring
SN mediumThuis gemaakt medium---Medium voor het kweken van cyanobacteriële mariene stammen zoals Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrateSigma-AldrichC0250-100GBuffermiddel bij de bereiding van blaasjes monsters voor TEM
SW32Ti schommelende emmer rotorBeckman Coulter369650Ultracentrifuge rotor, houdt 6x ~40 mL buizen; goed voor pelleting van bulk materiaal
SW60Ti schommelende emmer rotorBeckman Coulter335650Ultracentrifuge rotor, houdt 6x ~4,5 mL buizen; goed voor gradiënt zuiveringen en uiteindelijke blaasjes wassingen
Spuit 1mL LuerBD Plastipak303172Voor blaasjes isolatie en het laden van monsters in nanparticle tracking analyse (NTA) apparatuur
Spuitfilter 0,2 µmPall Corporation4602Voor blaasjes isolatie uit culturen
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropaansulfonzuur]Sigma-AldrichT5130Buffermiddel voor cyanobacteriële groeimedia
Transmissie-elektronenmicroscoopJEOLJEM-1400Of soortgelijke microscoop
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium RotorBeckman Coulter337922Ultracentrifuge rotor, houdt 8x ~39 mL buizen; goed voor pelleting van bulk materiaal
Type XIV protease van Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147Enzym voor proteolyse van EV's eiwitten, vereist voor LPS kleuring
UltraClear buizen voor de SW32Ti rotorBeckman Coulter344058Ultracentrifugebuizen voor eenmalig gebruik
UltraClear buizen voor de SW60Ti rotorBeckman Coulter344062Ultracentrifugebuizen voor eenmalig gebruik
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PCRMC Products,  Boeckeler Instruments75501Microtome voor ultradunne secties - TEM
Universele 320 R centrifugeHettichZ654736Deze of een andere soortgelijke algemene tafel-/vloerstand centrifuge kan worden gebruikt voor het pelleteren van cellen
VacuümapparaatKNF NeubergerN026.3 AT.18Of een soortgelijke vacuümpomp en -val
Vivaflow 200 100.000 MWCO PESSartoriusVF20P4TFF-module, goed voor 2-3L. U kunt verschillende modules verbinden voor een hoger volume (figuur 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0,2/0,2µm)Cytiva

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
  4. Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
  5. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  6. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
  7. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  8. Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
  9. Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824(2013).
  10. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  11. Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
  12. Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963(2021).
  13. Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What's in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
  14. Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183(2014).
  15. Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
  16. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  17. Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
  18. Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
  19. Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129(2020).
  20. Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359(2019).
  21. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146(2017).
  22. Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  23. Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
  24. Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833(2000).
  25. Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628(1999).
  26. Charpy, L., Larkum, A. W. D. Bulletin de l'Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
  27. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  28. Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
  29. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  30. Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
  31. Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
  32. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
  33. McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
  34. Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
  35. Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
  36. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  37. Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431(2021).
  38. Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , Academic Press. 3-27 (1988).
  39. Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764(2018).
  40. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
  41. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).
  42. Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
  43. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  44. Dell'Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732(2021).
  45. Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
  46. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079(2021).
  47. Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van blaasjesPurificatie van blaasjesTangenti le stroomfiltratieDichtheidsgradi nt ultracentrifugatieNanodeeltjes trackingDynamische lichtverstrooiingTransmissie elektronenmicroscopieBlaasjes uit milieu monstersGrootteverdeling van blaasjes

Gerelateerde artikelen