Methodenartikel

Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63493

⸱

17 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.

Samenvatting

Next-generation sequencing is steeds belangrijker geworden in de klinische toepassing bij de bepaling van genetische varianten. In de pre-implantatie genetische test heeft deze techniek zijn unieke voordelen in schaalbaarheid, doorvoer en kosten. Voor de pre-implantatie genetische test voor aneuploïdie-analyse biedt het hier gepresenteerde semiconductor-based next-generation sequencing (NGS) systeem een alomvattende aanpak om structurele genetische varianten te bepalen met een minimale resolutie van 8 Mb. Van monsteracquisitie tot het eindrapport, het werkproces vereist meerdere stappen met nauwe naleving van protocollen. Aangezien verschillende kritieke stappen het resultaat van versterking, kwaliteit van de bibliotheek, dekking van gelezen gegevens en uitvoer van gegevens kunnen bepalen, zou beschrijvende informatie met visuele demonstratie anders dan woorden meer details kunnen bieden aan de werking en manipulatie, wat een grote impact kan hebben op de resultaten van alle kritieke stappen. De hierin gepresenteerde methoden zullen de procedures weergeven die betrokken zijn bij de versterking van het hele genoom (WGA) van biopsie Trophectoderm (TE) -cellen, genomische bibliotheekconstructie, sequencerbeheer en ten slotte het genereren van rapporten met kopieernummervarianten.

Inleiding

Aneuploïdie is de afwijking in het aantal chromosomen door de aanwezigheid van een of meer extra chromosomen of de afwezigheid van een of meer chromosomen. Embryo's die een vorm van aneuploïdie dragen, zoals het verlies van één X-chromosoom (syndroom van Turner), extra kopieën van autosomen, zoals trisomieën van autosoom 21 (syndroom van Down), 13 (Patau-syndroom) en 18 (Syndroom van Edwards), of extra geslachtschromosomen zoals 47, XXY (Klinefelter-syndroom) en 47, XXX (Triple X-syndroom), kunnen overleven met geboorteafwijkingen1. Aneuploïdie is de primaire oorzaak van miskramen in het eerste trimester en falen van in vitro fertilisatie (IVF)2. Er wordt gemeld dat het aneuploïdiepercentage kan variëren van 25,4% -84,5% door de verschillende leeftijdslagen van de natuurlijke cyclus en de medicinale controlegroep in IVF-praktijk3.

Next-generation sequencing-technologie wordt steeds meer toegepast bij de klinische bepaling van genetische informatie; het biedt praktische toegang tot genoomsequentie met efficiëntie en hoge doorvoer. Met name de volgende generatie sequencing zorgde ook voor een revolutie in de diagnose van aandoeningen met genetische factoren en tests voor abnormiteit in het genoom4. Met behulp van halfgeleidersequencingtechnologie om chemische signalen direct over te brengen in sequencing bioreactie in digitale gegevens, biedt het op halfgeleiders gebaseerde sequentiesysteem een directe, realtime detectie van sequentiegegevens in 3-7 h 5,6.

In een IVF-procedure onderzoekt pre-implantatie genetisch testen (PGT) het genetische profiel van het embryo voordat het in de baarmoeder wordt overgebracht om de IVF-uitkomst te verbeteren en het risico op genetische aandoeningen bij pasgeborenen te verminderen 1,7. In PGT in combinatie met NGS-technieken wordt genetisch materiaal geëxtraheerd uit minder dan 10 cellen versterkt met amplificatiekits voor het hele genoom of een onafhankelijk ontwikkeld reagens voor amplificatie van het hele genoom. Dit vereist slechts één stap in de amplificatiefase en vereist geen pre-amplificatie om amplificatieproducten voor het hele genoom te verkrijgen. Primers of panelen voor copy number variant en speciale gene loci sequencing worden ontworpen en toegepast in de geconstrueerde bibliotheek.

Een typische workflow van pre-implantatie genetisch testen-aneuploïdie (PGT-A) in NGS omvat seriële procedures en vereist een intense werklast van laboratoriumpersoneel8. Sommige misoperaties veroorzaakten het terugdraaien van de procedure kan leiden tot ongewenst verlies van zowel tijd als middelen van het lab. Een beknopte en duidelijke standard operating procedure (SOP) voor PGS-NGS workflow is nuttig; Tekstindelingsprotocollen kunnen echter geen meer gedetailleerde informatie bevatten over monsterverwerking, apparaatmanipulatie en instellingen van instrumenten, die kunnen worden gevisualiseerd in een videoprotocol. In dit artikel zou een gevalideerde workflow in combinatie met een gevisualiseerde demonstratie van operationele details meer directe en intuïtieve verwijzende protocollen kunnen bieden in de PGT-praktijk op een halfgeleidersequencingplatform.

Het protocol beschrijft hier een methode die het batchen van maximaal 16 embryobiopten parallel ondersteunt. Voor grotere batches wordt aanbevolen om een commercieel kitgebaseerd protocol te gebruiken voor halfgeleidersequencing, zoals Reproes-PGS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle protocollen en de trophectoderm (TE) biopsie (1.1.1.1 sectie) toegepast in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de humane onderzoeksethiek commissie van no. 924 ziekenhuis op 18 september 2017 (NO: PLA924-2017-59). De patiënten/deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.

1. DNA-isolatie van biopsie van menselijke embryo's en volledige genomische amplificatie

  1. Protocol voor versterking van het gehele genoom 9,10
    OPMERKING: Pico PLEX WGA Kit wordt gebruikt om versterking van het hele genoom uit te voeren.
    1. Monsterverzameling en -opslag
      1. Trophectoderm biopsie: Put uit gemiddeld zes tot negen cellen uit hernia TE van D5/6 embryo na geassisteerd uitkomen om een gekwalificeerde hoeveelheid DNA te verkrijgen voor de volgende amplificatie.
      2. Breng de monstercellen over naar een PCR-buis in 5 μL PBS.
      3. Vries de monsters onmiddellijk in bij -80 °C als het protocol niet direct overgaat tot de DNA-extractie.
    2. Cellyse
      OPMERKING: Aanvullend bestand 1 bevat een lijst en dient als referentie voor de aanbevolen volumes van elk onderdeel bij het voorbereiden van de hoofdmix tijdens cellyse en volledige genoomversterking van batches van 1, 8, 16 en 32 monsters (met overschrijding om pipetteerfouten op te vangen). Bij het formuleren van andere hoofdmengsels van dit protocol wordt het volume van elke component bovendien verhoogd om rekening te houden met het componentverbruik dat wordt veroorzaakt door herhaald pipetteren. Alle korte centrifugatie wordt uitgevoerd op een tafelmodel minicentrifuge gedurende 2-10 s bij kamertemperatuur (RT), met een vast toerental van 10.000 met een centrifugale kracht van 5.300 x g. De middelpuntvliedende kracht moet tussen 2.000 x g en 12.000 x g liggen.
      1. Bereid het cellysemengsel voor met 4,8 μL van de verdunningsbuffer van het extractie-enzym en 0,2 μL van het celextractie-enzym per monster.
      2. Pipetteer 5 μL van de vers bereide cellyse meng in elk 5 μL celmonster in PCR-buizen en centrifugeer de buis kort op RT gedurende 5 s. Draai de buis niet vortex.
      3. Incubeer het monster in een thermische cycler als volgt: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Kort centrifugeer (5 s) de buis na de incubatie.
    3. Pre-amplificatie van het hele genoom-DNA
      1. Bereid het voorversterkingsmengsel voor met 4,8 μL van de voorversterkerbuffer en 0,2 μL van het voorversterkerenzym per monster.
      2. Pipetteer 5 μL van het voorversterkingsmengsel in de monsterbuizen door de wanden van de buis en centrifugeer kort gedurende 3 s. Vermijd dat de punt de bodem van de buis bereikt en draai de buis niet vortex.
      3. Incubeer het monster volgens het in tabel 1 vermelde thermische cyclerprogramma.
    4. DNA-amplificatie van het hele genoom
      1. Centrifugeer het monster kort gedurende 5 s en plaats het pre-amp incubatieproduct op ijs.
      2. Bereid de gehele genoomversterkingsmix voor met 25 μL van de amplificatiebuffer, 0,8 μL van het amplificatie-enzym en 34,2 μL nucleasevrij water per monster.
      3. Meng 60 μL van het vers bereide gehele genoomversterkingsmengsel met de 15 μL pre-amp incubatieproduct; het totale volume moet 75 μL bedragen. Kort centrifugeren gedurende 5 s. Vermijd dat de punt de bodem van de buis bereikt en draai de buis niet vortex.
      4. Plaats de PCR-buis op de thermische cycler en voer het in tabel 2 vermelde thermische cyclerprogramma uit.
      5. Centrifugeer de buizen kort gedurende 5 s en breng de producten over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
      6. Kwantificeer de WGA-productconcentratie met een fluorometer11. Monsters kunnen tijdelijk worden bewaard bij -20 °C gedurende minder dan 2 maanden als ze niet doorgaan naar de volgende stap.
  2. Protocol van de onafhankelijk ontwikkelde WGA-reagentia.
    1. Monsterverzameling en -opslag
      1. Trek de cellen uit het D5/6-embryo na geassisteerd uitkomen voor de volgende amplificatie.
      2. Breng de monstercellen met 1,5 μL PBS over in een PCR-buis met 2 μL PBS.
        OPMERKING: PBS is vrij van Mg2+ en Ca2+.
      3. Vries de monsters onmiddellijk in bij -80 °C als ze niet direct overgaan tot het DNA-extractieprotocol.
    2. Cellyse
      1. Smelt de cellysebuffer (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethyleenglycoltetra-azijnzuur (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfaat, 2 mM β-glycerofosfaat, 0,1% SDS) bij RT en plaats het op het ijs. Voeg 2 μL cellysebuffer toe aan elk monster en centrifugeer kort (5 s).
        OPMERKING: Draai de buis niet vortex en vermijd dat de pipetpunt het vloeibare oppervlak in de buis raakt om te voorkomen dat cellen of DNA uit het reactiesysteem worden gehaald.
      2. Incubeer het monster in een thermische cycler als volgt: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, vasthouden. Centrifugeer de buis kort op RT gedurende 10 s na de incubatie.
    3. DNA-amplificatie van het hele genoom
      1. Centrifugeer het cellyseproduct kort gedurende 5 s en plaats het op ijs.
      2. Bereid het volledige genoomversterkingsmengsel voor elk monster door te mengen met 16 μL amplificatievoorgemengde oplossing, 1 μL amplificatie-enzym en 28 μL nucleasevrij water. Meng voorzichtig, centrifugeer kort (5 s) en leg het mengsel op ijs. Draai de buis niet vortex.
      3. Pipetteer 45 μL van het vers bereide amplificatiemengsel van het gehele genoom in het cellysisproduct, bereid in stap 1.2.2.2; meng voorzichtig en centrifugeer kort gedurende 5 s.
        OPMERKING: Draai de buis niet vortex en vermijd dat de pipetpunt de vloeistof in de buis raakt.
      4. Plaats de PCR-buis op de thermische cycler en voer het programma uit zoals beschreven in tabel 3.
      5. Centrifugeer de buizen kort gedurende 5 s en breng de producten over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
      6. Kwantificeer de WGA-productconcentratie met een fluorometer11 en noteer de resultaten op het QA-blad (kwaliteitsanalyse). Producten met gekwalificeerde concentraties kunnen tijdelijk worden bewaard bij -20 °C gedurende minder dan 2 maanden als ze niet overgaan tot de volgende stap.

2. Selectie van versterkingsfragmenten

OPMERKING: Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Bibliotheekvoorbereidingskit (Materiaaltabel).

  1. Voorbereiding voor aanvang
    1. Breng de magnetische kralen (n x 100 μL) in evenwicht voor zuivering bij RT gedurende 30 minuten.
    2. Herstel het vorige WGA-product naar RT. Vortex het product bij RT gedurende 30 s voordat u het kort centrifugeert.
    3. Bereid verse 70% ethanol.
  2. Selectieprocedure voor fragmenten
    1. Pipetteer 25 μL van de WGA-producten en breng over in een centrifugebuis van 1,5 ml met 25 μL nucleasevrij water vooraf geladen.
    2. Vortex en meng de DNA-zuiveringskralen goed. Aliquot 50 μL ervan in elke monsterbuis (origineel monster: kralen (volume) = 1:1), vortex en centrifuge kort (5 s). Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces.
    3. Plaats de centrifugebuis van 1,5 ml in een magneetrek en wacht tot alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis worden aangetrokken. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    4. Volgens het oorspronkelijke monstervolume pipet 30 μL (origineel monster: kralen (volume) = 1:0,6) magnetische kralen, vortex en centrifuge kort (5 s). Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces.
    5. Plaats de centrifugebuizen van 1,5 ml in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis zijn aangetrokken. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    6. Pipetteer 300 μL 70% ethanol in de centrifugebuis van 1,5 ml, draai de buis twee keer voorzichtig met een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    7. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    8. Verwijder de centrifugebuis van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Plaats de buizen terug in het magneetrek en wacht tot alle magnetische kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis.
    9. Pipetteer voorzichtig de resterende vloeistof aan de onderkant. Houd de buis open om de kralen op RT gedurende 3-5 minuten te drogen. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren op de pellet van kralen ontstaan.
    10. Verwijder de buizen uit het magnetische rek, pipetteer 25-30 μL van de DNA-elutiebuffer in een buis en sluit de dop en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele vloeistof naar de bodem van de buis te krijgen en zet de buis gedurende 5 minuten op RT.
    11. Steek de buizen terug in de magnetische rekken en wacht tot alle kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis en het supernatant transparant wordt. Breng de DNA-oplossing voorzichtig over in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    12. Kwantificeer de concentratie van DNA na fragmentselectie met een fluorometer11, bewaar het bij -20 °C. Doorgaans varieert de concentratie van het geselecteerde DNA-fragment van 1,5-2,4 ng/μL.

3. Voorbereiding van de DNA-bibliotheek12

OPMERKING: Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Bibliotheekvoorbereidingskit (Materiaaltabel).

  1. Eindreparatie
    1. Balanceer de magnetische kralen op RT gedurende 30 minuten.
    2. Breng het DNA-product van fragmentselectie in evenwicht in stap 2.2.12 tot RT. Controleer en noteer het label op elke injectieflacon die het DNA bevat.
    3. Bereid het DNA-eindherstelsysteem voor met 30 μL DNA-producten, 10 μL eindreparatiebuffer, 0,5 μL eindherstellende enzym en 9,5 μL nucleasevrij water in een centrifugebuis van 1,5 ml. Vortex de buis voor 30 s en centrifuge kort (5 s) bij RT om alle vloeistof naar de buisbodem te krijgen.
    4. Incubeer bij 25 °C gedurende 30 minuten en centrifugeer de buis kort (5 s) na incubatie.
    5. Vortex of omgekeerd meng de magnetische kralen en breng 75 μL van de magnetische kralen over in een buis met eindherstellende DNA-monsters (origineel monster: kralen (volume) = 1:1,5). Pipet of vortex voorzichtig om de kralen goed te mengen en kort centrifuge (5 s) om alle suspensie naar de bodem van de buis te draaien. Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces. Draai de buisjes voorzichtig om om de kralen verspreid te houden.
    6. Plaats de centrifugebuizen in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Verwijder het supernatant en vermijd het pipetteren van de kralen, waarbij de buizen op het rek blijven tijdens het pipetteren.
    7. Breng 300 μL van de nieuw bereide 70% ethanol over in de buizen, draai de buizen voorzichtig twee keer in een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    8. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    9. Verwijder de centrifugebuizen van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Plaats de buizen terug in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis worden aangetrokken.
    10. Pipetteer voorzichtig de resterende vloeistof in de bodem. Open de dop van centrifugebuizen van 1,5 ml en droog de kralen op RT gedurende 3-5 minuten. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren op de pellet van kralen ontstaan.
    11. Pipetteer 33 μL DNA-elutiebuffer in een buis, sluit de dop en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele suspensie naar de bodem van de buis te krijgen en zet de buis gedurende 5 minuten op RT.
    12. Steek de buizen terug in de magnetische rekken en wacht tot alle kralen naar de zijwand worden aangetrokken en de oplossing transparant wordt. Breng de DNA-oplossing voorzichtig over in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml met de juiste tag, zodat de kralen niet worden gepipetteerd.
  2. Ligatie van streepjescodes
    1. Plaats de ligatiereagentia met streepjescode in stap 3.2.2 op ijs om alle bevroren reagentia te smelten.
    2. Bereid het ligatiesysteem voor met 32 μL eindherstellende DNA-producten, 10 μL nucleasevrij water, 5 μL ligasebuffer, 1 μL ligase en 1 μL P1-adapt in een centrifugebuis van 1,5 ml. Pipetteer 1 μL van elk barcodereagens in de oplossingsmix in de buis voor één monster, vortex gedurende 5 s en centrifugeer kort (5 s) om alle vloeistof in de bodem van de buis te krijgen.
      OPMERKING: Controleer bij het toevoegen van de streepjescodes of het aantal streepjescodes en monsters overeenkomt; open slechts één injectieflacon met streepjescode tegelijk om gemengde vervuiling van barcodes te voorkomen; Vervang de handschoenen voor elke vijf of zes toegevoegde barcodes.
    3. Incubeer de buizen bij 25 °C gedurende 30 min.
    4. Pipetteer 75 μL (oorspronkelijk monster: kralen (volume) = 1:1,5) van de magnetische kralen in een buis en pipet of vortex voorzichtig om de kralen goed te mengen. Centrifugeer kort (5 s) om alle suspensie naar de bodem te laten draaien, waardoor kraalaggregatie wordt vermeden. Zet de buis gedurende 5 minuten op RT voor het DNA-bindingsproces. Draai de buizen voorzichtig om om de kralen verspreid te houden.
    5. Plaats de centrifugebuizen in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Verwijder het supernatant en vermijd het pipetteren van de kralen, waarbij de buizen op het rek blijven tijdens het pipetteren.
    6. Breng 300 μL van de nieuw bereide 70% ethanol over in buizen, draai de buizen voorzichtig twee keer in een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    7. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    8. Verwijder de centrifugebuizen van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Steek de buizen terug in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis zijn aangetrokken. Pipetteer voorzichtig het resterende supernatant in de bodem.
    9. Houd de buisdop open om de kralen op RT gedurende 3-5 minuten te drogen. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren op de pellet van kralen ontstaan.
    10. Pipetteer 15 μL van de DNA-elutiebuffer in de buis. Spoel de pellet van de kralen af tot op de bodem van de buis, sluit de dop af en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele suspensie naar de bodem van de buis te krijgen en houd de buis gedurende 5 minuten stabiel op RT.
  3. Fragmentversterking
    1. Plaats de bibliotheekgebouwen op ijs wanneer het bevroren reagens oplost.
    2. Breng 47,5 μL van het enzymmengsel en 2,5 μL van het primermengsel over in de buis met geëlueerd DNA en kralen, vortex gedurende 5 s en centrifugeer kort (5 s) om alle vloeistof naar de buisbodem te krijgen.
    3. Zet de buis op RT gedurende 5 min. Plaats de buizen terug in magnetische rekken en wacht tot alle kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Breng de DNA-oplossing voorzichtig over in PCR-buizen van 0,2 ml met labels die duidelijk zijn gemarkeerd en vermijd pipetteren van de kralen.
    4. Incubeer het monster in een thermische cycler set met het volgende programma: 72 °C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cycli); 70 °C, 5 min. Centrifugeer de buis kort (5 s) wanneer de reactie is voltooid en bewaar de producten bij 4 °C.
    5. Breng de PCR-producten over in een centrifugebuis van 1,5 ml (lage bevestiging). Voeg 97,5 μL (oorspronkelijk monstervolume: kralen (volume) = 1:1,5) magnetische kralen toe aan de buis wanneer de reactie eindigt, pipet of voorzichtig vortex om de kralen goed te mengen, en centrifugeer kort (5 s) om alle vloeistof naar de bodem te laten draaien. Vermijd kralenaggregatie. Zet de buis op RT gedurende 5 min. Draai de buizen voorzichtig om om de kralen verspreid te houden.
    6. Plaats de centrifugebuizen in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand worden aangetrokken en het supernatant transparant wordt. Verwijder het supernatant, pipetteer de kralen niet en houd de buizen stabiel op het rek.
    7. Breng 300 μL van de nieuw bereide 70% ethanol over in buizen, draai de buizen voorzichtig twee keer in een hoek van 180° en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.
    8. Herhaal de wasprocedure eenmaal.
    9. Verwijder de centrifugebuis van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (5 s). Steek de buis terug in het magneetrek en wacht 5 minuten totdat alle magnetische kralen naar de zijwand van de buis zijn aangetrokken. Pipetteer voorzichtig de resterende vloeistof in de bodem.
    10. Houd de buisdop open om de kralen op RT gedurende 3-5 minuten te drogen. Houd vocht van de kralen af.
      OPMERKING: Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren ontstaan in de pellet van de kralen.
    11. Pipetteer 22 μL van de DNA-elutiebuffer in de buis, spoel de pellet van de kralen naar beneden en sluit de dop en vortex. Centrifugeer kort (5 s) om de troebele vloeistof naar de bodem van de buis te krijgen en zet de buis gedurende 5 minuten op RT.
    12. Kwantificeer de concentratie van de geconstrueerde DNA-bibliotheek met een fluorometer11 en bewaar de geconstrueerde DNA-bibliotheek bij -20 °C; de concentratie van het geselecteerde DNA-fragment varieert van 0,6-10 ng/μL. Hercodeer de bibliotheekinformatie in de bibliotheekdatabase en sla de monsters dienovereenkomstig op.

4. Voorbereiding van sequencing template13,14

OPMERKING: Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Template Preparation Kit Set (Reagentia/Solutions/Materials) van de Sequencing Reactions Universal Kit (Materiaaltabel).

  1. Bibliotheek mix
    1. Vul de vorm in van een vooraf uitgevoerd registratieblad in het serversysteem en tag de monsterbuis met bibliotheekconcentratie en barcodenummer. Vermijd het gebruik van dezelfde barcodes op verschillende monsters in één keer.
    2. Vortex en meng het bibliotheekmonster en centrifugeer kort (5 s). Verdun alle monsters tot 100 pM met nucleasevrij water, vortex gedurende 30 s en centrifugeer het monster kort.
      OPMERKING: Aangezien DNA een gemiddelde lengte heeft van 260 bp en 1 bp 660 g/mol, berekent u de omzetting van ng/μL naar pM met behulp van de volgende vergelijking: 1 ng/μL = 5.827,5 pM/L.
    3. Pipet 10 μL van 100 pM verdunde bibliotheek in een centrifugebuis van 1,5 ml, vortex gedurende 30 s en kort centrifuge gedurende 2 s. Houd de gemengde bibliotheek op ijs.
  2. Template voorbereiding
    1. Start het sjabloonversterkingssysteem en kies het schone programma. Voeg de reactieolie toe aan 1/2 van de buis en voeg de emulgatorbreekoplossing toe aan 1/3 van de buis.
    2. Controleer of de versterkingsplaat en de wasadapter in de AAN-stand staan. Reinig de afvalfles en steek een naald in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml om afval te verzamelen. Bevestig de verwerkte stappen op het scherm van het sjabloonversterkingssysteem. Druk op NEXT om een schoon programma te starten, dat ongeveer 15 minuten duurt.
    3. Vervang de versterkingsplaat door een nieuwe na het reinigingsprogramma, plaats de opvangbuizen met 150 μL breekoplossing II in de rotor en plaats de brug op de opvangbuizen. Voeg de reactieolie toe aan 1/2 van de buis en de emulgatorbreekoplossing aan 1/3 van de buis.
    4. Emulgeer PCR-reagenspreparaat: Breng de geëmulgeerde PCR-buffer op RT in evenwicht totdat deze is opgelost, centrifugeer kort (5 s) alle reagentia en plaats ze voor gebruik op ijs.
    5. Pipet 120 μL van het geëmulgeerde PCR-enzymmengsel, 100 μL template Ion Sphere Particle (ISP's) buffer, 170,5 μL nucleasevrij water en 9,5 μL van de gemengde bibliotheek (100 pM) in een buis met 2.000 μL geëmulgeerde PCR-buffer. Meng de oplossing goed met herhaald pipetteren.
      OPMERKING: De gemengde oplossing moet binnen 15 minuten op het sjabloonversterkingssysteem worden geladen; voer alle procedures uit bij RT.
    6. Plaats een nieuw filter voor sjabloonvoorbereiding stabiel op het buisrek met het monsterportaal naar boven. Vortex de oplossing gedurende 5 s, centrifugeer kort (5 s) en breng de oplossing over in het monsterportaal van het filter na herhaaldelijk driemaal pipetteren van 800 μL. Centrifugeer de buis om de bubbels vóór de laatste injectie te verminderen. Vermijd het injecteren van lucht in het filter. Injecteer 200 μL reactieolie II na de gemengde oplossing.
    7. Draai het monsterportaal van het filter naar beneden en vervang de wasaanpassing door het filter. Steek de monsternaald in het middelste gat van het rotordeksel en druk de naald vervolgens naar beneden.
    8. Druk op de RUN-knop op het scherm, kies het programma volgens de bijbehorende kit en druk op ASSISTED om alle stappen te controleren. Druk op NEXT totdat de run is gestart; het duurt ongeveer 4,5 uur om klaar te zijn.
    9. Druk op VOLGENDE wanneer het programma is voltooid; het systeem start een centrifugatie van 10 minuten. Wanneer de centrifugatie stopt, drukt u op de knop Deksel openen en verplaatst u de opvangbuizen naar rekken. Als de procedure niet binnen 15 minuten naar de volgende stap gaat, drukt u op Final Spin om opnieuw te centrifugeren.
    10. Verwijder het supernatant in de opvangbuis en laat 100 μL oplossing in de buis achter. Meng het resterende monster door te pipetteren en breng het monster over naar de nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml met de aanduiding OT (One touch 2-systeem).
      OPMERKING: Wanneer u het supernatant pipetteert, vermijd dan het aanraken van de buisbodem langs de zijkant.
    11. Pipetteer 100 μL nucleasevrij water in elk van de opvangbuizen en breng de oplossing over naar de OT-buis die wordt gewassen met herhaald pipetteren. Voeg 600 μL nucleasevrij water toe aan de OT-buis om het totale volume 1 ml te maken, vortex gedurende 30 s en centrifugeer bij 15.500 x g gedurende 8 minuten.
    12. Verwijder voorzichtig het supernatant in de OT-buis met nog 100 μL over en gebruik de punt om de olielaag grondig weg te gooien. Voeg 900 μL nucleasevrij water toe, vortex gedurende 30 s en centrifugeer bij 15.500 x g gedurende 8 minuten.
    13. Verwijder het supernatant totdat er nog 20 μL over is, voeg de sjabloon resuspendatieoplossing toe om het volume 100 μL te maken, vortex gedurende 30 s en centrifugeer kort gedurende 2 s.
      OPMERKING: De oplossing die in deze stap wordt verkregen, moet in minder dan 12 uur naar de volgende stap gaan.
    14. Voer het schone programma uit op het sjabloonversterkingssysteem voordat u de stroom uitschakelt.
  3. Template verrijking
    1. Bereid het smeltmengsel met 280 μL tween-80 en 40 μL 1 M NaOH.
    2. Was de C1 kralen. Vortex de C1 kralen oplossing voor 30 s. Breng 100 μL kralen over in een centrifugebuis van 1,5 ml, plaats de buis gedurende 2 minuten op een magnetisch rek en gooi het supernatant weg.
    3. Breng 1 ml van de C1-kralenwasoplossing gedurende 30 s over in de buis en vortex. Centrifugeer kort (5 s), steek de buis gedurende 2 minuten in het magnetische rek en gooi het supernatant weg. Pipetteer 130 μL C1-kraal resuspensieoplossing in de buis en meng de kralen door herhaaldelijk pipetteren. Vermijd het creëren van bubbels.
    4. Laad 100 μL van de verdunde bibliotheek, 130 μL C1-kralen, 300 μL x 3 sjabloonwasoplossing en 300 μL van de smeltoplossing op de stroken met acht putten, zoals weergegeven in figuur 1.
    5. Installeer de achtputtenstrips op de verrijkingsmodule, laad de pipetteerpunt en zet de centrifugebuis van 200 μL in de opvangpositie. Druk op START om het programma uit te voeren; het duurt ongeveer 35 min.
    6. Het monster wordt automatisch verzameld in de centrifugebuis van 200 μL; sluit het deksel en centrifugeer het op 15.500 x g gedurende 5 minuten. Controleer de onderkant van de buis om te controleren of er C1-kralen achterblijven.
    7. Als er nog C1-kralen overblijven, pipetteer de sjabloonoplossing dan herhaaldelijk 10x en plaats de buis gedurende 4 minuten op het magnetische rek. Breng al het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis van 0,2 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 15.500 x g .
    8. Als er geen zichtbare C1-kralen overblijven, gooit u het supernatant weg totdat er nog 10 μL over is, voegt u 200 μL nucleasevrij water toe en mengt u door 10x te pipetteren. Centrifugeer bij 15.500 x g gedurende 5 min.
    9. Gooi het supernatant weg met nog 10 μL over en voeg 90 μL nucleasevrij water toe om een totaal volume van 100 μL te bereiken. Pipetteer 10x op en neer om de oplossing te mengen, vortex gedurende 5 s en kort centrifugeer (5 s). De oplossing kan minder dan 3 dagen bij 2-8 °C worden bewaard.

5. Next-generation sequencing 9,15

OPMERKING: Alle procedures in deze sectie worden uitgevoerd op het DA8600-sequencingplatform. Materialen die in deze sectie worden gebruikt, zijn beschikbaar in de Sequencing Kit Set (Reagentia/Oplossingen/Materialen) van de Sequencing Reactions Universal Kit (Materiaaltabel).

  1. Controleer alle reagentia en materialen die nodig zijn in een run-on sequencingplatform.
    1. Sequencingreagens: Controleer op de beschikbaarheid van sequencing-enzymoplossing (6 μL), sequencingprimers (20 μL), kwaliteitscontrolesjabloon (5 μL) en dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), opgeslagen tussen -30-10 °C.
    2. Sequencingoplossing: Controleer op de beschikbaarheid van sequencingoplossing II (100 ml), sequencingoplossing III (50 ml), gloeibuffer (1.015 μl), laadbuffer (10 μL), schuimmiddel (2 μL), chloortablet (1 tablet) en Streptavidin-kralen (100 μL), bewaard bij 4 °C.
    3. Materialen: Controleer op de beschikbaarheid van 250 ml reagentiabuis (8), 250 reagentia buisdop (8), sipper II (8), sipper (1), 2 L reagensfles (1) en sequencingchip (1), opgeslagen bij RT.
  2. Was de chip voor gebruik.
    1. Plaats één chip stabiel op een werkplaat, injecteer 100 μL nucleasevrij water in het monstergat, verwijder de oplossing in het buitenportaal en herhaal de procedure.
    2. Injecteer 100 μL 0,1 M NaOH-oplossing in de chip en incubeer gedurende 1 minuut bij RT.
    3. Injecteer 100 μL isopropanol in het monstergat, verwijder extra oplossing in het buitenportaal en herhaal de procedure opnieuw.
    4. Bedek het buitenportaal met een filterpapier, laat de stikstof instromen om de resterende isopropanol in de stroomcel van de chip te drogen en houd de kant-en-klare chip op RT.
  3. Sequencer initiatie
    1. Schakel de stikstofklep in en stel de druk af op 30 psi. Start de sequencer, druk op CLEAN op het hoofdscherm en kies water of chloride om de machine dienovereenkomstig te wassen.
      OPMERKING: Was met water voor elke run, was elke week met chloride of de tijd dat de machine klaarstaat met reagentia gedurende 48 uur.
    2. Chloride wassen: Kies één reagensfles die is gespecificeerd voor chloridewas, was de fles tweemaal met 18 MΩ water en vul de fles met 1 L 18 MΩ water. Doe een chloridetablet in de fles, los de tablet gedurende 10 minuten op, voeg 1 ml 1 M NaOH toe en keer de fles om om de oplossing te mengen. Gebruik de chlorideoplossing binnen 3 uur na bereiding.
    3. Filtreer 100 ml chlorideoplossing met een filter van 0,45 μm en verzamel met twee buisjes. Installeer de twee chloridebuizen in posities C1 en C2. Druk op CLEAN op het hoofdscherm en rust een chip uit voor chloridewas.
    4. Druk op NEXT en controleer alle stappen op het scherm om het wasprogramma te starten; het programma eindigt over 30 minuten. Begin een wasbeurt met water na de chloridewasbeurt.
    5. Waterwassing: Markeer twee buizen specifiek voor water met C1 en C2 en was de buizen tweemaal met 18 MΩ water. Voeg 100 ml water van 18 MΩ toe aan elk van de waterwasbuizen en zet ze in respectievelijk C1- en C2-posities.
    6. Kies het CLEAN-programma , installeer de chip die is voorbereid voor waterwas, druk op NEXT en controleer vervolgens alle stappen op het scherm om het wasprogramma te starten.
  4. Initialisatie
    1. Reinig de wasfles met wasoplossing II, markeer deze als W2 en was deze drie keer met 18 MΩ water.
    2. Reinig de stikstofbuis met lucht gelegd papier, steek deze in de bodem van de buis en stem de luchtstroom af op 0,5 l/min. Ontlaad de zuurstof in de fles en vul de fles met 1.920 ml water van 18 MΩ. Voeg sequentieoplossing II en 10 μL van 1 M NaOH toe aan de fles, sluit de dop en keer de fles meerdere keren om de oplossing te mengen.
    3. Markeer twee nieuwe buizen als W1 en W3. Voeg 32 μL 1 M NaOH toe aan W1, voeg 40-50 ml 1x sequentieoplossing III toe aan W3 en sluit de doppen.
      OPMERKING: 1x sequentieoplossing III moet bij het eerste gebruik gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C liggen. Sequentieoplossing II moet tegen licht worden beschermd en bij RT worden opgeslagen. De wasfles moet na 20 keer gebruik worden vervangen door een nieuwe.
    4. Druk op INITIALIZE op het hoofdscherm, wijzig de sipper op de W1-, W2- en W3-posities, stel de buizen dienovereenkomstig in op hun positie en sluit ze stevig af door rotatie. Installeer een chip voor initialisatie en controleer de statusparameters van de machine.
    5. Druk op NEXT om het initialisatieprogramma te starten; het duurt 40 minuten in het eerste gedeelte.
      OPMERKING: De handschoenen moeten worden vervangen voordat de nieuwe sipper wordt vervangen om te voorkomen dat het lichaam van de sipper wordt verontreinigd. Eenmaal gebruikt voor waterwas en initialisatie, kunnen de chips worden toegepast op initialisatie, maar gebruik niet de chips die worden gebruikt voor chloride-wash chips voor initialisatie.
    6. Los dGTP, dCTP, dATP en dTTP op ijs op en vortex om te mengen. Markeer vier nieuwe buizen als G, C, A en T en pipetteer 70 μL van de oplossing volgens de tag van de buis.
  5. Bereid de bibliotheek voor op het uitvoeren.
    1. Plaats de kwaliteitscontrolesjabloon, primers en enzymoplossing op ijs.
    2. Bereid de DNA-bibliotheek voor wanneer het initialisatieprogramma nog ongeveer 20 minuten over heeft. Vortex de kwaliteitscontrole sjabloon voor 30 s te mengen, en kort centrifugeren voor 2 s. Breng 5 μL van de kwaliteitscontrolesjabloon over in de sjabloonoplossing, vortex gedurende 5 s en centrifugeer de buis gedurende 15.500 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant door voorzichtig te pipetteren, raak de pellet niet aan en laat een volume van 10 μL in de buis.
    3. Voeg 15 μL gloeibuffer toe aan de buis; het totale volume van de oplossing is 25 μL.
    4. Vortex de sequentie primers wanneer het volledig oplost op ijs en centrifugeer kort gedurende 2 s. Breng 20 μL van de sequentieprimers over in de buis van de vorige stap, vortex gedurende 5 s, kortcentrifugeer gedurende 2 s en bewaar vervolgens bij RT voor gebruik.
  6. Het monster laden en sequencing
    1. Pipetteer 55 μL van de in de vorige stap bereide monsteroplossing en injecteer deze in het monstergat van de chip.
    2. Plaats de chip op de centrifuge; houd de inkeping naar buiten en het monsterportaal naar binnen, balanceer deze met een andere gebruikte chip en centrifugeer gedurende 10 minuten.
    3. Bereid de laadoplossing voor.
      1. Meng 0,5 ml van de gloeibuffer en 0,5 ml nucleasevrij water in een centrifugebuis van 1,5 ml. Markeer het als 50% gloeibuffer en gebruik het binnen 7 dagen.
      2. Meng 0,5 ml isopropanoloplossing en 0,5 ml gloeibuffer. Markeer het als 50% wasbuffer en gebruik het binnen 24 uur.
      3. Meng 6 μL sequentie-enzym en 60 μL 50% gloeibuffer. Markeer het als enzymreactiebuffer en plaats de oplossing na bereiding op ijs.
      4. Meng 49 μL 50% gloeibuffer en 1 μL schuimmiddel en markeer het als schuimoplossing.
    4. Blaas 100 μL lucht in de schuimoplossing, pipetteer de oplossing herhaaldelijk totdat de bellen zich in een dichte schuimtoestand bevinden en houd het schuimvolume rond de 250 μL.
    5. Plaats de chip na de centrifuge op de bank, injecteer 100 μL schuim in het monstergat en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal. Plaats de chip terug in de centrifuge en centrifugeer kort gedurende 30 s.
    6. Herhaal stap 5.6.4-5.6.5.
    7. Injecteer tweemaal 100 μL 50% wasbuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal.
    8. Injecteer driemaal 100 μL 50% gloeibuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal.
    9. Injecteer 65 μL 50% enzymreactiebuffer, vermijd bubbels en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal.
    10. Stabiliseer de geladen chip op RT gedurende 5 minuten en installeer de chip op het sequencerchipportaal. Kies het plan dat in stap 6 is geprogrammeerd, controleer de informatie en start de run; het duurt ongeveer 1,5 uur om klaar te zijn.
    11. Voer het waterwasprogramma uit binnen 72 uur nadat de run is afgelopen. Voer de chloridewas uit vóór het wassen met water wanneer de tijd hoger is dan 72 uur. Sluit de sequencer af en sluit de klep van de stikstof.

6. Plan een geïnstrueerde sequencing-run in het reporterserversysteem16

OPMERKING: Alle procedures in deze sectie worden uitgevoerd op Ion Proton Sequencer met het reporterserversysteem.

  1. Meld u aan bij het serversysteem, selecteer het tabblad Plan en klik op PlanSjabloon uitvoeren. Kies het hele genoom als uitvoeringstype en selecteer de juiste sjabloon in de lijst met sjablonen voor geplande uitvoeringen.
  2. Voer op het tabblad Plan de volgende selecties in of maak deze:
    1. Voer een nieuwe naam van het runplan in op basis van de batch monsters, selecteer hg19 (Homo sapiens) in de vervolgkeuzelijst Referentiebibliotheek en selecteer Geen in de vervolgkeuzelijst Doelregio's en Hotspotregio's .
    2. Voer het aantal streepjescodes in dat in de voorbeeldset is gebruikt, selecteer een streepjescode in de vervolgkeuzelijst voor elk voorbeeld en voer een unieke, beschrijvende naam in, die nuttig kan zijn om het voorbeeld te groeperen en bij te houden. Vermijd het gebruik van het standaardvoorbeeld 1 enzovoort.
    3. Selecteer Geen op het tabblad Ion Reporter , klik op Volgende en selecteer DNA in de toepassing en Het hele genoom als doeltechniek.
    4. Controleer op het tabblad Kits de selecties of breng wijzigingen aan terwijl dit geschikt is voor een uitvoering.
      1. Selecteer Ion Plus Fragment Library Kit in de vervolgkeuzelijst Type bibliotheekkit . Selecteer Ion PI HI-Q OT2 200 kit in de vervolgkeuzelijst Template Kit en kies OneTouch als standaard. Selecteer Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit in de vervolgkeuzelijst Sequencing Kit .
      2. Voer 300 stromen in, selecteer Ion PITM-chip in de vervolgkeuzelijst Chiptype en selecteer IonXpress in de vervolgkeuzelijst Streepjescodeset .
      3. Annuleer de selectie van Markeren als duplicaten leest en de selectie van Herschikking inschakelen.
    5. Kies de juiste plug-in op het tabblad Plug-ins om gegevensanalyse uit te voeren in stap 7. Voltooi de selecties in de projectstap, klik op Volgende en klik op Planrun in de rechterbenedenhoek om de geplande runs weer te geven.
    6. Selecteer op het tabblad Geplande runs de nieuw gemaakte uitvoering en controleer alle instellingen in het revisievenster.

7. Data-analyse

  1. Analyseer de varianten van het kopieernummer (CNV's) met behulp van een bioinformatica-workflow.
    OPMERKING: De CNV's werden geanalyseerd in de bioinformatica-workflow met de implementatie van een algoritme op basis van een verborgen Markov-model (HMM)17; het model gebruikt leesdekking over het hele genoom om het kopienummer of de ploïdiestatus van het hele getal te voorspellen (d.w.z. 0, 1, 2, 3, enz.). De algemene bioinformatica-pijplijn is gebouwd in de plug-in van een sequentieserversysteem, wat wordt gedemonstreerd in figuur 2. De bioinformatica-analysestap duurt gemiddeld 4 uur om te voltooien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Terwijl het sequentieplan eindigt na het lopende proces op de machine, rapporteert het sequentieserversysteem de samenvatting met beschrijvende informatie over gegenereerde gegevens, chipstatus, laadsnelheid van ISP en bibliotheekkwaliteit, zoals weergegeven in figuur 2. In deze resultaten werden 17,6 G-gegevens in de totale basis verkregen en de totale belastingssnelheid van ISP was 88% in de totale putten van de chip; de heatmap liet zien dat het monster gelijkmatig was geladen op de total...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Chromosomale aneuploïdie van embryo's is de oorzaak van een groot deel van het zwangerschapsverlies, of het nu op natuurlijke wijze is verwekt of in-vitrofertilisatie (IVF). In de klinische praktijk van IVF wordt voorgesteld dat het screenen van de embryo-aneuploïdie en het terugplaatsen van het euploïdie-embryo de uitkomst van IVF zou kunnen verbeteren. Fluorescentie in situ hybridisatie is de vroegste techniek die wordt toegepast voor geslachtsselectie en PGT-A; deze techniek vereist echter meer techn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Zhangyong Ming en de heer Rongji Hou bedanken voor hun advies over de uitgebreide toepassing van LIMS. Deze studie wordt ondersteund door PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) en Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm Syringe Filter UnitMerkmilliporeMillex-HV
1.5 mL DNA LoBind TubesEppendorf30108051
15 mL tubesGreiner Bio-One188261
2.0 mLDNA LoBind TubesEppendorf30108078
50 mL tubesGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON
 Anstart Tap DNA PolymeraseFAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads voor dna binding)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis bufferSouthern Medical UniversityCell lysis buffer bevat 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM natriumpyrofosfaat, 2 mM β-glycerofosfaat, 0,1% SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution bufferNEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Ethyl alcoholGuangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientifichttp://www.chemicalreagent.com/
Onafhankelijk ontwikkelde reagens voor gehele genoomversterkingSouthern Medical UniversityDe reagentia bestaan uit de volgende componenten:
1. Cel Lysis
2. Amplificatie vooraf gemengde oplossing
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplificatie Enzym
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 KitThermo Fisher ScientificA26434Kit genoemd in stap 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit  Thermo Fisher ScientificA26433
Ion Proton SystemLife Technologies4476610
Ion Reporter Server SystemLife Technologies4487118
isopropanolGuangzhou Chemical Reagent Factoryhttp://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation KitDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Nuclease-Free WaterLife TechnologiesAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 SystemLife Technologies4474779  Template amplificatie en verrijkingssysteem
PCR tubesAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitTakara Bio USAR300671
Pipette tipsQuality Scientific Productshttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FluorometerLife TechnologiesQ33216Fluorometer
Qubit Assay TubesLife TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
Sequencer server systemThermo Fisher ScientificTorrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal KitDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
Deze kit bevat de volgende componenten:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzymmix
Template carrier oplossing

1.2 Template Preparation oplossingen:
Template preparatiereactie olie I
emulgator brekingsoplossing II
Template Preparatie Reactie Olie II
Nuclease-vrije water
Tween oplossing
Demulsificatie oplossing I
Template wasoplossing
C1 bead wasoplossing
C1 bead resuspensieoplossing
Template resuspensieoplossing

1.3 Template Preparatie Materialen:
Reagensbuis I
connector
Collectiebuis
Reagensbuis pijp I
Versterkingsplaat
8 wells strip
Speciale tips
Template voorbereiding wasadapter
Template voorbereiding filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzymoplossing
Sequencing primers
Kwaliteitscontrole templates

2.2  Sequencing Oplossingen:
Sequencing oplossing II
Sequencing oplossing IIII
Annealing buffer
Laadoplossing
Schuimmiddel
Chloortabletten
C1 bead

2.3 Sequencing Materialen:
Reagensbuis II
Reagensbuis dop
Reagensbuis sipper  II
Reagensfles sipper
Reagensflessen

3. Chip
Sodium hydroxide solutionSigma72068-100ML
Thermal CyclerLife Technologies4375786

Referenties

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266(2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871(2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22(2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345(2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585(2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164(2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170(2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genetische screening op aneuplo diesemiconductor sequencing platformwhole genome amplificatietrofoblastcellenconstructie van genomische bibliothekenkopienummervariatiesDNA zuiveringsbeadsbeheer van sequencer

Gerelateerde artikelen