Methodenartikel

Een aangepaste manchettechniek voor muis cervicaal heterotopisch harttransplantatiemodel

DOI:

10.3791/63504

⸱

7 februari 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urological Oncology Surgery, Chongqing University Cancer Hospital, 2School of Medicine, Chongqing University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, Army Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het huidige protocol wordt een muisharttransplantatiemodel gebruikt voor het onderzoeken van het mechanisme van cardiale allograftafstoting. In dit heterotope harttransplantatiemodel wordt de operatie-efficiëntie verbeterd en wordt de overleving van harttransplantaten verzekerd door een cervicale end-to-end anastomose van hartimplantatie met behulp van een gemodificeerde Cuff-techniek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale allograftafstoting beperkt de overleving op lange termijn van patiënten na harttransplantatie. Een harttransplantatiemodel van muizen is ideaal voor het onderzoeken van het mechanisme van cardiale allograftafstoting in preklinische studies vanwege hun hoge homologie met menselijke genen. Dit inzicht zou helpen bij het ontwikkelen van unieke benaderingen voor het verbeteren van de overleving van patiënten op lange termijn die worden behandeld met cardiale allografts. In een muismodel wordt abdominale donorhartimplantatie vaak uitgevoerd met een end-to-end anastomose naar de aorta van de ontvanger en inferieure vena cava met behulp van hechtingen. In dit model wordt het hart van de donor geïmplanteerd door end-to-end anastomose in de halsslagader en halsslagader van de ontvanger door de gemodificeerde manchettechniek. De transplantatieoperatie wordt uitgevoerd zonder hechtingen en kan dus de overleving van de ontvanger verhogen, omdat er geen interferentie is met de bloedtoevoer en veneuze reflux van het onderlichaam. Dit muismodel zou helpen bij het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de immunologische en pathologische (acute/chronische) afstoting van cardiale allografts.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Harttransplantatie is de standaardbehandeling geworden voor terminaal hartfalen. Meer dan 5.500 harttransplantaties per jaar worden uitgevoerd in de organisaties die zijn geregistreerd onder de International Society for Heart and Lung Transplantation. Onder de ontvangers van allogene harttransplantaties is het 1-jaars afstotingspercentage nog steeds >10%, terwijl het 3-jaars afstotingspercentage steeg tot 36%1,2. Effectieve profylactische behandelingen voor patiënten met cardiale allograftafstoting ontbreken echter. Daarom zijn diermodelstudies gerechtvaardigd die de fysiologische mechanismen ophelderen die ten grondslag liggen aan de immunologische en pathologische afstoting van cardiale allografts. Dergelijke studies zouden bijdragen aan het onderzoek naar nieuwe doelwitten die nodig zijn om effectieve geneesmiddelen te ontwikkelen, die cardiale allograftafstoting zouden helpen voorkomen en de overlevingskansen in die patiëntenpopulaties zouden verbeteren.

Enkele potentiële immunologische en pathofysiologische mechanismen van cardiale allograftafstoting zijn onlangs voorgesteld in muismodelstudies van heterotope harttransplantatie 3,4,5. Bijgevolg werd heterotope harttransplantatie bij muizen een ideaal preklinisch model om de mechanismen van immuunafstoting en pathologisch letsel te onderzoeken die optreden bij cardiale allografts na harttransplantatie vanwege hun hoge homologie met menselijke genen. Het gangbare concept is om heterotope transplantatie uit te voeren in een muismodel door een abdominale end-to-end anastomose in de ontvangende aorta en inferieure vena cava met behulp van hechtingen, vergelijkbaar met de normale menselijke anatomie. Deze procedure kan echter interfereren met de bloedtoevoer van de ontvanger en veneuze reflux van het onderlichaam6. Daarom wordt hier een aangepaste heterotope harttransplantatieprocedure in een muismodel voorgesteld.

Het hart van de donor wordt geïmplanteerd met de halsslagader en halsslagader van de ontvanger door een end-to-end cervicale anastomose met behulp van een gemodificeerde Cuff-techniek. Deze aangepaste procedure vergemakkelijkte de operatieve haalbaarheid en zorgde voor de overleving van het harttransplantaat zonder de bloedtoevoer en veneuze reflux van het onderlichaam te verstoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eight Edition, National Research Council (US) 2011. Procedures met dieren zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Chongqing University Cancer Hospital, Chongqing, China. Mannelijke BALB/c- en C57BL/6-muizen met een gewicht van 20-30 g, verkregen uit commerciële bronnen (zie tabel met materialen), werden gebruikt voor allogeen harttransplantatieonderzoek. De C57BL/6-muizen werden gebruikt als donoren en syngenetische ontvangers, terwijl de BALB/c-muizen dienden als allogene ontvangers. Een schema van het protocol is weergegeven in figuur 1.
OPMERKING: Alle benodigdheden die tijdens de operatie worden gebruikt, inclusief chirurgische instrumenten en oplossingen, zijn steriel. De chirurgische procedure houdt zich aan het principe van aseptische operatietechniek.

1. Procedure voor de ontvanger

  1. Induceer algemene anesthesie via inhalatie van 5% isofluraan via een inductiekamer van 15 x 10 x 10 cm verbonden met een kap (zie materiaaltabel).
  2. Bevestig de ontvangermuis op de operatietafel met een verwarmingskussen. Handhaaf de anesthesie bij continue inhalatie van 2% isofluraan via een gezichtsmasker over de neus en mond.
    OPMERKING: Trage ademhalingsfrequentie en -ritme, het verdwijnen van de hoornvliesreflex en de afwezigheid van de pedaalreflex in de tenen wijzen op de effectiviteit van anesthesie.
  3. Na het scheren van het haar, desinfecteer het chirurgische gebied met drie afwisselende rondes povidon-jodium scrub gevolgd door alcohol. Snijd vervolgens de huid 1,5-2 cm parallel aan de cervicale middellijn van de rechter onderkaakhoek naar het staarteinde.
  4. Ontleed ~1 cm van de rechter externe halsader met behulp van een elektrocoagulator en microtang. Knip de ader aan het proximale uiteinde met een atraumatische microvasculaire klem en ligate deze aan het distale uiteinde.
  5. Passeer het distale uiteinde van de ader door een 22 G polyurethaan prikkeldraadmanchet (zie Materiaaltabel) met een schuine kant en oppervlakkige groeven. Bevestig de ader met het handvat van de manchet met behulp van een microvasculaire klem.
  6. Verwijder de 8-0 ligatiehechting aan het distale uiteinde, draai het lumen over de manchet die door de oppervlakkige weerhaak is gehaakt binnenstebuiten en fixeer met een 10-0 chirurgische hechting in de groeven van het oppervlak.
  7. Reseceer de rechter sublinguale klier om een fossa te vormen voor het implanteren van het harttransplantaat en reserveer de rechterkwab van de submaxillaire klier en de rechter sternocleidomastoïde.
  8. Ontleed de rechter gemeenschappelijke halsslagader gedurende ~ 1 cm met behulp van een microtang en knip de slagader met een atraumatische microvasculaire klem aan het proximale uiteinde. Aan het distale uiteinde, ligate en snijd de slagader af.
  9. Passeer het distale uiteinde van de slagader door een 26 G polyurethaan prikkeldraadmanchet (zie Materiaaltabel) met een schuine kant en groeven op het oppervlak. Bevestig de slagader met het handvat van de manchet met behulp van een microvasculaire klem.
  10. Verwijder de ligatiehechting aan het distale uiteinde, draai het lumen binnenstebuiten over de manchet en fixeer met een oppervlakkige weerhaak en groeven met een chirurgische hechting van 10-0.
  11. Na het voorbereiden van de vaten van de ontvanger, laat 100 IE / ml heparinezoutoplossing op de bloedvaten vallen om trombose te voorkomen. Bedek de cervicale incisie met steriel nat zoutoplossinggaas voor latere implantatie.

2. Donorprocedure

  1. Gebruik dezelfde anesthesieprocedure (stap 1.1) voor de donormuis.
  2. Scheer het buikhaar met een elektrisch scheermes en desinfecteer het operatiegebied met drie afwisselende rondes povidon-jodiumscrub gevolgd door alcohol.
  3. Beuk de buik (2-3 cm) in met een schaar langs de middellijn van de symphysis pubis naar de subxiphoid en breid het ingesneden gebied uit met een retractor.
  4. Ontleed 1 cm van de abdominale aorta en inferieure vena cava met behulp van een elektrocoagulator en een microtang en voer heparinisatie uit door 1 ml fysiologische zoutoplossing aangevuld met 250 IE / ml heparine te injecteren via de inferieure vena cava. Snijd hierna de abdominale aorta en inferieure vena cava weg.
  5. Snijd de thorax langs de voorste oksellijn aan beide zijden met behulp van een chirurgische schaar om de borstwand te scheiden. Schakel de superieure vena cava uit met een 8-0 chirurgische hechting.
  6. Steek een hoofdhuidnaald in op de suprahepatische inferieure vena cava. Injecteer vervolgens ijskoude fysiologische zoutoplossing aangevuld met 100 IE / ml heparine door de hoofdhuidnaald van suprahepatische inferieure vena cava om het donorhart te doordrenken totdat de bloedkleur vervaagt.
  7. Perfuseer het donorhart opnieuw met 2-3 ml ijskoude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK) oplossing (zie tabel met materialen) met behulp van een hoofdhuidnaald uit de aortaboog om het donormyocard te beschermen. De gemiddelde warme ischemietijd is 5 min.
  8. Ligate de superieure en inferieure vena cava en de longader met een 5-0 chirurgische hechting. Ontleed en snijd de donoraorta en longslagader af voordat ze zich vertakken. Verdeel daarna de superieure en inferieure vena cava en de longader om het hart van de donor te verwijderen.

3. Implantatie

  1. Implanteer het donorhart in de cervicale zak van de ontvangende muis in een omgekeerde positie.
  2. Trek de manchet met een everted ontvanger halsader in het lumen van de donor longslagader om end-to-end anastomose van de donor longslagader uit te voeren naar de ontvanger externe halsader. Ligate de manchet met behulp van de groeven op het oppervlak door een 10-0 chirurgische hechting om de anastomose te fixeren.
  3. Gebruik een vergelijkbare procedure voor end-to-end anastomose van de donoraorta naar de ontvangende halsslagader.
  4. Laat de atraumatische microvasculaire klem van de halsslagader los, gevolgd door de halsslagader om het hart van de donor opnieuw te doordrenken. De gemiddelde koude ischemietijd is 15 min.
  5. Bevestig het harttransplantaat en hecht het goed om verdraaiing van het transplantaat te voorkomen.
  6. Sluit de cervicale incisie met continue hechtingen met behulp van een 5-0 polyamide monofilament hechtdraad (zie tabel met materialen).
    OPMERKING: Verwijder de hechtdraad nadat de wond volledig is genezen.
  7. Houd de ontvangende muis in een warme, droge en schone kooi totdat deze herstelt van de anesthesie.
    OPMERKING: Het duurt 5-10 minuten om te herstellen.
  8. Injecteer buprenorfine (0,05 mg/kg) subcutaan in de ontvangende muis om de 6 uur gedurende 48 uur voor postoperatieve analgesie.
    OPMERKING: De dosering voor analgesie is geoptimaliseerd voor deze studie. Het analgesieregime kan echter worden verlengd / gewijzigd als er tekenen van pijn zijn in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor diergebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit cervicale heterotope harttransplantatiemodel van de muis was de overlevingskans van ontvangende muizen ongeveer 95,2% (20 van de 21 muizen overleefden). De primaire doodsoorzaak was postoperatieve bloedingen. De snelle hartslag met een regelmatig ritme dient als indicator voor de overleving van het geïmplanteerde donorhart.

C57BL/6 en BALB/c muizen waren MHC (H-2b) en MHC (H-2d) types in dit model, respectievelijk 7,8. Deze twee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het harttransplantatiemodel van muizen draagt bij aan het onderzoek naar afstotingsmechanismen na harttransplantatie en draagt bij aan de ontwikkeling van unieke benaderingen om de overleving op lange termijn van cardiale allograftontvangers te verbeteren. Harttransplantatie bij muizen is echter een complexe en uitdagende taak, die een hoog niveau van microchirurgietechnieken vereist, vooral bij vasculaire anastomose11,12,13. He...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81870304) aan Jun Li.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 5-0 Polyamide Monofilament hechtdraadB.Braun Medical Inc.C3090954
 8-0 Polyamide Monofilament hechtdraadB.Braun Medical Inc.C2090880
10-0 Polyamide Monofilament hechtdraadB.Braun Medical Inc.G0090781
22 G polyurethaan manchetB.Braun Medical Inc.4251628-02
26 G polyurethaan manchetSuzhou Linhua Medical Instrument Co., LTDREF383713
Anesthesie-inductiekamerRWD Life Science Co., LTDV100
Atraumatische microvasculaire klemBeyotimeFS500
BALB/c en C57BL/6 muizen (20–30 g)Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China)
BuprenorfineUS Biological life Sciences352004
ElektrocoagulatorGuangzhou Runman Medical Instrument Co., LTDZJ1099
GaasHenan piaoan group Co., LTD10210402
VerwarmingskussenGuangzhou Dewei Biological Technology Co., LTDDK0032
HeparineNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
HTK-oplossingShenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTDYZB/Min8263-2013
Injectiespuit (10 mL)Shandong weigao group medical polymer Co., LTD20211001
IsofluraanRWD Life Science Co., LTD21070201
Fysiologische zoutoplossingSouthwest pharmaceutical Co., LTDH50021610
HoofdnaaldHongyu Medical Group20183150210
ShaverBeyotimeFS600
Kleine dieren anesthesie-apparaatRWD Life Science Co., LTDR500
Chirurgisch operatiemicroscoopTiannuoxiang Scientific Instrument Co., Ltd, Beijing, ChinaSZX-6745
WattenstaafjeYubei Medical Materials Co., LTD21080274

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
  2. Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
  3. Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
  4. Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
  5. Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
  6. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. 6, 238(2007).
  7. Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
  8. Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
  9. Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
  10. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
  11. Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264(2018).
  12. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
  13. Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
  14. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
  15. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  16. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muizenharttransplantatiecervicaal transplantatiemodelafstoting van hartallograftvaatanastomosekop aan kopanastomoseimplantatie van donorhartmicrovasculaire klemoverleving van harttransplantaatdierlijk transplantatiemodel

Gerelateerde artikelen