Methodenartikel

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

DOI:

10.3791/63511

⸱

5 april 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia, de residente aangeboren immuuncellen in de hersenen, zijn de primaire responders op ontsteking of letsel in het centrale zenuwstelsel (CZS). Microglia kunnen worden onderverdeeld in rusttoestand en geactiveerde toestand en kunnen snel van toestand veranderen als reactie op de micro-omgeving van de hersenen. Microglia worden geactiveerd onder verschillende pathologische omstandigheden en vertonen verschillende fenotypen. Daarnaast zijn er veel verschillende subgroepen van geactiveerde microglia en grote heterogeniteit tussen verschillende subgroepen. De heterogeniteit hangt vooral af van de moleculaire specificiteit van microglia. Studies hebben aangetoond dat microglia worden geactiveerd en een belangrijke rol spelen in het pathologische proces van inflammatoire demyelinisatie. Om de kenmerken van microglia bij inflammatoire demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en neuromyelitis optica spectrum stoornis beter te begrijpen, stellen we een perilesional primair microgliaal sorteerprotocol voor. Dit protocol maakt gebruik van kolomvormige magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) om sterk gezuiverde primaire microglia te verkrijgen en de moleculaire kenmerken van microglia te behouden om de potentiële effecten van microglia bij inflammatoire demyeliniserende ziekten te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn afkomstig van dooierzakvoorlopers, die zeer vroeg de embryonale hersenen bereiken en deelnemen aan de ontwikkeling van het CZS 1,2. Ze zijn bijvoorbeeld betrokken bij synaptisch snoeien3 en het reguleren van axonale groei4. Ze scheiden factoren af die neuronale overleving bevorderen en neuronale lokalisatie helpen5. Tegelijkertijd zijn ze betrokken bij het verwijderen van abnormale cellen en apoptotische cellen om een normale hersenontwikkeling te garanderen6. Bovendien, als de immuun-competente cellen van de hersenen, surveilleren microglia voortdurend het hersenparenchym om dode cellen, disfunctionele synapsen en cellulair puinop te ruimen 7. Het is aangetoond dat microgliale activering een belangrijke rol speelt bij een verscheidenheid aan ziekten, waaronder inflammatoire demyeliniserende ziekten, neurodegeneratieve ziekten en hersentumoren. Geactiveerde microglia bij multiple sclerose (MS) dragen bij aan de differentiatie van oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's) en regeneratie van myeline door myeline-puin te verzwelgen8.

Bij de ziekte van Alzheimer (AD) activeert accumulatie van amyloïde bèta (Aβ) microglia, die de fagocytische en ontstekingsfuncties van microglia9 beïnvloeden. Geactiveerde microglia in het glioomweefsel, glioom-geassocieerde microglia (GAM) genoemd, kunnen de progressie van glioom reguleren en uiteindelijk de prognose van patiëntenbeïnvloeden 10. De activering verandert het microgliale transcriptoom grondig, wat resulteert in morfologische veranderingen, expressie van immuunreceptoren, verhoogde fagocytische activiteit en verbeterde cytokinecretie11. Er zijn verschillende subsets van geactiveerde microglia bij neurodegeneratieve ziekten zoals ziekte-geassocieerde microglia (DAM), geactiveerde respons microglia (ARM) en microgliaal neurodegeneratief fenotype (MGnD)8.

Evenzo bestaan er ook meerdere dynamische functionele subsets van microglia naast elkaar in de hersenen bij inflammatoire demyeliniserende ziekten12. Het begrijpen van de heterogeniteit tussen verschillende subsets van microglia is essentieel om de pathogenese van inflammatoire demyeliniserende ziekten te onderzoeken en hun potentiële therapeutische strategieën te vinden. De heterogeniteit van microglia hangt vooral af van de moleculaire specificiteit8. Het is essentieel om de moleculaire veranderingen van microglia nauwkeurig te beschrijven voor de studie van de heterogeniteit. Vooruitgang in eencellige RNA-sequencing (RNA-seq) technologie heeft de identificatie van de moleculaire kenmerken van geactiveerde microglia in pathologische omstandighedenmogelijk gemaakt 13. Daarom is het vermogen om celpopulaties te isoleren van cruciaal belang voor verder onderzoek van deze doelcellen onder specifieke omstandigheden.

Studies die worden uitgevoerd om de kenmerken en functies van microglia te begrijpen, zijn meestal in vitro studies, omdat is gebleken dat grote aantallen primaire microglia kunnen worden bereid en gekweekt uit muizenjonghersenen (1-3 dagen oud), die zich hechten aan de kweekkolven en groeien op het plastic oppervlak met andere gemengde gliacellen. Vervolgens kunnen zuivere microglia worden geïsoleerd op basis van de verschillende kleefkracht van gemengde gliacellen14,15. Deze methode kan echter alleen microglia isoleren uit de perinatale hersenen en duurt enkele weken. Potentiële variabelen in celkweek kunnen microgliale kenmerken beïnvloeden, zoals moleculaire expressie16. Bovendien kunnen microglia die door deze methoden worden geïsoleerd alleen deelnemen aan in vitro experimenten door de omstandigheden van CZS-ziekten te simuleren en kunnen ze niet de kenmerken en functies van microglia in in vivo ziektetoestanden vertegenwoordigen. Daarom is het noodzakelijk om methoden te ontwikkelen voor het isoleren van microglia uit het volwassen muizenbrein.

Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetische scheiding zijn twee veelgebruikte methoden, hoewel ze hun eigen verschillende beperkingen hebben 16,17,18,19. Hun respectievelijke voor- en nadelen zullen in het discussiegedeelte worden vergeleken. De rijping van MACS-technologie biedt de mogelijkheid om cellen snel te zuiveren. Huang et al. hebben een handige methode ontwikkeld om demyeliniserende laesies in hersenen te labelen20. Door deze twee technische benaderingen te combineren, stellen we een snel en efficiënt kolomvormig CD11b magnetisch scheidingsprotocol voor, met een stapsgewijze beschrijving om microglia te isoleren rond demyeliniserende laesies in volwassen muizenhersenen en de moleculaire kenmerken van microglia te behouden. De focale demyeliniserende laesies werden veroorzaakt door de stereotactische injectie van 2 μL lysolecithine-oplossing (1% LPC in 0,9% NaCl) in het corpus callosum 3 dagen voor aanvang van het protocol21. Dit protocol legt de basis om de volgende stap in in vitro experimenten uit te voeren. Bovendien bespaart dit protocol tijd en blijft het haalbaar voor wijdverbreid gebruik in verschillende experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institute of Animal Care Committee van Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China.

1. Materialen

  1. Bereid de volgende oplossingen voor voordat u met het protocol begint.
    1. Bereid de laadbuffer voor door foetaal runderserum (FBS, 2%) toe te voegen aan fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Voeg neutrale rode (NR) kleurstof (laatste 1%) toe aan PBS.
  2. Bereid de volgende oplossingen voor met behulp van de in de handel verkrijgbare Adult Brain Dissociation Kit (zie de tabel met materialen).
    1. Om enzymmix 1 te bereiden, pipetteer 1,9 ml buffer Z en 50 μl enzyme P in een centrifugebuis van 15 ml.
    2. Om enzymmix 2 te bereiden, pipetteer 20 μL buffer Y en 10 μL enzym A in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    3. Bereid de oplossing voor het verwijderen van puin voor.

2. Muizenperfusie en dissectie

  1. Intraperitoneaal (i.p.) injecteer de muis met 500 μL 1% NR kleurstof in PBS 2-3 uur vóór de anesthesie.
    OPMERKING: Intraperitoneale injectie van NR in demyeliniserende muismodellen helpt de laesies te onderscheiden (figuur 1).
  2. Verdoof de muis met pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) en zorg ervoor dat de muis met succes wordt verdoofd door de pijnreacties te onderzoeken.
  3. Open de thoracale holte van de muis en stel het hart bloot.
  4. Snijd een klein hoekje van het rechteratrium voorzichtig en intracardiaal doordrenkt de muis met 20-30 ml koude PBS uit de linker ventrikel.
  5. Onthoofd de muis onder anesthesie.
  6. Open de schedel van de muis en bevrijd de hersenen voorzichtig van de schedel.
  7. Breng de hersenen over naar de schimmel van de muishersen en snijd de hersenen in plakjes van 0,1 cm.
  8. Verwijder de hersenschijfjes en leg ze in koude PBS in een petrischaaltje (60/15 mm). Microdisissek de laesies gelabeld door NR-kleurstof rond het corpus callosum onder een stereomicroscoop met behulp van een microchirurgische tang.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het ontleedde weefsel zo compleet mogelijk is om de daaropvolgende overdracht te vergemakkelijken; de totale voortgang van de dissectie moet binnen 2 uur zijn voltooid.
  9. Breng het ontleedde weefsel over in centrifugebuizen van 15 ml die de juiste hoeveelheid koude belastingsbuffer bevatten.
    OPMERKING: Pool het corpus callosum weefsel van 2-3 muizen samen in één buis als één monster.

3. Weefseldissociatie

  1. Centrifugeer het ontlede weefsel bij 300 ×g gedurende 30 s (na het bereiken van deze snelheid) om het monster op de bodem van de buis te verzamelen.
  2. Verwarm enzymmix 1 en enzymmix 2 tot 37 °C voor in een incubator.
  3. Voeg 1.950 μL voorverwarmd enzymmengsel 1 toe aan één monster en verteer in een incubator bij 37 °C gedurende 5 minuten.
  4. Voeg 30 μL voorverwarmd enzymmengsel 2 toe en meng voorzichtig.
  5. Verteer in een couveuse bij 37 °C gedurende 15 minuten en meng voorzichtig om de 5 minuten.
  6. Voeg na de vertering 4 ml koude PBS toe aan de buis en schud voorzichtig.
  7. Plaats 70 μm filters op centrifugebuizen van 50 ml en bevochtig de filters met 500 μL koude PBS. Filtreer het gedissocieerde weefsel door de verteerde weefselmonsters door de filters te laten gaan en breng de gefilterde suspensie in de centrifugebuis van 50 ml over naar een centrifugebuis van 15 ml.
    OPMERKING: Sla deze stap over als de hoeveelheid weefsel te klein is.
  8. Centrifugeer de gefilterde weefselmonsters gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 ×g en zuig het supernatant langzaam en volledig op.
    OPMERKING: Alle stappen moeten op ijs worden uitgevoerd, behalve de enzymatische spijsvertering.

4. Puin verwijderen

  1. Resuspend de celkorrel voorzichtig met 1.550 μL koude PBS.
  2. Voeg 450 μL koude oplossing toe voor het verwijderen van vuil en meng goed.
  3. Overlay het bovenstaande mengsel zeer langzaam en voorzichtig met 2 x 1 ml koude PBS met behulp van een pipet van 1.000 μL.
    OPMERKING: Kantel de centrifugebuis 45 ° en voeg langzaam PBS toe langs de buiswand met de pipet.
  4. Breng de buis langzaam en voorzichtig over in een centrifuge en draai bij 4 °C en 3.000 × g gedurende 10 minuten.
  5. Zoek naar drie lagen na het centrifugeren. Zuig de twee bovenste lagen volledig op met een pipet van 1.000 μL (figuur 2).
  6. Vul de buis tot 5 ml met koude laadbuffer en keer de buis voorzichtig drie keer om.
  7. Centrifugeer bij 4 °C en 1.000 × g gedurende 10 minuten. Zuig het supernatant volledig op en voorkom dat de celkorrel wordt verstoord.

5. Magnetische scheiding van microgliale cellen

  1. Resuspend de celkorrel met 90 μL laadbuffer en voeg 10 μL CD11b (Microglia) kralen toe.
  2. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.
  3. Voeg 1 ml laadbuffer toe en pipetteer de vloeistof voorzichtig op en neer met een pipet van 1.000 μL om de cellen na de incubatie te wassen. Centrifugeer de cellen bij 4 °C en 300 × g gedurende 10 minuten en zuig het supernatant volledig op om de ongebonden kralen te verwijderen.
  4. Resuspend de cellen in 500 μL laadbuffer.
  5. Plaats de MS-kolom met de scheidingsteken voor positieve selectie in het magnetisch veld.
  6. Spoel de kolom met 500 μL laadbuffer om de cellen te beschermen en de efficiëntie van magnetisch sorteren te garanderen op basis van het protocol van de fabrikant.
  7. Breng de celsuspensie aan op de MS-kolom en gooi de flowthrough met ongelabelde cellen weg.
  8. Voeg drie keer 500 μL laadbuffer toe aan de kolom om cellen weg te spoelen die aan de kolomwand hechten en gooi de doorstroming weg.
    OPMERKING: Voeg alleen een nieuwe laadbuffer toe voor het wassen als het kolomreservoir volledig leeg is.
  9. Verwijder de kolom uit de separator na het wassen van de kolom en plaats deze op een centrifugebuis van 15 ml.
  10. Voeg 1 ml laadbuffer toe aan de kolom en duw de zuiger naar de onderkant van de kolom om de magnetisch gelabelde cellen weg te spoelen. Herhaal deze stap drie keer om de magnetisch gelabelde cellen volledig te verzamelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia geïsoleerd met CD11b kralen hebben een hoge zuiverheid
Microgliale cellen rond de laesies in demyelinisatiemuismodellen werden geïsoleerd met behulp van het bovengenoemde protocol en getest door flowcytometrie. Cellen worden fluorescerend gelabeld met CD11b-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en CD45-allophycocyanine (APC) om microglia in flowcytometrie te bepalen volgens de instructies van de fabrikant. Er zijn meerdere literatuur die aantoont dat CD11b- en CD45-antilichamen voldoende zijn o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol stelt een methode voor om microglia rond de demyeliniserende laesies te isoleren, die kan helpen bij het bestuderen van de functionele kenmerken van microglia bij inflammatoire demyeliniserende ziekten. Microglia gevangen met BEHULP VAN CD11b kralen vertonen een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid. Kritieke stappen in het protocol omvatten de nauwkeurige lokalisatie van foci en optimale microgliale zuivering. In protocolstap 2.1 is het noodzakelijk om de NR-oplossing 2 uur te injecteren voordat de muis word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd ondersteund door Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Micro Centrifuge TubesBIOFILCFT001015
15 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011150
50 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011500
70 µm FilterMiltenyi Biotec130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MiceSJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouseMiltenyi Biotec130-093-634
Fetal Bovine SerumBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Neutral RedSigma-Aldrich1013690025
NovoCyte Flow CytometerAgilentEen systeem dat bestaat uit verschillende onderdelen
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereomicroscopeMshOtMZ62

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microglia IsolationMagnetic Activated Cell SortingDemyelination ModelMouse Brain MicrogliaFlow CytometryCD11b BeadsMicrodissection TechniqueMyeloid CellsCell SortingCentral Nervous System

Gerelateerde artikelen