Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van lipidesignalering in Drosophila-fotoreceptoren met behulp van massaspectrometrie

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63516

⸱

7 maart 2022

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

In dit artikel

Samenvatting

Het manuscript presenteert veelzijdige, robuuste en gevoelige massaspectrometrieprotocollen om verschillende klassen lipiden van Drosophila-fotoreceptoren te identificeren en te kwantificeren.

Samenvatting

De activering van fosfolipase Cβ (PLCβ) is een essentiële stap tijdens sensorische transductie in Drosophila-fotoreceptoren . PLCβ-activiteit resulteert in de hydrolyse van het membraanlipide fosfatidylinositol 4,5 bisfosfaat [PI(4,5)P2], wat uiteindelijk leidt tot de activering van transient receptor potential (TRP) en TRP-achtige (TRPL) kanalen. De activiteit van PLCβ leidt vervolgens ook tot de vorming van vele lipidesoorten, waarvan verschillende zijn voorgesteld om een rol te spelen bij de activering van TRP en TRPL. Bovendien is voorgesteld dat verschillende klassen lipiden een sleutelrol spelen bij het organiseren van de celbiologie van fotoreceptoren om signaalreacties te optimaliseren voor optimale sensorische transductie. Historisch gezien zijn deze ontdekkingen gedreven door het vermogen om Drosophila-mutanten te isoleren voor enzymen die de niveaus van specifieke lipiden regelen en om analyse van de fotoreceptorfysiologie in deze mutanten uit te voeren. Meer recent zijn krachtige massaspectrometriemethoden ontwikkeld voor isolatie en kwantitatieve analyse van lipiden met een hoge gevoeligheid en specificiteit. Deze zijn met name geschikt voor gebruik in Drosophila , waar lipidenanalyse nu mogelijk is op basis van fotoreceptoren zonder dat radionuclide-etikettering nodig is. In dit artikel worden de conceptuele en praktische overwegingen behandeld bij het gebruik van lipidemassaspectrometrie voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van verschillende signaallipiden in Drosophila-fotoreceptoren . Samen met bestaande methoden in de moleculaire genetica en fysiologische analyse zal een dergelijk lipide waarschijnlijk de kracht van fotoreceptoren versterken als een modelsysteem voor ontdekkingen in de biologie.

Inleiding

Fototransductie in Drosophila wordt gemedieerd door een G-proteïne-gekoppelde PLCβ-cascade die leidt tot de activering van de door licht geactiveerde kanalen TRP en TRPL1. PLCβ hydrolyseert het membraangebonden fosfolipide, fosfatidylinositol 4,5 bisfosfaat [PI(4,5)P2] en genereert diacylglycerol (DAG) en inositol 1,4,5 trisfosfaat (IP3). DAG wordt vervolgens gefosforyleerd door DAG-kinase om fosfatidinezuur (PA) te genereren. Vervolgens wordt PI(4,5)P2 door middel van een reeks reacties waarbij lipide-tussenproducten worden gegenereerd, geregenereerd2. Verschillende componenten van deze PI(4,5)P2-cyclus hebben functies in Drosophila-fotoreceptoren. Het mechanisme waarmee PLC-activering leidt tot TRP en TRPL-kanaalpoort blijft onopgelost. Verschillende bewijslijnen suggereren echter dat lipide-tussenproducten die worden gegenereerd door PI(4,5)P 2-hydrolyse dit proces kunnen mediëren3. Het is dus erg belangrijk om deze lipide-tussenproducten te identificeren en te kwantificeren om licht te werpen op het activeringsmechanisme van TRP en TRPL in Drosophila-fototransductie. Naast hun rol in fototransductie op zich, spelen lipiden ook verschillende belangrijke rollen in de cellulaire organisatie van fotoreceptoren (besproken in3). Het begrijpen van deze functionele rollen van lipiden wordt geholpen door het vermogen om hun niveaus in vivo te detecteren en te kwantificeren. Dit artikel geeft een overzicht en protocollen voor de keuze en implementatie van methoden voor het kwantificeren van lipiden van Drosophila-fotoreceptoren.

Historisch gezien bestond lipidenanalyse uit fractionering door chemische klassen, gevolgd door de analyse van individuele klassen. Om lipiden met succes te identificeren en te kwantificeren, zijn er veel analytische methoden ontwikkeld die gerichte of niet-gerichte lipidenanalyses zijn 4,5,6,7,8,9,10. De gerichte analyse richt zich op bekende lipiden en maakt gebruik van een specifieke methode met een hoge gevoeligheid voor de kwantitatieve analyse van deze specifieke lipiden. Niet-gerichte lipidenanalyse heeft tot doel veel lipidesoorten tegelijkertijd in een monster te detecteren. Deze analytische methoden omvatten dunnelaagchromatografie (TLC)4, gaschromatografie (GC)5, vloeistofchromatografie (LC)6, enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA)7, nucleaire magnetische resonantie (NMR)8, radionuclidelabeling en massaspectrometrie (MS)9,10. Hoewel radioactieve labeling een gevoelige methode is voor de detectie van lipiden en kan worden gebruikt in de context van gekweekte cellen, is het gebruik ervan bij de analyse van lipiden in intacte organismen zoals Drosophila een uitdaging vanwege veiligheidsoverwegingen bij het radioactief labelen van levende vliegende dieren. De andere uitdaging met radioactieve labeling is dat het afhankelijk is van het labelen van alle precursorpools tot bijna evenwicht en dit kan moeilijk zijn in de context van in vivo modellen.

Uitgebreide lipidenanalyse met behulp van MS is een recente vooruitgang die mogelijk is gemaakt door de ontwikkeling van moderne MS-technologieën11. Op MS gebaseerde analyse van lipiden biedt verschillende voordelen, waaronder kleine steekproefomvang, toepasbaarheid op monsters uit diermodellen, hoge gevoeligheid, specificiteit en hoge doorvoer. Met name het uitgebreide gebruik van elektrospray-ionisatie heeft geleid tot een verbetering van de prestaties van MS voor lipidenanalyse. De verbetering van massa-analysatoren in massaspectrometers, inclusief de combinatie van verschillende massa-analysatoren, heeft extra voordelen toegevoegd en de ontwikkeling van een massa-analysator met hoge resolutie heeft lipidenstudies nieuw leven ingeblazen11. Op MS gebaseerde analyse karakteriseert lipidemoleculen op twee belangrijke manieren: (1) Top-down lipidomics waarbij MS-experimenten gericht zijn op snelle kwantitatieve karakterisering van globale veranderingen binnen het lipidoom en uitsluitend vertrouwen op nauwkeurige massa's van intacte lipideprecursoren12; (2) Bottom-up lipidomics die individuele moleculaire soorten kwantificeert door karakteristieke structurele fragmentionen te detecteren met behulp van tandem MS13,14.

Over het algemeen bestaat de analyse van lipiden in Drosophila-fotoreceptoren uit twee stappen: ten eerste extractie van lipiden uit oog-/hoofdweefsel en ten tweede analyse van geëxtraheerde lipiden door MS. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van een van de volgende methoden: scheiding van lipiden door middel van vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan MS of zonder chromatografische scheiding door gebruik te maken van shotgun lipidomics/directe infusie MS (DIMS). Beide benaderingen van lipidenprofilering zijn gebaseerd op het gebruik van elektrospray-ionisatie MS (ESI-MS) en hebben bewezen gevoelig, kwantitatief en efficiënt te zijn10,15. In DIMS-analyse is de identificatie van lipiden gebaseerd op precursorionenmassa, neutrale verliesscans en lipideklassespecifieke handtekeningen 14,16,17,18. Hoewel deze benadering de snelheid van analyse en robuustheid combineert, kan ionenonderdrukking van lipiden met een lage abundantie als gevolg van de aanwezigheid van hoge abundantie en zeer polariseerbare lipiden in het monster niet worden vermeden. Laag overvloedige lipiden zoals fosfoinositiden en PA worden dus vaak niet of slecht gedetecteerd door standaard DIMS-platforms, onder andere vanwege ionenonderdrukking19,20. Vloeistofchromatografiescheiding voorafgaand aan MS (LC-MS) kan helpen bij het overwinnen van ionenonderdrukking en bij het focussen van de analyse van specifieke klassen of soorten lipiden die van belang zijn21.

In dit artikel worden de stappen beschreven die betrokken zijn bij het kwantificeren van de belangrijkste lipiden die van belang zijn in Drosophila-fotoreceptoren. In dit opzicht zijn drie verschillende MS-benaderingen geoptimaliseerd: (1) DIMS met behulp van een massaspectrometer met hoge resolutie, (2) post-derivatisering omgekeerde fase vloeistofchromatografie-MS (RPLC-MS) met behulp van een drievoudige viervoudige massaspectrometer, en (3) normale fase vloeistofchromatografie-meervoudige reactiebewaking-verbeterde productionenscan-MS (NPLC-MRM-EPI-MS) met behulp van een drievoudige viervoudige massaspectrometer met een verbeterde productscanfunctie. De keuze tussen deze methoden wordt bepaald door de specifieke onderzoeksvragen die worden onderzocht. Voor een globale beschrijving en analyse van alle soorten glycerofosfolipiden die betrokken zijn bij fototransductie, moet DIMS worden gebruikt. Er moet echter worden opgemerkt dat in deze benadering glycerofosfolipiden met een lage polarisatie en een lage abundantie zoals fosfoinosididen waarschijnlijk niet worden gedetecteerd22. Om deze lipiden met een lage abundantie te detecteren, moet RPLC-MS na derivatisering worden uitgevoerd. Met behulp van deze aanpak hebben we met succes fosfatidylinositol (PA)23,24,25, fosfatidylinositol (PI), fosfatidylinositol 5-fosfaat (PI5P)26, fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P) en PI(4,5)P 2 27 gedetecteerd en gekwantificeerd. DIMS en RPLC-MS-methoden na derivatisering genereren informatie op lipideklasseniveau. Met behulp van deze twee methoden kan men bijvoorbeeld PA (34:2) kwantificeren waarvan m/z consistent is met meerdere moleculaire soorten, waaronder: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) en (viii) PA (20:0/14:2). Met behulp van deze methoden kan men geen informatie krijgen over de samenstelling van de vetacylketen van de PA (34:2) die in het monster aanwezig is. Deze uitdaging kan worden overwonnen door een hybride MS-methode die LC-scheiding, monitoring van meerdere reacties (MRM) en verbeterde productscan (EPI) koppelt. Deze methode is zowel gevoelig als kwantitatief en maakt het mogelijk: directe meting, d.w.z. zonder enige vooretikettering of nabewerking van het monster, en stelt de moleculaire soorten vast met exacte informatie over de vetacylketen25. Met behulp van deze methode hebben we een groot aantal moleculaire soorten PA geïdentificeerd en de exacte samenstelling van vetacylketens op SN1 en SN2 van de glycerolruggengraat bepaald. Deze benadering zal nuttig zijn bij het analyseren van de functie van specifieke moleculaire soorten van elke klasse van lipiden in fotoreceptoren. Gedetailleerde protocollen die hier voor elk van deze soorten analyses worden gepresenteerd, kunnen worden aangepast aan andere signaallipiden die relevant zijn voor de fotoreceptorfunctie van Drosophila (voor schema's zie figuur 1). Opgemerkt moet worden dat gedetailleerde methoden voor lipidomics-analyse van verschillende andere klassen lipiden (niet behandeld in dit artikel) elders zijn beschreven. Deze omvatten ceramiden 28,29, sfingolipiden30,31, neutrale lipiden zoals diglyceriden en triglyceriden32,33 en sterolen 15,33. In sommige gevallen zijn methoden voor de analyse van deze lipiden beschreven voor weefsels van Drosophila-larven en kunnen deze worden aangepast voor gebruik in fotoreceptoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Kweek van vliegen en bereiding van chemicaliën

  1. Achtervliegen (Drosophila melanogaster) op standaard vliegenvoer in een broedmachine met een relatieve luchtvochtigheid van 50% bij 25 °C zonder interne verlichting. Bereid vliegenvoer door 80 g/L maïsmeel, 20 g/L D-glucose, 40 g/L sucrose, 8 g/L agar, 15 g/L gistextract, 4 ml propionzuur, 0,7 g/L TEGO (methylpara-hydroxybenzoaat) en 0,6 ml orthofosforzuur zoals beschreven in34 toe te voegen en zijn ook verkrijgbaar bij https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Kweek één set vliegen, na de eclosies, in een gekoelde broedmachine die op 25 °C wordt gehouden met een continue witte lichtverlichting van ~2.000 lux.
  2. Bereid fosfoinositide-elutiebuffer (PEB) door chloroform:methanol:2,4 M zoutzuur toe te voegen in een verhouding van 250:500:200 (vol/vol/vol). Bereid de wasbuffer in de onderste fase (LPWS) voor door methanol:1 M zoutzuur:chloroform toe te voegen in een verhouding van 235:245:15 (vol/vol/vol). Bereid de wasoplossing na de derivatisering voor door chloroform: methanol: water toe te voegen in een verhouding van 8: 4: 3 (vol / vol / vol) vol.
    OPMERKING: Gebruik oplosmiddelen en chemicaliën van MS-kwaliteit. Bewaar de PEB- en LPWS-buffer niet langer dan 3 maanden.
  3. Gebruik de kolom C4 (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) voor de fosfoinositiden, PI4P en PI(4,5)P2 en de kolom C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) voor PA, fosfatidylcholine (PC) en fosfatidylinositol (PI). Gebruik voor de NPLC-MRM-EPI-methode de silicakolom (1 mm x 150 mm x 3 μm).
  4. Bereid eluent A voor door hexaan:isopropylalcohol:100 mM waterig ammoniumacetaat toe te voegen in een verhouding van 68:30:2 (vol/vol/vol) en eluent B door hexaan:isopropylalcohol:100 mM waterig ammoniumacetaat toe te voegen in een verhouding van 70:20:10 (vol/vol/vol) voor PA, PC en PI. Bereid oplosmiddel A voor fosfoinositiden voor door 0,1% mierenzuur in water toe te voegen en oplosmiddel B door 0,1% mierenzuur in acetonitril toe te voegen.

2. Isolatie van weefsel

  1. Verzamel 10 vliegen per monster met behulp van kooldioxide (CO2) anesthesie (vliegen immobiliseren binnen enkele seconden) en onthoofd de vliegen met een scherp mes op een CO2 -verdovende plaat.
  2. Verzamel donkere of aan licht aangepaste vliegen van een bepaalde leeftijd (12-24 uur oud) in buisjes van 1,5 ml en vries ze in vloeibare stikstof in. Dehydrateer de vliegen in aceton bij -80 °C gedurende 48 uur in een glazen injectieflacon35. Verzamel voor netvliesweefsel 100 netvlies van gevriesdroogde vliegen. Verwijder met een scalpel de ogen van de rest van het hoofd en schep het netvlies eruit.
  3. Voor de analyse van fosfoinositiden PI4P en PI(4,5)P2 moet bij het werken met vers netvlies 25 netvlies per monster worden gebruikt van vliegen die onder geschikte verlichtingsomstandigheden zijn gekweekt voor het meten van het lipidegehalte tijdens de belichting en van vliegen die zonder licht zijn gekweekt voor het meten van het lipidegehalte in het donker. Bewaar in 50 μL 1x PBS in homogenisatorbuizen op droogijs tot het klaar is voor extractie.

3. Extractie van lipiden

LET OP: Chloroform is een giftig oplosmiddel en is kankerverwekkend van aard. Het tast het voortplantingssysteem aan en is irriterend voor de huid en de ogen. Voorzichtigheid is geboden bij het omgaan met deze chemische stof. Alle stappen met chloroform moeten worden uitgevoerd in een goed geventileerde chemische kap.

  1. Voor alle andere glycerofosfolipiden dan PI4P en PI(4,5)P2
    1. Homogeniseer voor elk monster 10 vliegenkoppen of 100 netvliezen (verzameld zoals beschreven in stap 2.2) in 0,1 ml 0,1 N ijskoud methanolisch HCl en 30 μl intern standaardmengsel (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), lysofosfatidinezuur (LPA; 13:0), lysofosfatidylcholine (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) en PC (12:0/13:0)). Bereid standaarden zo voor dat de uiteindelijke hoeveelheid van een lipidestandaard binnen de lineaire responscurve van de massaspectrometer valt.
    2. Homogeniseer weefsels met behulp van een geautomatiseerde homogenisator die een snelle en gelijktijdige behandeling van alle monsters mogelijk maakt. Draai de buizen kort in een tafelcentrifuge en zorg ervoor dat er geen pellet wordt gevormd - dit duidt op volledige homogenisatie. Breng het methanolhomogenaat over in een microcentrifugebuis met een dop van 2 ml.
    3. Voeg 0,2 ml ijskoude 0,1 N methanolische HCl toe voor het terugwinnen van eventueel restmateriaal in de tube en meng in de tube van 2 ml. Voeg 0,1 ml 0,1 N ijskoude methanolische HCl toe, gevolgd door 0,8 ml chloroform en meng grondig. Laat het mengsel, dat weefselhomogenaat bevat, 10 minuten op ijs staan en voeg dan 0,4 ml 0,88% KCl en vortex gedurende 30 s toe.
    4. Centrifugeer het mengsel bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de waterige en organische fase te scheiden. Verwijder de onderste organische fase met lipiden heel voorzichtig zonder te mengen met de waterige fase en breng over in een verse microcentrifugebuis van 2 ml.
      OPMERKING: Breng tijdens de lipide-extractie de onderste organische fase met de grootste zorg over om vermenging met de waterige fase te voorkomen, wat de stroomafwaartse lipidenanalyse kan belemmeren.
    5. Droog deze lipidenoplossing in een vacuümverdamper bij 4 °C, inspecteer het monster visueel om er zeker van te zijn dat het volledig droog is. Resuspendeer in 420 μl 2:1 methanol:chloroformmengsel voor analyse. Analyseer de monsters onmiddellijk zonder opslag.
  2. Voor fosfoinosididen PI4P en PI(4,5)P2
    1. Homogeniseer 25 netvliezen in 950 μL fosfoinositide-elutiebuffer (PEB; 250 ml CHCl3, 500 ml methanol en 200 ml 2,4 M HCl) en voeg interne standaarden toe (fosfatidylethanolamine (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); en PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) mengsel met 50 ng PI, 25 ng PI4P, 50 ng PI(4,5)P2 en 0,2 ng PE per monster.
    2. Voeg 250 μL chloroform en 2,4 M HCl toe, gevolgd door sonicatie gedurende 2 minuten en centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C voor fasescheiding. Neem de onderste organische fase in een verse buis, was met 900 μL LPWS en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Extraheer lipiden uit de resterende waterige fase door opnieuw een fasescheiding uit te voeren zoals in stap 3.2.2. Droog de verzamelde organische fasen in een vacuümcentrifuge die is ingesteld op 4 °C, inspecteer de monsters visueel om er zeker van te zijn dat ze volledig droog zijn.

4. Organische fosfaattest

  1. Maak een voorraadoplossing van 7,34 mM KH2PO4. Maak de standaardverdunningen, met behulp van gedestilleerd water, in microcentrifugebuisjes volgens tabel 1. Draai de buizen licht en breng de standaard verdunningen over in fosfaatvrije glazen buizen.
  2. Bereid een aparte set glazen buisjes voor met de lipidenmonsters. Optimaliseer het volume van lipidemonsters zodanig dat de absorptie bij 630 nm (na voltooiing van dit protocol) binnen het bereik van standaard KH2PO4 valt (dat is 0 tot 20x).
  3. Verwarm de glazen buizen met standaardverdunningen bij 120 °C tot ze volledig droog zijn. Verwarm de glazen buisjes met de lipidenmonsters (neem 1/8 van het totale monstervolume dat nodig is om een absorptie te hebben binnen het bereik van standaard KH2PO4) bij 90 °C tot volledige droogheid.
  4. Voeg 50 μL 70% perchloorzuur toe aan alle buisjes en verwarm gedurende 30 minuten op 180 °C. Koel de buizen af tot kamertemperatuur. Voeg 250 μL water, 50 μL 2,5% ammoniummolybdaat en 50 μL 10% ascorbinezuur toe aan elke buis.
    LET OP: 2,5% ammoniummolybdaat en 10% ascorbinezuur zijn gewichts-volconcentraties. Ze moeten vers worden gemaakt en kunnen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
  5. Bewaar de buisjes in een schudbroedstoof gedurende 1 uur bij 37 °C. Aliquot 130 μL monster in een plaat met 96 putjes en meet de extinctie bij 630 nm met behulp van een spectrofotometer.

5. Derivatisering

LET OP: Van trimethylsilyldiazomethaan (TMSD) wordt gemeld dat het veel toxicologische effecten heeft bij mensen. TMSD in oplossing richt zich op nieren, lever, maagdarmkanaal, skeletspieren, centraal zenuwstelsel en ademhalings- en voortplantingssystemen. Uiterste voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren van deze chemische stof. Het hele proces moet worden uitgevoerd in een goed geventileerde chemische kap.

  1. Voeg aan de onderste organische fase van de monsters die aan het einde van stap 3.2.3 zijn verkregen, 50 μl 2 M TMSD toe. Laat de reactie 10 minuten bij kamertemperatuur doorgaan met constant schudden bij 250 tpm. Voeg na 10 minuten 10 μL ijsazijn toe om de reactie te doven, aangegeven door het verdwijnen van de gele kleur in de oplossing.
  2. Tik op de buizen en open ze voorzichtig om de N2 te verwijderen die tijdens de afschrikreactie is gevormd. Nadat het gas van N2 is ontsnapt, sluit u de buizen en draait u ze naar beneden. Voeg vervolgens 600 μL wasoplossing na derivatisering toe en vortex gedurende 2 minuten in een mixer bij 250 tpm.
  3. Gooi ~400 μL weg uit de bovenste fase die zich zal vormen. Herhaal stap 5.2. Gooi de hele bovenste fase weg en voeg 50 μL 90% methanol toe aan de onderste fase en meng het.
  4. Droog de monsters gedurende 2 uur in een centrifugaalconcentrator bij 800 x g die in vacuüm werkt. Na droging moeten de buisjes ~20 μL van het resterende monster bevatten. Voeg 180 μL 100% methanol toe, meng het goed en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2-3 dagen voorafgaand aan LC-MS/MS.

6. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Gegevensverzameling bij directe infusie MS (DIMS)
    OPMERKING: MS kan worden gedaan door middel van directe infusie of vloeistofchromatografie MS (LC-MS) methode. In dit deel beschrijven we MS op basis van directe infusie.
    1. Voordat u met het experiment begint, kalibreert u de massaspectrometer volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Genereer een lineaire responscurve voor de verdunningsreeks van synthetische standaarden en verdun het monster op basis van de lineaire respons van het instrument zodat de intensiteit van de lipide-analyt binnen de lineariteit van het instrument valt. Verdun de totale lipide-extracten of lipidestandaarden met een mengsel van 2:1 methanol:chloroform (vol/vol). Selecteer de verdunning van de totale lipide-extracten en de synthetische standaarden afzonderlijk voor elk experiment.
    3. Breng de extracten en standaarden over in afzonderlijke injectieflacons. Vermijd luchtbellen tijdens het overbrengen van monsters in monsterflesjes met MS. Luchtbellen veroorzaken een hoge druk in de kolom en belemmeren de lipidenanalyse.
    4. Centrifugeer de monsters voorafgaand aan de analyse gedurende 9 minuten bij 6.440 x g en laad ze in een plaat met 96 putjes en sluit ze af met aluminiumfolie.
    5. Voer MS-analyses uit op een massaspectrometer met hoge resolutie met behulp van de directe infusiemethode. Bereik een stabiele, op ESI gebaseerde ionisatie van glycerofosfolipiden met behulp van een gerobotiseerde nanoflow-ionenbron met behulp van chips met spuitmonden met een diameter van 4,1 μm.
    6. Regel de ionenbron met behulp van een aangepaste massaspectrometersoftware en stel ionisatiespanningen in op +1,2 kV en -1 kV in respectievelijk positieve en negatieve modi; tegendruk bij 1 psi in beide modi; en temperatuur van de ionenoverdracht capillair bij 180 °C. Voer acquisitie uit met massaresolutie, Rm/z400 = 100.000. Zie figuur 2A voor de software-interface voor het instellen van massaspectrometerparameters.
    7. Los gedroogde totale lipide-extracten opnieuw op in 400 μL chloroform:methanol (1:2). Laad voor de analyse 60 μL aan monsters op een ionenbron met 96 putjes en sluit af met aluminiumfolie. Analyseer elk monster gedurende 20 minuten in positieve ionenmodus om PC, fosfatidylserine (PS), fosfatidylethanolamine (PE), PE-O (ethergekoppelde fosfatidylethanolamine), ceramide (Cer) en ceramidefosfaat (Cer-P) te detecteren.
    8. Voer een onafhankelijke acquisitie uit in de negatieve ionenmodus gedurende 20 minuten waarbij PA en PI werden gedetecteerd. Zie figuur 2B voor specifieke details over de opstelling van instrumenten voor data-acquisitie voor MS met hoge resolutie en een gerichte lijst van PA-soorten die is opgenomen in de opzet van data-afhankelijke acquisitie (DDA).
      OPMERKING: De software-interface voor het instellen van de DDA-methode wordt weergegeven in Figuur 2C. De lijst van PA-moleculen waarop deze benadering zich richt, staat vermeld in tabel 2. Een screenshot van de experimentele uitkomst van de DDA-aanpak is te zien in Figuur 2D.
  2. Gegevensanalyse bij directe infusie MS (DIMS)
    OPMERKING: De analyse van massagegevens die door alle soorten massaspectrometers worden gegenereerd, vereist een geautomatiseerd lipide-analyseplatform. LipidXplorer36 is een niet-commerciële software die alle soorten DIMS-lipidenexperimenten ondersteunt. Deze software is hier te vinden: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Zodra de gegevens zijn verkregen met behulp van de methoden beschreven in stap 6.1, identificeert u lipidesoorten met behulp van een lipidenanalyseplatform door m/z van hun mono-isotopische pieken te matchen met de overeenkomstige elementaire samenstellingsbeperkingen. Het voorbeeld van het importeren van gegevens wordt weergegeven in Figuur 3A. Stel de massatolerantie in op 10 ppm en de intensiteitsdrempel op basis van het ruisniveau dat wordt gerapporteerd door de massaspectrometersoftware.
    2. Compileer na het importeren moleculaire fragmentatie query language (MFQL) query's voor PA op basis van de chemische structuur van PA, die wordt weergegeven in figuur 3B. Zie figuur 3C voor de MFQL die is ingesteld in het lipidenanalyseplatform.
    3. Gebruik een vergelijkbare aanpak om MFQL te compileren voor andere glycerofosfolipiden in de software van het lipidenanalyseplatform. Elke query is gericht op één lipideklasse en veel query's kunnen in één uitvoering worden gebruikt.
    4. Voer alle MFQL's uit door op de knop Uitvoeren te klikken. Alle geïdentificeerde lipidesoorten worden gerapporteerd in een enkel resultatenbestand in .csv bestandsformaat met de abundanties van overeenkomstige voorloper- en/of fragmentionen voor de daaropvolgende kwantificering van lipiden. Een voorbeeld van de output wordt gegeven in tabel 3.

7. Vloeistofchromatografie en tandem MS van afgeleide monsters

  1. Scheid de monsters die zijn verkregen uit stap 5.4 door middel van vloeistofchromatografie met behulp van een ultrakrachtig vloeistofchromatografiesysteem. Zorg er bij het kiezen van dit systeem voor dat de software kan worden geïntegreerd met die van de massaspectrometer die voor de analyse wordt gebruikt.
  2. Sluit het systeem aan op een drievoudige quadrupoolmassaspectrometer. Kies een scheidingskolom. Voor de scheiding van andere lipiden dan PI4P en PI(4,5)P2 kiest u een C18-kolom (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm). Kies voor PI4P en PI(4,5)P2 een C4-kolom met afmetingen 300 Å (1,0 mm x 100 mm x 1,7 μm).
  3. Bereid de mobiele fase die ammoniumformiaat bevat voor door ammoniumformiaat eerst op te lossen in water van massaspec-kwaliteit en vervolgens in organische oplosmiddelen. Sonificeer alle oplosmiddelen die in massaspectrometrie worden gebruikt gedurende 20 minuten om luchtbellen te verwijderen.
  4. Breng de kolom in evenwicht door oplossing A met water + 0,1% mierenzuur en oplossing B met acetonitril + 0,1% mierenzuur te infuseren.
  5. Injecteer het eluaat uit het vloeistofchromatografiesysteem (injectievolume in het bereik van 1-20 μl) in de massaspectrometer voor analyse. Stel het debiet in op 0.1 ml/min en de temperatuur van de kolom op kamertemperatuur. Injecteer het volledige elaatvolume dat uit de kolom komt in de massaspectrometer.
  6. Begin in de monsterinjectiesequentie altijd met een blanco oplosmiddelinjectie (methanol) en bewaar met tussenpozen nette standaardmonsters tussen biologische monsters voor massaspectrometrie, voer kwaliteitscontroles uit (elke zesde run).
  7. Voor de experimentele opstelling van de hybride drievoudige quadrupool-ionenval massaspectrometer, voordat u met het experiment begint, moet u de massaspectrometer kalibreren volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik voor PA, PC en PI elektrospray-ionisatie (ESI) om de ionen te genereren en in positieve modus te werken om de positief geladen lipidesoorten te detecteren. Verkrijg de gegevens en analyseer deze met behulp van de geïnstalleerde data-analysesoftware met het systeem.
  8. Optimaliseer de parameters voor analyse volgens de overeenkomstige interne standaard die wordt gebruikt. De parameters van de massaspectrometer zijn als volgt: verblijftijd = 30 ms; CAD (door botsing geactiveerde dissociatie) = 3 psi; GS1 (brongas 1) = 24 psi en GS2 (brongas 2) = 21 psi; CUR (gordijngas) = 30 psi; IS (ESI-spanning) = 4,5 kV; en TEM (brontemperatuur) = 450 °C.
  9. Gebruik voor PI4P en PI(4,5)P2 de massaspectrometer in de positieve modus. De parameters van de massaspectrometer zijn als volgt: verblijftijd = 65 ms; CAD (door botsing geactiveerde dissociatie) = 2 psi; GS1 (brongas 1) en GS2 (brongas 2) =20 psi; CUR (gordijngas) = 37 psi; IS (ESI-spanning) = 5,2 kV; en TEM (brontemperatuur) = 350 °C.

8. Vloeistofchromatografie in normale fase - monitoring van meervoudige reacties - verbeterde productscan MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Chromatografische omstandigheden
    1. Gebruik een normale fase LC-methode met behulp van een silicakolom, die PA kan scheiden van andere fosfolipiden. Gebruik hexaan:isopropylalcohol:100 mM waterig NH4COOH in de verhouding 68:30:2 als mobiele fase A en isopropylalcohol:hexaan:100 mM waterig NH4COOH in een verhouding van 70:20:10 als mobiele fase B.
      OPMERKING: Deze combinatie zorgde voor de beste scheiding en piekselectiviteit van verschillende moleculaire soorten PA.
    2. Gebruik het chromatografische gedrag van referentieverbindingen (interne standaarden), in termen van resolutie en piekvorm, om de optimale omstandigheden te kiezen.
    3. Voer chromatografische scheiding uit op een normale fase silicakolom (1 mm x 150 mm x 3 μm) bij kamertemperatuur op een ultra-performance vloeistofchromatografiekolom. Stel het injectievolume van de autosampler in op 6 μl en het eluentdebiet op 210 μl/min.
    4. Na 5 minuten evenwicht met 100% van de mobiele fase A, verhoog lineair de mobiele fase B tot 30% gedurende 5 minuten, verder tot 80% gedurende 5 minuten, vervolgens tot 100% gedurende 5 minuten en houd deze constant op 100% gedurende 5 minuten. Breng ten slotte de kolom gedurende 9 minuten weer in evenwicht.
  2. Massaspectrometrie
    1. Gebruik een hybride drievoudige quadrupool-ionenval massaspectrometer die werkt in negatieve ESI-modus. Controle van de werking van het systeem en de gegevensverzameling met behulp van de meegeleverde analysesoftware. Voordat u met het experiment begint, kalibreert u de massaspectrometer volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Optimaliseer de bronparameters met behulp van flow-injectieanalyse van het interne standaardmengsel. Stel dienovereenkomstig de ionennevelspanning = -4,5 kV, brontemperatuur (TEM) = 450 °C, botsingsgeactiveerd dissociatiegas (CAD) = 3 psi in. Gebruik stikstofgas als botsingsgas en stel vernevelingsgas in (GS1) = 24 psi, het hulpgas (GS2) = 21 psi en het gordijngas (CUR) = 30 psi.
    3. Stel de parameters van het verbindingsafhankelijke ionenpad in als declusteringpotentiaal (DP) = -42 V, ingangspotentiaal (EP) = -6 V en botsingsceluitgangspotentiaal (CXP) = -12 V, geoptimaliseerd met behulp van continue infusie van interne standaardmengseloplossing. Registreer volledige productspectra samen met voorloper van product-MRM-overgangen met variërende botsingsenergie (CE) vanaf 12 eV tot 40 eV voor fragmentatieanalyse met behulp van de EPI-scanfunctie die beschikbaar is in de massaspectrometer.
      OPMERKING: De MRM-geactiveerde IDA-gebaseerde EPI registreert tegelijkertijd precursor-ionenproduct, ionenscanning en on-the-fly MS/MS-acquisitie. De MRM verkleinde het ionenscanbereik in quadrupool 1 (Q1) en de ionenval versterkte de ionenfragmenten die door Q2 gingen, waardoor het kwalitatieve vermogen van quadrupool MS/MS aanzienlijk verbeterde, vooral voor het vangen van alle fragmenten die voortkomen uit het voorloperion. In de EPI-modus worden in Q3 meerdere fragmentionen gedetecteerd die afkomstig zijn van de voorloperionen met een betere signaal-ruisverhouding.
    4. Voer MRM-experimenten uit met een CE van 39 eV om een hoge gevoeligheid te verkrijgen. Beperk het maximale aantal MRM tot 75 en de verblijftijd tot 30 ms om de MRM te detecteren en te registreren van een specifiek molecuul dat op enig moment tijdens de run uit de chromatografische kolom elueert. Dit verhoogt de inschakelduur van de machine.
    5. Voer experimentele afstemming uit om de beste ionisatieparameters voor PA te bepalen, zoals hierboven beschreven. Stel voor dit experiment de ionennevelspanning in = -4,5 kV, brontemperatuur (TEM) = 450 °C, botsingsgeactiveerd dissociatiegas (CAD) = 3 psi. Gebruik stikstofgas als botsingsgas. Stel vernevelingsgas in (GS1) = 24 psi, het hulpgas (GS2) = 21 psi en het gordijngas (CUR) = 30 psi.
    6. Onderzoek handmatig alle afstemmingsgegevens om de juiste selectie van ionisatieparameters en productionen te garanderen. Houd rekening met het minimaliseren van mogelijke interferentie tussen MRM-kanalen bij het selecteren van het production. De experimentele parameters die worden gebruikt voor de analyse van alle PA-moleculaire soorten worden weergegeven in tabel 4.
      OPMERKING: De hybride drievoudige quadrupool lineaire ionenval massaspectrometer stelt ons in staat om de MRM-scanmodus te combineren met de scanfunctie van de ionenval, waardoor snel en hoog scannen mogelijk is door gebruik te maken van methoden zoals EPI-scan voor het registreren van nuttige tandemmassaspectra van elke gedetecteerde voorloper. In deze studie hebben we, om verschillende moleculaire soorten PA te identificeren, gebruik gemaakt van deze MRM-EPI gebaseerde MS/MS-benadering op basis van het conventionele drievoudige quadrupool-ionenpad met de EPI-scaneigenschap van de ionenval, gecontroleerd door de analysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bepaling van de lineariteit van de meting in MS. Lineariteit is het vermogen van de MS-methode om resultaten te leveren die recht evenredig zijn met de concentratie van de lipide-analyt. Lineariteit hangt af van (a) de ionisatie-efficiëntie van de lipide-analyt en (b) het ionisatiegedrag van de lipide-analyt bij verschillende concentraties is afhankelijk van de gebruikte ionenbron. Bij elektrospray-ionisatie (ESI) die in dit onderzoek wordt gebruikt, blijft lineariteit b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een aantal bewijslijnen komen samen over meerdere rollen van signaallipiden bij het reguleren van de organisatie en functie van Drosophila-fotoreceptoren. Naast de goed bestudeerde rol van lipiden bij het reguleren van fototransductie3, zijn signaallipiden ook betrokken bij eiwittransport en subcellulaire organisatie 23,30,39,40,41.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het werk dat in dit manuscript wordt beschreven, werd ondersteund door het Department of Atomic Energy, Government of India (Project Identification No. RTI 4006), het Department of Biotechnology, Government of India (BT/PR4833/MED/30/744/2012) en een India Alliance Senior Fellowship (IA/S/14/2/501540) naar PR. We danken de NCBS Mass Spectrometry Facility, in het bijzonder Dr. Dhananjay Shinde en leden van het PR-lab voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van deze methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 N methanolische HCLVoor totale lipide-isolatie
0,88% KClSigma AldrichP9541Voor totale lipide-isolatie
1,5 ml / 2ml LoBind Eppendorf buisjesEppendorf,022431081/022431102Voor totale lipide-isolatie
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polare lipiden999974Lipide interne standaard
37% zuivere HClSigma Aldrich320331Voor totale lipide-isolatie
96-wells plaatTotale organische fosfaat assay
AcetonFisher Scientific32005Voor dissecties
Ammonium molybdaatTotale organische fosfaat assay
AscorbinezuurTotale organische fosfaat assay
Bath sonicator
BEH300 C18 kolom [1,0 mm x 100mm x 1,7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
MeshouderFine Scientific Tools10052-11Voor dissecties
BOD-incubatorTotale organische fosfaat assay
Breekbare mesjesFine Scientific tools10050-00Voor dissecties
ButterpapierGE healthcare10347671Voor dissecties
C4, 300 A0, [1,7 μm x1 mm x 100 mm] kolomWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Kroonluchter amber kleur glazen flesjes met insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polare lipiden860517Lipide interne standaard
d5-Fosfatidylinositol 3,5-bisfosfaat [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polare lipiden850172Lipide interne standaard
DissectiemicroscopenOlympusSZ51Voor dissecties
Droge verwarmingsbad.
Eluent AHexaan:Isopropyl alcohol:100 mM waterige ammonium acetaat (68:30:2), voor LC
Eluent BHexaan:Isopropyl alcohol:100 mM waterige ammonium acetaat (70:20:10), voor LC
FilterpapierIndica-HM274039Voor dissecties
KolvenBorosilVoor dissecties
VliegenNANARaghu Padinjat lab
VliegvoerNANANCBS lab keuken, samenstelling: maïsmeel 80 g/L, D-glucose 20 g/L, sucrose 40 g/L, agar 8 g/L, gistextract 15 g/L, propionzuur 4 mL, TEGO (methyl para hydroxybenzoaat) 0,7 g/L, orthofosforzuur 0,6 mL)
PincettenFine Scientific Tools11254-20Voor dissecties
Afzuigkap
TrechterBorosilVoor dissecties
Glazuur azijnzuurFisher ScientificA35-500Voor derivatisatie
Glazen flessen: transparant en amber kleurVoor totale lipide-isolatie
Hoge temperatuurbestendige fosfaatvrije glazen buisjes.Totale organische fosfaat assay
Homogenisatiebuisjes met zirkoniumoxide kralenVoor totale lipide-isolatie
Homogenisator instrumentPrecellys
Bevochtigde CO2 aangesloten op vliegpadsVoor vliegduwen
Incubator met gecontroleerde verlichtingPanasonic SanyoMIR-553Voor vlieg fokken
Aanvankelijke organische mixmethanol:chloroform (2:1), Voor totale lipide-isolatie
LC-MS grade ChloroformSigma Aldrich650498Voor totale lipide-isolatie
LC-MS grade MethanolSigma Aldrich34860Voor totale lipide-isolatie
LC-MS grade waterSigma Aldrich34877Voor totale lipide-isolatie
LichtmeterHTC instrumentenLX-103
Tips met lage retentieEppendorf0030072006/72014/72022/72030Voor totale lipide-isolatie
LTQ Orbitrap XL instrumentThermo Fisher Scientific, Bremen, Duitsland
Lysofosfatidylzuur (LPA)- 13:0Avanti polare lipidenLM-1700Lipide interne standaard
Lysofosfatidylzuur (LPA)- 17:1Avanti polare lipidenLM 1701Lipide interne standaard
Lysofosfatidylcholine (LPC) -13:0Avanti polare lipidenLM-1600Lipide interne standaard
Lysofosfatidylcholine (LPC) -17:1Avanti polare lipiden855677Lipide interne standaard
Lysofosfatidylcholine (LPC)- 19:0Avanti polare lipiden855776Lipide interne standaard
Perchlorazuur.Totale organische fosfaat assay
Fosfaatstandaard kaliumdiwaterstoffosfaatTotale organische fosfaat assay
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)NANASamenstelling: 137mMNaCl, 2,7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, en 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Fosfatidylzuur (PA)- 12:0/13:0Avanti polare lipiden, LM-1400Lipide interne standaard
Fosfatidylzuur (PA)- 17:0/14:1Avanti polare lipidenLM-1404Lipide interne standaard
Fosfatidylzuur (PA)-(17:0/1

Referenties

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fosfolipase C bètaPI(45)P2-hydrolyseTRP-kanalenTRPL-kanalenlipidquantificatiemoleculaire geneticasensorische transductie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.