Laagmicrodissectie van tricuspidalisklepfolders voor biaxiale mechanische karakterisering en microstructurele kwantificering

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de biaxiale mechanische karakterisering, gepolariseerde spatial frequency domain imaging-based collageenkwantificering en microdissectie van tricuspidalisklepfolders. De meegeleverde methode verheldert hoe de folderlagen bijdragen aan het holistische foldergedrag.

Samenvatting

De tricuspidalisklep (TV) regelt de unidirectionele stroom van ongeoxygeneerd bloed van het rechter atrium naar de rechter ventrikel. De tv bestaat uit drie folders, elk met uniek mechanisch gedrag. Deze variaties tussen de drie tv-folders kunnen verder worden begrepen door hun vier anatomische lagen te onderzoeken, namelijk de atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) en ventriculaireis (V). Hoewel deze lagen aanwezig zijn in alle drie de tv-folders, zijn er verschillen in hun diktes en microstructurele bestanddelen die hun respectieve mechanische gedrag verder beïnvloeden.

Dit protocol bevat vier stappen om de laagspecifieke verschillen op te helderen: (i) het mechanische en collageenvezelarchitectuurgedrag van de intacte tv-folder karakteriseren, (ii) de samengestelde lagen (A / S en F / V) van de tv-folder scheiden, (iii) dezelfde karakteriseringen uitvoeren voor de samengestelde lagen en (iv) post-hoc uitvoeren histologische beoordeling. Dit experimentele raamwerk maakt op unieke wijze de directe vergelijking van het intacte tv-weefsel met elk van de samengestelde lagen mogelijk. Hierdoor kan met dit protocol gedetailleerde informatie over de microstructuur en biomechanische functie van de tv-folders worden verzameld. Dergelijke informatie kan mogelijk worden gebruikt om tv-computationele modellen te ontwikkelen die richtlijnen proberen te bieden voor de klinische behandeling van tv-ziekten.

Inleiding

De tv bevindt zich tussen het rechter atrium en de rechter ventrikel van het hart. Gedurende de hele hartcyclus reguleert de tv de unidirectionele bloedstroom via het cyclisch openen en sluiten van de tv-anterieure folder (TVAL), de tv-posteriorfolder (TVPL) en de tv-septumfolder (TVSL). Deze blaadjes zijn complex en hebben vier verschillende anatomische lagen - de atrialis (A), de spongiosa (S), de fibrosa (F) en de ventriculaireis (V) - met unieke microstructurele bestanddelen. De elastinevezels in de atrialis en ventriculaireis helpen het weefsel te herstellen naar zijn ongevormde geometrie na mechanische belasting¹. De fibrosa bevat daarentegen een dicht netwerk van golvende collageenvezels die bijdragen aan het draagvermogen van de bijsluiters². Voornamelijk bestaande uit glycosaminoglycanen, is de spongiosa verondersteld om scheren tussen folderlagen mogelijk te maken tijdens hartklepfunctie³. Hoewel alle drie de foldertypen dezelfde anatomische lagen hebben, zijn er variaties in de diktes van de lagen en de samenstellingsverhoudingen die implicaties hebben voor folderspecifiek mechanisch gedrag.

Onderzoekers hebben de eigenschappen van de tv-folders onderzocht met behulp van vlakke mechanische karakteriseringen, histomorfologische beoordelingen en optische karakteriseringen van de collageenvezelarchitectuur. Planaire biaxiale mechanische karakteriseringen proberen bijvoorbeeld fysiologische belasting na te bootsen door loodrechte verplaatsingen op het weefsel toe te passen en de bijbehorende krachten te registreren. De resulterende krachtverplaatsing (of stress-stretch) observaties hebben aangetoond dat alle drie de tv-folders niet-lineair, richtingspecifiek mechanisch gedrag vertonen met meer duidelijke folderspecifieke reacties in de radiale weefselrichting ^4,5,6. Aangenomen wordt dat dit folderspecifieke gedrag voortkomt uit verschillen in de microstructurele eigenschappen die worden waargenomen met behulp van standaard histologische technieken ^6,7. Verder zijn de tweede harmonische generatie beeldvorming⁶, small-angle light scattering⁸ en polarized spatial frequency domain imaging⁷ (pSFDI) gericht op het begrijpen van deze microstructurele eigenschappen en hebben ze folderspecifieke verschillen aangetoond in de collageenvezeloriëntatie en vezelkrimp die implicaties hebben voor het waargenomen mechanische gedrag op weefselniveau. Deze studies hebben ons begrip van de weefselmicrostructuur en zijn rol in gedrag op weefselniveau aanzienlijk verbeterd. Er moet echter nog veel worden aangepakt bij het experimenteel verbinden van de weefselmechanica en de onderliggende microstructuur.

Onlangs heeft dit laboratorium mechanische karakteriseringen uitgevoerd van de tv-folderlagen gescheiden in twee composietlagen (A / S en F / V) met behulp van een microdissectietechniek⁹. Dat eerdere werk benadrukte verschillen in de mechanische eigenschappen van de lagen en hielp inzicht te geven in hoe de gelaagde microstructuur bijdraagt aan het mechanische gedrag van het weefsel. Hoewel dit onderzoek ons begrip van de microstructuur van de tv-folder verbeterde, had de techniek verschillende beperkingen. Ten eerste werden de eigenschappen van de samengestelde lagen niet direct vergeleken met het intacte weefsel, wat leidde tot een gebrek aan volledig begrip van de relatie tussen mechanica en microstructuur. Ten tweede werd de collageenvezelarchitectuur van de samengestelde lagen niet onderzocht. Ten derde werden alleen de lagen van de TVAL onderzocht vanwege problemen met het verzamelen van de samengestelde lagen uit de andere twee tv-folders. De hierin beschreven methode biedt een holistisch karakteriseringskader dat deze beperkingen overwint en volledige karakteriseringen van de tv-folders en hun samengestelde lagen biedt.

Dit artikel beschrijft de microdissectietechniek die de drie tv-folders scheidt in hun samengestelde lagen (A / S en F / V) voor biaxiale mechanische en microstructurele karakteriseringen 10,11,12. Dit iteratieve protocol omvat (i) biaxiale mechanische testen en pSFDI-karakterisering van de intacte folder, (ii) een nieuwe en reproduceerbare microdissectietechniek om op betrouwbare wijze de samengestelde tv-lagen te verkrijgen, en (iii) biaxiaal mechanisch testen en pSFDI-karakterisering van de samengestelde tv-lagen. Het weefsel werd blootgesteld aan biaxiale trekbelasting met verschillende krachtverhoudingen voor mechanisch testen. Vervolgens werd pSFDI gebruikt om de oriëntatie en uitlijning van collageenvezels bij verschillende geladen configuraties te bepalen. pSFDI behoudt de native collageenvezelarchitectuur, maakt belastingsafhankelijke analyse mogelijk en omzeilt de typische noodzaak om weefsel te fixeren of te verwijderen voor collageenvezelarchitectuuranalyse, zoals bij beeldvorming van de tweede harmonische generatie of lichtverstrooiing onder een kleine hoek. Ten slotte werden de weefsels bereid met behulp van standaard histologische technieken om de weefselmicrostructuur te visualiseren. Dit iteratieve en holistische raamwerk maakt de directe vergelijking mogelijk van de mechanische en microstructurele eigenschappen van de tv-folder met de samengestelde lagen.

Protocol

Alle hierin beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Oklahoma. Dierlijke weefsels werden verkregen van een usda-goedgekeurd slachthuis.

1. Biaxiale mechanische karakterisering

1. Weefselvoorbereiding
   1. Haal een tv-folder uit de vriezer, scheermesjes, een chirurgische pen, een tang, een pipet met gedeïoniseerd (DI) water en een snijmat. Ontdooi de tv-folder met 2-3 druppels DI-water op kamertemperatuur.
      OPMERKING: DI-water wordt gebruikt in plaats van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om PBS-geïnduceerde problemen voor de laagmicrodissectie te voorkomen.
   2. Leg het monster plat op de snijmat met de ventriculaireislaag (d.w.z. het oppervlak met de chordae-inbrengingen) naar boven gericht. Plaats het monster zo dat de radiale richting uitlijnt met de Y-richting en de omtrekrichting uitlijnt met de X-richting.
      OPMERKING: De omtrekrichting is gericht langs de omtrek van de klep.
   3. Onderzoek de chordae inbrenglocaties van het weefsel. Bepaal een gebied, idealiter ~ 12 x 12 mm, met de minste hoeveelheid grote chordae-inserties terwijl extreem dunne (d.w.z. transparante) gebieden worden vermeden (figuur 1).
   4. Draai het monster om zodat het atriale oppervlak (d.w.z. het oppervlak zonder chordae-inserties) naar boven is gericht. Zorg ervoor dat de circumferentiële en radiale deelrichtingen uitgelijnd blijven met respectievelijk de X- en Y-as.
   5. Snijd een vierkant monster van 12 x 12 mm uit het deeldeelweefsel dat de grote chordae-inbrengingen of dunne gebieden vermijdt die in stap 1.1.3 zijn geïdentificeerd. Verwijder de bijgesneden delen van het deelblaadjespapier met de tang en plaats ze in een afvalcontainer.
      1. Als het niet mogelijk is om grote chordae-inserties volledig te vermijden, snijdt u de weefsels zo dat ze langs de rand van het vierkante exemplaar liggen. Het vermijden van chordae-inserties is belangrijk omdat het problemen voor de latere microdissectie helpt voorkomen.
   6. Gebruik een chirurgische pen om een kleine stip in de rechterbovenhoek te plaatsen om de oriëntatie van het monster te volgen. Laat de inkt ongeveer 30 s drogen.
   7. Draai het monster om met het ventriculaire oppervlak (d.w.z. het oppervlak met chordale inserties) naar boven gericht. Snijd de koraalaanhechtingen op de achterkant van het weefsel door de chordae uit de bijsluiter te rekken en een scheermesje te gebruiken om in de buurt van de inbrenglocatie te snijden. Draai het monster opnieuw om zodat het atriale oppervlak (d.w.z. het gladde oppervlak) naar boven is gericht.
2. Diktemeting
   1. Haal een contactloze laserverplaatsingssensor op. Nul de verplaatsingssensor op een plat gedeelte van de snijmat in de buurt van het bijgesneden weefsel.
      LET OP: Laat de laser niet direct in de ogen schijnen.
   2. Plaats de laser over het centrale gebied van het monster. Verwijder lucht die vastzit onder het oppervlak van de folder, omdat dit meetfouten kan veroorzaken. Om opgesloten lucht vrij te maken, gebruikt u een pincet om de bel naar de rand van het weefsel te duwen of tilt u een hoek van het weefsel op.
   3. Noteer de dikte die wordt weergegeven op het display van de verplaatsingssensor. Herhaal nog twee metingen op andere locaties van het monster.
   4. Bereken de gemiddelde bladdikte met behulp van de drie metingen die in de vorige stap zijn geregistreerd. Gebruik deze waarde bij het maken van de biaxiale mechanische karakteriseringsprotocollen.
3. Biaxiale testeropstelling en weefselmontage
   1. Bereid een DI-waterbad bij 37 °C voor, volgens de richtlijnen van het testsysteem, om de temperatuur onder in vivo fysiologische omstandigheden te garanderen.
   2. Haal een tang, het weefselmonster, bevestigingsmateriaal, een gereedschap met fijne punt, vloeibare cyanoacrylaatlijm en zwartgeverfde glaskralen (diameter: 300-500 μm) op.
      OPMERKING: Bevestigingsmateriaal omvat de tanden, de montagebrug en het montagerubber.
   3. Monteer het weefselmonster op het testsysteem. Zorg ervoor dat de omtrekrichting van het weefsel overeenkomt met de X-richting, die kan worden bijgestaan door de stip die eerder in stap 1.1.6 is geplaatst.
      OPMERKING: De tanden die hier worden gebruikt, moeten gelijkmatig over de gehele lengte van de weefselrand worden verdeeld. De effectieve randlengte is ingesteld op 10 mm voor het intacte weefsel en >3,3 mm voor de composietlagen.
4. Fiduciale marker plaatsing
   1. Identificeer het centrale een derde vierkante gebied van het gemonteerde weefsel. Gebruik de geschatte hoeken van dit gebied voor de plaatsing van de fiduciale markering.
   2. Plaats glazen kralen in een open weegboot en maak een kleine plas vloeibare cyanoacrylaatlijm in een aparte weegboot. Bedek de bovenkant van het gereedschap met fijne punt met een kleine hoeveelheid lijm. Dep overtollige lijm aan de zijkant van de weegboot.
   3. Maak een hoek van de centrale vierkante array van een derde door de met lijm bedekte punt voorzichtig op het weefsel te drukken. Pak met een tang een glazen kraal en plaats deze voorzichtig op de lijmpunt. Gebruik de camera van het biaxiale testapparaat voor hulp bij het plaatsen van de kraal.
   4. Herhaal stap 1.4.2 en 1.4.3 voor drie extra kralen totdat de vierkante array is voltooid. Zorg ervoor dat de kralen stevig zijn bevestigd en dat hun respectieve lijmpunten elkaar niet raken of aan elkaar plakken. Droog de lijm voordat je het weefsel in het waterbad laat zakken.
      1. Als de kralen aan elkaar zijn geplakt, wacht dan tot de lijm is opgedroogd en gebruik vervolgens de tang om de kraal of lijm voorzichtig vast te pakken en van het weefsel te trekken.
         OPMERKING: De lijm en kraal(s) moeten loskomen, zodat de kraalplaatsing opnieuw kan worden geattempt.
5. Voorconditionering
   1. Maak een krachtgestuurd voorconditioneringsprotocol, waarbij het weefsel met randlengte en -dikte zes herhalingen van equibiaxiale belasting ondergaat tot een piekmembraanspanning T-piek van 40 N / m met een voorspanning van 3% × _T-piek¹⁰ en rek- en hersteltijden van elk 30 s.
      1. Stel een willekeurige testmap samen waarin de gegevens tijdelijk worden opgeslagen voor toekomstige berekeningen. Stel de laadsnelheid in op 4,42 N/m.
      2. Maak een nieuwe testparameterset met de naam Preconditioning0. Stel de besturingsmodi X-as en Y-as in op forceren en stel de besturingsfuncties in op stap. Definieer de belastingsomvang als de kracht geassocieerd met _T-piek, d.w.z. f_peak = T_peak · L. Definieer de voorspanningsgrootheid als 3% van de_f-piek alleen voor de eerste herhaling en definieer zowel de rekduur als de herstelduur als 30 s. Definieer het aantal herhalingen als 10.
         OPMERKING: De berekende piek eerste Piola-Kirchhoff stress, d.w.z. P_piek = T_piek / t, kan hoger zijn dan 200 kPa voor dunnere weefsels, wat kan resulteren in weefselscheuren tijdens het testen. In deze scenario's werd de piekmembraanspanning aangepast naar een maximale eerste Piola-Kirchhoff-spanning van 200 kPa.
   2. Voer het preconditioningprotocol uit. Noteer na de voorconditionering de huidige X- en Y-afmetingen van het monster voor gebruik in de biaxiale testprotocollen.
6. Creatie en uitvoering van biaxiale testprotocollen
   1. Bepaal de tijd die nodig is om de piek equibiaxiale configuratie te bereiken van de post-preconditioned configuratie met de gewenste verplaatsingssnelheid. Uitgaande van een constante verplaatsingssnelheid, berekent u de laadtijden voor de resterende laadverhoudingen (d.w.z. T_XX: T_YY = 1: 0,5 en T_XX: T_YY = 0,5: 1).
   2. Jog de lineaire actuatoren handmatig om de doelkrachten voor een bepaalde belastingsverhouding aan te passen. Herhaal dit proces en noteer de folderafmetingen voor alle laadverhoudingen.
   3. Bereid een verplaatsingsgestuurd testprotocol voor dat het weefsel biaxiaal verplaatst van de post-geconditioneerde configuratie naar de configuraties die zijn vastgelegd in stap 1.6.2 (d.w.z. T_XX: T_YY = 1: 1, 1: 0.5, 0.5: 1) binnen de tijden bepaald in stap 1.6.1. Zorg ervoor dat elk protocol drie laad- en loscycli heeft voor herhaalbaarheid van het mechanische gedrag.
      1. Stel een testmap samen waarin de gegevens worden opgeslagen voor toekomstige berekeningen. Zorg ervoor dat de mapnaam overeenkomt met het huidige exemplaar.
      2. Stel een nieuwe testparameterset samen met de naam 1:1, stel de besturingsmodi X-as en Y-as in op verplaatsing en stel de besturingsfuncties in op helling. Definieer de rekgrootte als de configuratie die is vastgelegd in stap 1.6.1. Definieer de preload magnitude als 3% van f_piek voor alleen de eerste herhaling, en definieer zowel de duur van de rek als de herstelduur als de tijd die is vastgelegd in stap 1.6.1. Definieer het aantal herhalingen als 3.
      3. Herhaal stap 1.6.3.2 voor de resterende belastingsverhoudingen (d.w.z. T_XX:T_YY = 1:0.5 en T_XX:T_YY = 0,5:1), behalve het definiëren van de voorspanningsgrootheid als niet toegepast. Zorg ervoor dat de omvang van de rek, de duur van de rek en de herstelduur overeenkomen met die welke zijn vastgelegd in stap 1.6.2.
         OPMERKING: Alleen gegevens van de laatste (derde) cyclus worden gebruikt voor stress- en spanningsanalyses.
   4. Voer de verplaatsingsgestuurde protocollen uit. Na voltooiing van biaxiaal testen, keert u het weefsel terug naar zijn vooraf geconditioneerde afmetingen.
      OPMERKING: De test moet onmiddellijk worden afgebroken als het weefsel begint te scheuren.
7. Verdere karakteriseringen
   1. Laat het weefsel ondergedompeld in DI-water en gemonteerd op het biaxiale testsysteem. Voer pSFDI-beeldvorming uit zoals beschreven in stap 2.1-2.3.
   2. Monteer het weefsel. Als het een intact weefsel is, ga dan verder met de microdissectie beschreven in stap 3.1-3.7. Zo niet, verzamel dan histologie volgens stap 3.7.
      OPMERKING: Het DI-waterbad kan binnen dezelfde dag worden gebruikt voor volgende karakteriseringen.
   3. Herhaal stap 1.2-1.7 met de A/S- en F/V-lagen die zijn verkregen na de microdissectie (stappen 3.1-3.6).
      OPMERKING: De herhaling van het testprotocol voor de lagen maakt een directe vergelijking van het intacte weefsel met zijn eigen lagen mogelijk.
8. Biaxiale testgegevens na verwerkingsprocedures
   1. Voer digitale beeldcorrelatie uit van de verkregen biaxiale testbeelden om de tijdsafhankelijke markeringsposities te bepalen. Bereken de fiduciale markerverplaatsingen via Eq (1). ⁵
      (1)
      Hierin zijn x_i(t), X_i en d_i(t) de tijdsafhankelijke locatie, de initiële (referentie)locatie en de verplaatsing van marker i.
   2. Bereken de vervormingsgradiënt F door de fiduciale markers te beschouwen als een bilineair eindig element met vier knooppunten, zoals weergegeven in Eq (2)⁵
      (2)
      Waarbij B_Xi en B_Yi de afgeleiden zijn van de vormfuncties voor knooppunt i in respectievelijk de X- en Y-richting, en u_i(t) en v_i(t) de componenten van d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. Bereken de toegepaste eerste Piola-Kirchhoff spanning P met behulp van de opgenomen krachten, zoals in Eq (3)⁵
      (3)
      P_XX en P_YY zijn de X- en Y-componenten van P; L en t zijn de lengte en dikte van de weefselrand; f_X en f_Y zijn de krachten die in de X- en Y-richting zijn geregistreerd.
   4. Bepaal indien nodig andere spannings- en stressmaatregelen,13 waaronder de juiste Cauchy-Green vervorming C = F^T/F, de Green-Lagrange stam E = (C - I)/2, de Cauchy stress σ = ^J-1PF^T en de tweede Piola-Kirchhoff spanning S = ^F-1P.
      OPMERKING: Hierin is I een tweede-orde identiteitstensor en J = det(F) is de Jacobiaan van de vervormingsgradiënt F.

2. Gepolariseerde ruimtelijke frequentie domein beeldvorming

1. Systeemvoorbereiding
   OPMERKING: Indien gewenst kunnen de fiduciale markers voorafgaand aan de volgende stappen uit het weefsel worden verwijderd.
   1. Centreer het pSFDI-apparaat over het monster (figuur 2). Schakel de projector in en verlicht het monster met 490 nm (cyaan) licht.
   2. Open de camerasoftware en inspecteer het gezichtsveld van de camera. Zorg ervoor dat het monster gecentreerd is in het frame en volledig in het gezichtsveld is opgenomen.
   3. Als het gemonteerde monster een intacte folder is, past u de helderheid van de DLP-projector (Digital Light Processing) aan om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig wordt verlicht zonder verblinding op het weefseloppervlak. Pas de helderheid niet aan als het monster een van de samengestelde lagen is.
   4. Draai de polarisator over het volledige bewegingsbereik om mogelijke schitteringen of vuil op de polarisatorlens te detecteren. Reinig de polarisatorlens indien nodig zorgvuldig met een microvezeldoek.
2. Dataverzameling
   OPMERKING: De volgende gegevensverzameling kan worden geautomatiseerd met behulp van software, zoals LabVIEW of Python.
   1. Verplaats de polarisator naar zijn thuispositie - ideaal uitgelijnd met een van de biaxiale testassen. Leg één grijswaardenafbeelding vast en sla deze op de computer op met de polarisatorlocatie (d.w.z. 0°).
   2. Draai de polarisator 5° en leg een ander grijswaardenbeeld vast. Herhaal dit proces om 37 beelden te verkrijgen die variëren van 0° tot 180° met een toename van 5°.
      OPMERKING: De beelden van de eerste pSFDI-beeldvormingssequentie kunnen voorlopig worden geanalyseerd om de gewenste optische respons van het weefsel te garanderen. Raadpleeg stap 2.3 voor instructies.
   3. Herhaal de pSFDI-beeldvormingssequentie voor andere gewenste weefselconfiguraties, bijvoorbeeld de piekconfiguraties van de belastingsprotocollen die worden overwogen voor biaxiaal mechanisch testen.
3. Procedures voor de naverwerking van pSFDI-gegevens
   OPMERKING: De volgende methode bevat stappen voor de MATLAB-programmataal. In plaats daarvan kan echter elke voorkeurstaal (bijv. Python, C ++) worden gebruikt.
   1. Gebruik de functie MATLAB imread() om arrays samen te stellen die de pixelgewijze intensiteiten van de 37 verkregen afbeeldingen bevatten. Rangschik deze voor het gemak als een n × m × 37 driedimensionale array, waarbij n en m de aantallen pixels langs de twee assen zijn.
   2. Definieer het gewenste weefselgebied (ROI) met behulp van de door de gebruiker gedefinieerde grabit() -functie.
   3. Pas de intensiteit versus polarisatorhoekgegevens voor elke ROI-pixel aan met behulp van een Fourier-reeks van 3 termijnen, zoals in Eq (4):
      (4)
      Hierin is I(θ) de pixelgewijze intensiteit als functie van de polarisatiehoek, en b_i zijn de Fourierconstanten. Gebruik standaard lineaire kleinste-kwadraten regressie om b_i te bepalen.
   4. Bepaal de pixelgewijze vezeloriëntatie als de polarisatiehoek die wordt geassocieerd met de maximale waarde van I(θ). Bereken de mate van optische anisotropie (DOA) via Eq (5).
      (5)
   5. Gebruik plot() en histogram() om de verworven vezeloriëntatie en DOA-waarden te visualiseren. Sla de verwerkte resultaten op voor later gebruik.

3. Microdissectie van tricuspidalisklepfolder composietlagen

1. Weefselaanhechting aan wasbord
   1. Verzamel de benodigde materialen: wasbord, DI-water, pipet, scalpel, microschaar, dunne tang, gebogen tang, dikke tang en pinnen.
      OPMERKING: Gebruik alleen een pincet zonder tanden of grepen, omdat een tang van dit type heel gemakkelijk het dunne weefsel van de A / S-laag kan scheuren bij het uitvoeren van de dissectie.
   2. Ontkoppel het weefsel van de biaxiale tester en meet de dikte met behulp van de laserverplaatsingssensor die in stap 1.2 wordt beschreven. Leg het doekje op de wasplank.
   3. Onderzoek de ventriculaire kant van het weefsel op grote chordae inserties. Noteer de positie van deze inserties om ze tijdens de dissectie te vermijden (aanvullende figuur S1). Maak een foto ter referentie.
   4. Spreid het weefsel plat op de wasplank met de atrialis naar boven gericht. Bevestig het weefsel op het bord met behulp van de pinnen:
      1. Plaats in elke hoek van het weefsel een pin die schuin van het weefsel af staat (voor een beter zicht) en het weefsel iets strak trekt (figuur 3A). Doe dit met de klok mee of tegen de klok in. Zorg ervoor dat de pinnen zich buiten de gaten bevinden die door de tanden zijn gemaakt bij het monteren van het weefsel.
      2. Pas de plaatsing van de pin iets aan om ervoor te zorgen dat het weefsel strak en in een vierkante configuratie is (figuur 3B) zodat het weefsel plat ligt en niet verschuift tijdens de microdissectie van de laag.
      3. Plaats indien nodig pinnen langs de zijkant van het weefsel tijdens de dissectie om het weefsel meer uit te rekken. Houd er bij het plaatsen en hengelen van extra pinnen rekening mee dat deze tijdens de dissectie moeten worden bewerkt.
      4. Verwijder de fiduciale markers van de glaskraal.
         OPMERKING: De volgende stap is optioneel. Het toegevoegde DI-water helpt de weefselhydratatie te behouden en voorkomt dat het weefsel tijdens de microdissectie aan zichzelf kleeft.
      5. Plaats met behulp van een pipet DI-water op het oppervlak van het weefsel, zodat het het weefsel op een belachtige manier volledig bedekt. Vul het DI-water indien nodig aan tijdens de dissectie.
2. Maak de eerste hoek.
   1. Selecteer een hoek van het vastgemaakte exemplaar om de dissectie te starten. Vermijd grote chordae inserties en extreem dunne gebieden.
   2. Maak een snede in de A/S-laag door het scalpel lichtjes over het weefseloppervlak langs de montagegaten van mechanische tests te slepen (figuur 3C). Zorg ervoor dat de snede minstens 5 mm lang is en dat de randen van de snede uit elkaar beginnen te trekken, waardoor de F/V-laag eronder zichtbaar wordt.
   3. Gebruik de dunne tang (zonder scherpe punt) om stevig langs de snede te wrijven en de randen van de snede uit elkaar te trekken (Supplemental Figure S2).
      1. Als de snee in de A/S-laag niet uit elkaar begint te trekken, trek dan met het scalpel lichtjes over dezelfde snede totdat deze dit begint te doen. Zorg ervoor dat u niet te diep in het weefsel snijdt (voorbij de A / S-composietlaag), omdat dit het moeilijker maakt om de lagen schoon te scheiden.
   4. Herhaal stap 3.2 en 3.2.3 om een tweede snede loodrecht op de eerste snede te maken (figuur 3D). Zorg ervoor dat de twee sneden met elkaar verbonden zijn en een hoek vormen.
      1. Als de twee sneden niet met elkaar verbonden zijn, laat u het dunne pincet onder het kleine gebied van weefsel dat de twee sneden scheidt (aanvullende figuur S3). Gebruik vervolgens voorzichtig de schaar om het weefsel te knippen.
3. Haal het weefsel uit de hoek.
   1. Wrijf langs de sneden met behulp van de dunne tang totdat het weefsel begint te scheiden van de F / V-laag. Zodra een klein stukje weefsel is gescheiden, pak je het vast met het pincet en trek je het voorzichtig om de samengestelde lagen verder te scheiden.
      OPMERKING: Plaats de punt van het dunne pincet altijd langs de rand van het weefsel tijdens het vastpakken. Anders zouden ze per ongeluk een gat in de A / S-composietlaag kunnen prikken.
   2. Blijf het weefsel afpellen en wrijf over de naad totdat deze het einde van de twee sneden voor de hoek bereikt. Schakel tijdens dit proces over op een groter pincet om het weefsel vast te pakken voor het peelingproces om ongewenst scheuren en scheuren van de A / S-composietlaag te voorkomen.
      1. Als de eerste poging tot bocht grote problemen heeft met de scheiding, probeer dan een andere hoek als uitgangspunt (ga terug naar stap 3.2).
4. Strek sneden uit, pel het weefsel en maak een tweede hoek.
   1. Verleng de twee sneden die voor de eerste hoek zijn gemaakt door de scalpelpunt aan de onderkant van elke snede te plaatsen en deze lichtjes langs het weefseloppervlak te slepen (figuur 4A). Zorg ervoor dat alle verlengstukken ten minste 5 mm zijn en dat de gesneden verlengstukken aansluiten op de originele sneden en de tand- of hechtgaten blijven volgen.
      OPMERKING: Als de extensiesnede te diep is, moet de komende peeling nauwlettend worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat delen van de fibrosa niet worden gescheiden met de A / S-composietlaag (figuur 5A).
   2. Blijf de sneden verlengen en pel de bovenste composiet A / S-laag terug terwijl u over de naad wrijft totdat één kant klaar is. Merk op dat het weefsel volledig wordt gescheiden langs één snede; ervoor zorgen dat de naad tussen de A/S- en F/V-composietlagen recht is (figuur 4B).
   3. Herhaal de instructies in stap 3.2 en stap 3.3 om een tweede hoek loodrecht op het einde van de volledig geschilde zijde te maken (figuur 4C).
5. Scheid de A/S-laag volledig.
   1. Verleng de resterende sneden terwijl u grote chordae-inbrengingen vermijdt. Ga door met het scheiden van de A/S- en F/V-lagen door gebruik te maken van de wrijf- en trektechnieken die voor de eerste bocht worden gebruikt. Noteer verschillende overwegingen of problemen die zich tijdens dit proces kunnen voordoen:
      1. Sluit de chordae-inserties van het A/S-scheidingsgebied (figuur 5B) alleen uit wanneer deze uitsluiting een A/S-monster mogelijk maakt dat groot genoeg is voor experimentele karakteriseringen (>3,3 mm).
      2. Als het weefsel scheurt of een gat vormt, stop dan onmiddellijk met het scheiden van het weefsel. Om te voorkomen dat een pincet wordt gevangen, plaatst u de schaar in een gat dat zich vormt en snijdt u het weefsel weg van het midden. Als het defect zich vormt langs de scheidingsnaad, begin dan met het scheiden van het weefsel langs een andere rand om verder scheuren te voorkomen (figuur 5C).
      3. Zoek naar verbindingen tussen de lagen die kunnen verschijnen tijdens het scheiden van het weefsel en voorkom verdere scheiding van het weefsel zonder een hoog risico op scheuren (figuur 5D). Let op: dit zijn dunne maar sterke strengen die zorgvuldig met een schaar moeten worden geknipt. Vermijd het maken van een gat in de A/S-laag of het naar beneden snijden in de F/V-laag, omdat dit een ongelijke scheiding zou veroorzaken.
      4. Ga door met dit proces totdat het grootst mogelijke monster van de A/S-laag is gescheiden. Markeer de oriëntatie van het monster met de chirurgische pen (figuur 6A).
6. Maak de dissectie af.
   1. Gebruik de schaar om langs de scheidingsnaad voor de resterende weefselrand te knippen (figuur 6B). Zorg ervoor dat deze snede zo dicht mogelijk bij de scheidingsnaad zit.
   2. Leg de gescheiden A/S composietlaag plat op de snijmat. Gebruik indien nodig het scalpel om de randen van het weefsel recht te trekken en een vierkante weefselvorm te creëren die geschikt is voor biaxiaal mechanisch testen. Plaats de A/S-laag in DI-water totdat deze klaar is om te worden getest.
   3. Markeer de oriëntatie van de F/V-laag die op het wasbord achterblijft. Snijd het grootst mogelijke vierkant uit het gebied waar de A/S-laag is verwijderd (figuur 6C) en plaats het vervolgens in DI-water.
7. Histologie
   1. Snijd twee stroken weefsel weg - uitgelijnd met de omtrek- en radiale richtingen - voor gebruik in de histologie. Gebruik verschillende protocollen voor de intacte en de samengestelde lagen (d.w.z. A / S en F / V).
      1. Voor de intacte laag, neem de exemplaren van het weefsel dat op het wasbord blijft vastgepind. Gebruik het weefsel buiten de tand-/hechtgaten, omdat dit deel van het weefsel niet is ontleed en de intacte folder vertegenwoordigt.
      2. Verzamel voor de A/S- en F/V-composietlagen alleen histologiemonsters nadat ze volledig zijn getest en gebeeldhouwd. Maak het monster los van het biaxiale testsysteem, leg het weefsel plat op een snijmat en snijd de omtrek- en radiale strips weg met een scheermesje.
   2. Plaats de weggesneden strips in weefselcassettes en dompel de cassettes onder in 10% formaline.
   3. Gooi het resterende weefsel weg. Reinig de snijgereedschappen met reinigingsmiddel (zie de tabel met materialen).
   4. Breng na 24-48 uur fixatie de cassettes over naar ethanol, waar ze voor onbepaalde tijd kunnen worden bewaard tot histologieverwerking en kleuring.
      OPMERKING: Deze histologische analyse kan bevestigen dat de microdissectie succesvol is. LET OP: 10% formaline veroorzaakt huidirritatie en ernstig oogletsel. Het kan ook een allergische reactie of kanker veroorzaken door inademing. Draag bij het hanteren geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, een bril en een laboratoriumjas, en gebruik deze alleen in goed geventileerde ruimtes, zoals in een zuurkast. Wanneer de opslagcontainer niet in gebruik is, zorg er dan voor dat deze goed gesloten is.

Resultaten

De microdissectie levert A/S- en F/V-monsters op met relatief uniforme diktes die op een (commercieel) biaxiaal testapparaat kunnen worden gemonteerd. Histologische analyse van de intacte folder en de twee ontleedde lagen zal controleren of het weefsel correct werd gescheiden langs de grens tussen de spongiosa en fibrosa (figuur 7). Bovendien kunnen de histologiemicrografieën worden gebruikt om de weefsellaagdiktes en samenstellende massafracties te bepalen met behulp van ImageJ-software. Ee...

Discussie

Kritische stappen voor het protocol zijn: (i) de laagmicrodissectie, (ii) de weefselmontage, (iii) de fiduciale markerplaatsing en (iv) de pSFDI-opstelling. Passende laagmicrodissectie is het belangrijkste en moeilijkste aspect van de hierin beschreven methode. Voordat een onderzoek met behulp van deze techniek wordt gestart, moeten de dissector (en) langdurig oefenen met de microdissectietechniek en alle drie de tv-folders. De dissector moet ervoor zorgen dat de samengestelde laagmonsters voldoende groot zijn (>3,3 mm) ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		reinigingsmiddel
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Laadcelcapaciteit
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps - Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps - Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps - Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Versie 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Versie 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Gemaakt in eigen beheer met behulp van een digitale lichtprojector, lineaire polarisator, roterende polarisatorbeugel en charge-coupled device camera. Zie doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) voor meer details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Gemaakt in eigen beheer met behulp van modelwas en bakplaat
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030