Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Samenvatting

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Samenvatting

Oogziekten omvatten een breed scala aan erfelijke genetische en verworven aandoeningen die aantrekkelijke doelwitten zijn voor lokale medicijnafgifte vanwege hun relatieve gemakkelijke toegankelijkheid via meerdere toedieningsroutes. Subconjunctivale (SCJ) injecties bieden voordelen ten opzichte van andere intraoculaire toedieningsroutes omdat ze eenvoudig, veilig en meestal worden uitgevoerd in een poliklinische setting. SCJ-injecties bij kleine dieren vereisen meestal de hulp van een operatiemicroscoop vanwege de grootte van het oog. Eerder werk heeft aangetoond dat SCJ-injectie van specifieke adeno-geassocieerde virus (AAV) serotypen een geldige genafgiftestrategie is voor gerichte transductie van het oculaire oppervlak, de oogspier, het hoornvlies en de oogzenuw, wat een potentiële aanpak biedt voor de behandeling van veel oogziekten.

Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor SCJ-injecties in een muismodel met behulp van een injectiesysteem dat bestaat uit een programmeerbare infusie- / opzuigspuitpomp (die een consistente en nauwkeurige injectiesnelheid en -druk mogelijk maakt) en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Het injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes zoals intrastromale, intracamerale, intravitreale en subretinale injecties bij kleine dieren. Hoewel de levering van adeno-geassocieerde virale vectoren voor oculaire gentherapiestudies wordt beschreven, kan het protocol hierin ook worden aangepast voor een verscheidenheid aan oogheelkundige oplossingen in modellen voor kleine dieren. De belangrijkste praktische stappen in de toedieningsroute, de installatie van het injectieplatform, de voorbereiding van de injectie en tips uit directe ervaring zullen in detail worden besproken. Daarnaast zullen ook algemene validatietechnieken voor AAV-leveringsbevestiging aan de gewenste weefsels kort worden besproken.

Inleiding

Oogziekten omvatten een breed scala aan zowel genetische als verworven aandoeningen. In 2015 waren wereldwijd naar schatting 36 miljoen mensen juridisch blind en meer dan 1 miljard mensen lijden aan ten minste een zekere mate van visuele beperking, wat de noodzaak benadrukt om de verlichtingsinspanningen op alle niveaus^{op te schalen 1}. De belangrijkste methoden voor het toedienen van oculaire medicijnen omvatten zowel topische als lokale toediening, zoals oogdruppels of subconjunctivale (SCJ), intracamerale, intravitreale en subretinale injecties. Hoewel niet-invasieve topische therapie de meest voorkomende toedieningsmethode is voor oogheelkun....

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. Het gebruik van AAV-vectoren is een biorisico van bioveiligheidsniveau 1. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en een bril bij het hanteren van AAV. Voor het hierin beschreven experiment werd een recombinante AAV-vector gebruikt, verpakt met het serotype 8-kapsel en coderend voor een generieke alomtegenwoordige cytomegalovirus (CMV) -promotor die de expressie van groen fluorescentie-eiwit (GFP) regelt.

Resultaten

Oplossing geïnjecteerd in de subconjunctivale ruimte presenteert zich als een bleb, afhankelijk van het injectievolume.
In dit experiment werd 7 μL AAV (7 × 10⁹ virale genomen (vg)/oog) gemengd met fluoresceïne in een uiteindelijke concentratie van 0,1% geïnjecteerd met een naald van 36 G onder een stereomicroscoop, en de injectiesnelheid/druk werd constant gehouden met behulp van een programmeerbare spuitpomp op 1 μL/s. Een bleb kan verschijnen bij injectie (pijl). Een microscopisch beeld .......

Discussie

AAV-gemedieerde gentherapie heeft een groot potentieel voor de behandeling van oogziekten. De huidige oculaire gentherapie is gebaseerd op twee belangrijke lokale toedieningsroutes, intravitreale en subretinale injecties. Helaas zijn beide routes invasief en kunnen ze ernstige complicaties veroorzaken, waaronder netvliesloslating, cataractvorming en endoftalmitis. Het onderzoek naar relatief minder invasieve routes, zoals SCJ-injectie, is dus van groot belang.

Hoewel deze techniek relatief een.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
36 G NanoFil-naalden	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV-vector	Universiteit van North Carolina in Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP-antilichaam	AVES labs Inc.
Digitale camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA-extractiekit	Qiagen	80204
Pincet	Fine Science Tools	F6521
Hamilton-spuit	Hamilton	7654-01
India-inkt	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injectieoplossing	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Vochtwerende film	Parafilm	807-6
Polyethyleen buis	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0,1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Natriumfluoresceine-oplossing	Sigma-Aldich	46960
Standaard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmeerbare Spuitpomp	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopie	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Oogheelkundige Oplossing 0,5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topische zalf	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazin	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Fenol Rood Draad Doos 100 Draden	ZONE-QUICK	PO6448