Methodenartikel

Atomic Force Microscopie om de fysieke eigenschappen van epidermale cellen van levende Arabidopsis-wortels te bestuderen

DOI:

10.3791/63533

⸱

31 maart 2022

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República (UdelaR), 2Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het atoomkrachtmicroscopie-inkepingsprotocol biedt de mogelijkheid om de rol van de fysische eigenschappen van de celwand van een bepaalde cel van een weefsel of orgaan te ontleden tijdens normale of beperkte groei (d.w.z. onder watertekort).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een methode beschreven om de fysische eigenschappen van de celwand van epidermale cellen van levende Arabidopsiswortels te karakteriseren door middel van nano-indentaties met een atoomkrachtmicroscoop (AFM) in combinatie met een optische omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De methode bestaat uit het toepassen van gecontroleerde krachten op het monster tijdens het meten van de vervorming, waardoor parameters zoals de schijnbare Young's modulus van celwanden bij subcellulaire resoluties kunnen worden gekwantificeerd. Het vereist een zorgvuldige mechanische immobilisatie van het monster en een juiste selectie van inspringers en inkepingsdiepten. Hoewel het alleen in externe weefsels kan worden gebruikt, maakt deze methode het mogelijk om mechanische veranderingen in de celwanden van planten tijdens de ontwikkeling te karakteriseren en maakt het de correlatie van deze microscopische veranderingen met de groei van een heel orgaan mogelijk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plantencellen worden omgeven door een celwand die een complexe structuur is die bestaat uit op elkaar inwerkende netwerken van polysacchariden, eiwitten, metabolieten en water die in dikte varieert van 0,1 tot enkele μm, afhankelijk van het celtype en de groeifase 1,2. Celwand mechanische eigenschappen spelen een essentiële rol bij de groei van planten. Lage stijfheidswaarden van de celwand zijn voorgesteld als een voorwaarde voor celgroei en celwanduitbreiding, en er is steeds meer bewijs dat alle cellen mechanische krachten voelen om hun functies uit te voeren. Er wordt echter nog steeds gediscussieerd of veranderingen in de fysieke eigenschappen van de celwand het lot van de cel bepalen 2,3,4. Omdat plantencellen niet bewegen tijdens de ontwikkeling, hangt de uiteindelijke vorm van een orgaan af van hoe ver en in welke richting een cel uitzet. Arabidopsiswortel is dus een goed model om de impact van fysieke eigenschappen van celwand in celexpansie te bestuderen, omdat verschillende soorten expansie voorkomen in verschillende regio's van de wortel. Anisotrope expansie is bijvoorbeeld duidelijk in de rekzone en vooral merkbaar in de epidermale cellen5.

De hier beschreven methode werd gebruikt om de fysische eigenschappen van de celwand van epidermale cellen op nanoschaal van levende Arabidopsis-wortels te karakteriseren met behulp van een Atomic Force Microscope (AFM) in combinatie met een omgekeerde fluorescentiefasemicroscoop6. Voor een uitgebreide herziening van de AFM-techniek, lees 7,8,9.

Dit protocol schetst een basismethode voor monstervoorbereiding en een algemene methode voor afm-gebaseerde elasticiteitsmetingen van plantencelwanden.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van kracht-indentatie experiment in Arabidopsis wortels met behulp van atomic force microscopie (AFM). Het schema geeft een overzicht van de stappen van een Force-Indentation-experiment vanaf de voorbereiding van het substraat om het wortelmonster stevig te immobiliseren (1-2), bevestiging van de levensvatbaarheid van de wortel door propidiumjodidekleuring (3), cantileverpositionering op het oppervlak van een langwerpige epidermale cel van de primaire wortel (4-5), krachtcurvemeting (6) en krachtcurveverwerking om de schijnbare Young's modulus te berekenen (7-8). EZ: rekzone. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van het plantmateriaal en groeiomstandigheden

  1. Om het benodigde plantmateriaal te genereren, steriliseert u de zaden van het wildtype Arabidopsis en de mutante lijnen van belang.
    OPMERKING: In dit protocol hebben we het volgende gebruikt: ttl1: T-DNA-invoeglijnen Salk_063943 (voor TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) wild-type; de Procuste1 (prc1-1) mutant, die bestaat uit een knock-out mutant (Q720stop) in het CESA6 gen (AT5G64740), zoals eerder beschreven in10,11; en ttl1 x prc1-1 dubbele mutant.
    1. Doe een geschat volume van 50 μL zaden in een microbuisje. Voeg 500 μL 70% ethanol + 0,01% Tween-oplossing toe bij kamertemperatuur. Meng en incubeer gedurende 7 min.
    2. Giet de ethanoloplossing en voeg 500 μL 20% natriumhypochloriet toe. Meng en incubeer gedurende 7 min.
    3. Giet de natriumhypochlorietoplossing en was de zaden drie tot vier keer met steriel water.
  2. Plating
    1. Bereid van tevoren basale Murashige en Skoog (MS) medium12 + 1,5% sucrose + 1% agar (pH 5,7) (zie Materiaaltabel). Autoclaaf het medium. Bereid een laminaire stromingskap voor om in een steriele omgeving te werken en label de vierkante petrischalen die nodig zijn voor het experiment. Giet het medium in de petrischaaltjes en laat het medium stollen.
    2. Leg de gesteriliseerde zaden met steriele pipetpunten op vierkante petrischalen met het medium. Verdeel de zaden gelijkmatig in twee rijen. Als de zaden droog zijn, sluit je de deksels en sluit je de platen af. Stratificeer de zaden bij 4 °C in het donker gedurende 4 dagen.
      OPMERKING: Stratificatie is nodig om de kieming te synchroniseren.
    3. Plaats de platen verticaal in de groeikamer in een lange dagregime (16 uur licht/8 uur donker) met 25 μmol m2 s−1 lichtintensiteit en 23 °C (dag/nacht). Laat de zaailingen 7 dagen groeien.

2. Osmotische stressbehandeling (optioneel)

OPMERKING: Deze sectie geeft details over de groei van Arabidopsis-wortels in osmotisch potentieel van -1,2 MPa zoals geschat door cryoscopische osmometer (Tabel van materialen). Dit deel kan worden weggelaten of gewijzigd, afhankelijk van de experimentele vraag die voorhanden is.

  1. Bereid basaal MS-medium + 1,5% sucrose + 400 mM mannitol + 1% agar (pH 5,7). Autoclaaf het medium. Giet het medium in vierkante petrischaaltjes in de laminaire stromingskap en laat het medium stollen.
  2. Plaats met een pincet (Tabel met Materialen) 5 dagen oude zaailingen die zijn voorgekweekt in basaal MS + 1,5% sucrose-medium in vierkante petrischalen met het medium aangevuld met 400 mM mannitol. Plaats de platen verticaal in de groeikamer onder dezelfde omstandigheden als in stap 1.2.3. Laat de zaailingen groeien onder deze osmotische stressconditie gedurende 7 dagen.
    OPMERKING: Om de wortelgroeiaanpassing van de primaire wortel tijdens ernstige osmotische stress te evalueren, wordt voorgesteld om zaailingen 5 dagen na ontkieming te gebruiken die in gecontroleerde omstandigheden zijn gekweekt om ervoor te zorgen dat de grootte van de wortelmeristem al is vastgesteld13. Als alternatief kan de analyse in elk stadium van ontwikkeling worden uitgevoerd om het ontwikkelingseffect van osmotische stressactie te bepalen.

3. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) nano-inductie-experimenten

  1. Voorbereiding van het monster voor nano-indentatie-experimenten
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap voor het toepassen van AFM op de studie van levende biologische monsters. Het monster moet stevig aan het substraat worden bevestigd om mechanisch stabiel te zijn tijdens inkepingsmetingen. Tegelijkertijd moeten de structurele eigenschappen van monsters behouden blijven. Een effectieve strategie om een grote steekproef voor AFM te stabiliseren, is het gebruik van lijmen. De lijm moet snel drogen en mag niet giftig of reactief zijn met het omringende medium. In dit protocol werden polystyreen petrischalen gebruikt als substraat en niet-zure siliconenlijm (Table of Materials) om de Arabidopsis-zaailingen te binden.
    1. Verdeel een dun laagje siliconenlijm in de petrischaal met een hoeslip. Laat de lijm 45 s in de lucht.
    2. Plaats met een pincet de zaailing op de lijm en richt deze in een richting die contact tussen de uitstekende delen van de zaailing en de uitkraging vermijdt. Druk vervolgens de wortel zachtjes op de siliconenlijmlaag om deze stevig te binden. Laat de zaailing 45 s in contact met de lijm voordat u doorgaat met de volgende stappen van het protocol.
    3. Incubeer de aangehechte zaailingen met 2 μg / ml propidiumjodide (PI; Materiaaltabel) gedurende 5 minuten in het donker en was ze driemaal zorgvuldig met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (Materiaaltabel).
    4. Plaats de PI-geïncubeerde zaailingen in een omgekeerde fluorescentiemicroscoop in combinatie met de AFM. Om fluorescentie te observeren, stelt u de excitatie- en emissiegolflengten in op respectievelijk 572 nm en 617 nm. De afwezigheid van fluorescentie in de epidermale cellen bevestigt de levensvatbaarheid van de wortels.
    5. Bedek de zaailing met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Inspringingsprotocol
    OPMERKING: Voer alle AFM-metingen uit binnen 1 uur na immobilisatie van het monster op de steun bij kamertemperatuur. De ruimte waar de AFM zich bevindt, moet met een airconditioner op 25 °C worden gehouden. De PBS-oplossing moet op dezelfde temperatuur zijn.
    1. Monteer een standaard siliciumnitride cantilever met een piramidale punt (zie Materiaaltabel) in de AFM-sondehouder voor vloeistof (Materiaaltabel).
    2. Lijn de laser uit op de cantilever dicht bij de positie van de punt. Verplaats vervolgens de fotodiode om de laserspot in het midden van de detector te plaatsen.
    3. Om de doorbuigingsgevoeligheid te kalibreren, plaatst u een polystyreen petrischaal met 1x PBS onder de AFM.
      OPMERKING: Deze stap is nodig om de inspringing te berekenen. Wanneer een krachtmeting wordt uitgevoerd op een hard oppervlak, is er geen inkeping in het oppervlak, dus elke verandering in de verplaatsing van de z-scanner komt overeen met de uitbuiging van de cantilever. Daarom is het erg belangrijk om de doorbuigingsgevoeligheid op een hard oppervlak te kalibreren. Het gebruik van een zacht oppervlak zal de doorbuigingsgevoeligheid overschatten, wat zal resulteren in te lage veerconstanten.
    4. Pas de fotodetector zodanig aan dat de contactloze doorbuiging in de buurt van 0 V ligt. Kalibreer de doorbuigingsgevoeligheid door een inkeping (krachtcurve) uit te voeren, met een hellingsgrootte van 3 μm, een inkepings- en retractiesnelheid van 0,6 μm/s en een triggerdrempel van 0,5 V.
    5. Om de veerconstante van de cantilever te kalibreren, gebruikt u het thermal tune-hulpprogramma van de AFM-software (Table of Materials) dat wordt aanbevolen voor sondes met veerconstanten van minder dan ongeveer 5 N/m of gebruikt u de methode beschreven in referentie14. Voordat u Thermal Tune in de software activeert, moet u ervoor zorgen dat de sonde geen interactie heeft met het monster.
      1. Voer de uitkragingstemperatuur in. Klik op Calibrate > Thermal Tune of op het Thermal Tune icoon in de NanoScope werkbalk. Selecteer een frequentiebereik (1-100 Hz).
      2. Klik op Gegevens verkrijgen in het deelvenster Thermal Tune. Wacht tot de AFM gegevens heeft verzameld en klik vervolgens op de knop Simple Harmonic Oscillator (Fluid).
      3. Pas de mediane filterbreedte aan op 3. Pas de PSD-bakbreedte aan om de ruis in de verkregen gegevens te verminderen door middeling. Stel fitgrenzen in rond de eerste resonantiepiek.
      4. Klik op Bereken veerconstante k en klik vervolgens op Ja in het pop-upvenster met de vraag of de gebruiker deze waarde wil gebruiken.
      5. Herhaal de hierboven beschreven stappen drie keer en neem handmatig een gemiddelde van de veerconstantewaarden. Voer deze gemiddelde waarde in het vak Veerconstante in de lijst rampparameter in de PicoForce-weergave in. De kalibratie eindigt op dit punt.
    6. Gebruik de omgekeerde optische microscoop bij 10x, 20x en 40x oculairvergroting en plaats de AFM-sonde op het oppervlak van de vierde langwerpige epidermale cel van de primaire wortel en zorg ervoor dat deze in het midden van de cel wordt geplaatst.
    7. Verkrijg met de berekende veerconstantewaarde (stap 3.2.5.5) krachtcurven met een hellinggrootte van 3 μm, een triggerdrempel van 11 nN en een inkepings- en retractiesnelheid van 0,6 μm/s op geselecteerde punten.
      OPMERKING: Uiteerder werk 15,16 bleek dat een lage frequentie van inkeping en terugtrekking helpt om hysterese en sleepkracht te minimaliseren.
    8. Verkrijg krachtcurves van drie cellen per wortel voor elke behandeling (gebruik drie biologische replicaties per behandeling). Leg ten minste 150 krachtcurven vast voor elke wortel.

4. Meet de schijnbare Young's modulus

  1. Pas elke krachtcurve aan op het volgende model voor piramidale indruklijnen17: figure-protocol-1, waarbij E de schijnbare Young-modulus van het monster is, figure-protocol-2 de Poisson-modulus van het monster is en α de halve hoek ten opzichte van het hoekpunt is. Gooi de passen weg met een correlatiecoëfficiënt (r2) < 0,99. Overweeg de Poisson-verhouding voor volledig niet-samendrukbaar materiaal: figure-protocol-3 = 0,5 en de geometrie van het indruklichaam dat door de fabrikanten is gegeven.
    OPMERKING: Gebruik de eerste 100 nm vanaf het contactpunt van de belastingscurve om de fitting zo gevoelig mogelijk te maken voor celwandmechanica en om de impact van turgordruk op de schijnbare Young-moduluswaarden8 te verminderen. De aanpassing is gedaan met behulp van een aangepast MATLAB-programma (beschikbaar op persoonlijk verzoek door te schrijven naar J. C. B) waarmee een specifieke inkepingsdiepte kan worden ingesteld vanaf het contactpunt van de laadcurve.
  2. Maak een genormaliseerd histogram met de schijnbare Young's modulusgegevens en pas het aan met een Gaussische verdeling. Gooi gegevenspunten buiten het 95%-betrouwbaarheidsinterval weg en bereken zowel het histogram als de Gaussiaanse fit opnieuw. Bereken en rapporteer de gemiddelde en standaarddeviatie van de schijnbare Young's modulus.
  3. Bepaal de significantie van de vergelijkingen tussen groepen door meerdere vergelijkingstests zoals ANOVA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimenten met force-indentation
De volgende tekst bevat enkele resultaten die worden verwacht wanneer een force-indentation-experiment wordt uitgevoerd om de typische uitvoer weer te geven die u kunt verwachten wanneer het protocol goed is uitgevoerd.

Krachtverplaatsingscurven
Representatieve krachtinkepingsplots die zijn verkregen door levende monsters in te laten inspringen op een positie in het midden van de cel van de wortelrekzone, zijn weergegev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel- en celwandmechanica worden steeds relevanter om inzicht te krijgen in hoe mechanica groeiprocessen beïnvloedt. Naarmate fysieke krachten zich over aanzienlijke afstanden in vaste weefsels voortplanten, wordt de studie van veranderingen in de fysieke eigenschappen van de celwand en hoe ze worden waargenomen, gecontroleerd, afgestemd en de groei van de plant beïnvloeden, een belangrijk studiegebied 2,3,8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten. Het MATLAB-script dat wordt gebruikt voor het aanbrengen van de gegevens is beschikbaar op persoonlijk verzoek door te schrijven naar J. C. B.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door CSIC I+D 2018, subsidie nr. 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) en PEDECIBA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Bevat natriumchloride en fosfaatbuffer en is geformuleerd om osmotische shock te voorkomen en het waterevenwicht in levende cellen te handhaven.
AFM softwareBruker, Billerica, MA, USA
Atomic force microscopy (AFM)BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst Probe holder-fluidBruker, Billerica, MA, USACAT-FCHEen sondehouder voor de Bioscope Catalyst, ontworpen voor vloeibare werking in contact- of Tapping Mode.  Ook compatibel met luchtwerking.
Cryoscopisch osmometer; model OSMOMAT 030Gonotech, Berlijn, Duitsland
Murashige & Skoog MediumDuchess BiochemieM0221Oorspronkelijke concentratie, (1962)
Optical inverted microscope gekoppeld aan de AFMOlympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMILANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentinië100429Neutraal, niet-zure siliconenlijm
PetrischalenDeltalab200201.BPolystyreen, 55 x 14 mm, stralingssteriel.
PropidiumjodideSigmaP4170Voor wortellevensvatbaarheidstest.
Silicionitride sonde, DNP-10, cantilever ABruker, Billerica, MA, USADNP-10/AVoor krachtmodulatie microscopie in vloeibare werking. Sonde tipradius van 20-60 nm. 175-μm-lange driehoekige cantilever,  met een veerconstante van 0,35 N/m.
PincetSigmaT4537

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
  3. Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
  4. Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
  5. Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. Root development. The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).
  6. Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236(2021).
  7. Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
  8. Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
  9. Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
  10. Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
  11. Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
  12. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
  13. Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
  14. Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).
  15. Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
  16. Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
  17. Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
  18. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).
  19. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
  20. Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Atomic Force MicroscopyEpidermal CellsArabidopsis RootsCell Wall PropertiesNanoindentation TechniqueYoung s ModulusMechanical ImmobilizationForce CurvesPyramidal IndenterInverted Fluorescence Microscope

Gerelateerde artikelen