$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ethische verklaring: Alle studies werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Office of Research Protections aan de Universiteit van Pittsburgh.
1. Bereid magnetische kralen voor
OPMERKING: Voer uit voordat u de cel sorteert en houd ijs vast tot gebruik.
- Pipetteer 30 μL conA-geconjugeerde paramagnetische microsferen pareldrijfmestmengsel per reactie op een verse microfugebuis van 1,5 ml en voeg 850 μL bindingsbuffer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen.
OPMERKING: ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen zijn lectine-gecoate magnetische kralen die lipidemembraanbinding mogelijk maken.
- Plaats de buis op een magnetisch rek en laat de kralen 1-2 minuten magnetiseren. Zodra het supernatant is opgeruimd, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de buis uit het magneetrek en was de kralen door ze opnieuw te gebruiken in 1 ml bindingsbuffer.
- Herhaal stap 1.2 en 1.3.
- Magnetiseer de kralen gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant om weg te gooien.
- Verwijder de buis uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 30 μL bindingsbuffer per reactie.
- Houd het gewassen kralenmengsel op ijs totdat de cellen zijn gesorteerd.
2. Oogst cellen
OPMERKING: Deze stap is geschreven voor gehechte cellen en geoptimaliseerd voor murine E14 embryonale stamcellen. Het kweken en oogsten van de cellen is afhankelijk van het celtype.
- Verwijder de cellen uit de incubator van 37 °C en onderzoek ze onder een microscoop om de kwaliteit te garanderen.
- Zuig de media uit de celplaat en spoel af met 5 ml 1x PBS.
- Zuig PBS uit de plaat en oogst de cellen (met behulp van traditionele celoogstmethoden die per celtype zullen verschillen). Verkrijg eencellige suspensie door zo nodig voorzichtig op en neer te pipetteren met een serologische pipet tegen de kweekschaal.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en draai gedurende 5 minuten met 200 x g naar beneden.
- Zuig de media af om de celkorrel weg te gooien en te wassen met 5 ml PBS + 1% FBS.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g , gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 5 ml PBS + 1% FBS.
- Tel de cellen en breng 1 ml van 1 x 106 cellen over in een verse microfugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 5 μL 7-Amino-Actinomycine D (7-AAD) toe, keer de buis goed om om te mengen en breng het monster vervolgens aan op de celsorteerder om levende afzonderlijke cellen te sorteren in individuele putten van een 96-well plaat.
OPMERKING: 7-AAD-kleurstof is uitgesloten van levende cellen en kan daarom worden gebruikt bij het sorteren van levende cellen.
3. Cel sorteren en lysis
- Bereid een celsorteerder-compatibele 96-well plaat met 100 μL nucleaire extractie (NE) buffer in elke put voordat de cel wordt gesorteerd.
- Sorteer de cellen in 96-putplaten volgens de instructies van de fabrikant.
- Draai de plaat snel (600 x g gedurende 30 s) om ervoor te zorgen dat cellen zich in de buffer in de putten bevinden.
OPMERKING: Het is de moeite waard om in een voorlopig experiment te testen of de cellen die worden gebruikt betrouwbaar naar de bodem van de putten worden gebracht.
- Houd de monsters 15 minuten op ijs.
- Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g en pipetteer voorzichtig om het supernatant te verwijderen (5 μL achterlatend).
- Resuspend elk monster in 55 μL NE-buffer en voeg 30 μL van de voorgewassen ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen (vanaf stap 1.7; in Binding Buffer) toe aan elke reactie.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
4. Pre-block monsters om vroege vertering door MNase te voorkomen
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat de kralen minimaal 5 minuten binden en verwijder en gooi het supernatant weg.
- Voeg 100 μL Blocking Buffer toe aan de kerngebonden kralen en meng met zacht pipetteren.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Toevoeging van primair antilichaam
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 100 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.
- Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de kralen in 25 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.
- Maak een primaire antilichaammastermix: 25 μL washbuffer + 0,5 μl antilichaam per reactie.
- Terwijl u de kerngebonden kralen voorzichtig vortext, voegt u 25 μL van de primaire antilichaammastermix toe aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang (meestal 1:100 uiteindelijke verdunning). Voeg 25 μL wasbuffer zonder antilichaam toe als u een controle uitvoert.
- Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat uit het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspenderend door pipetteren.
6. Toevoeging van pA-MNase of pA/G-MNase
OPMERKING: Eiwit A heeft een hoge affiniteit voor IgG-moleculen van bepaalde soorten zoals konijnen, maar is niet geschikt voor Igg's van andere soorten zoals muizen of ratten. Als alternatief kan Protein A /G-MNase worden gebruikt. Deze hybride bindt IgG's van konijnen, muizen en ratten, waardoor de noodzaak van secundaire antilichamen wordt vermeden wanneer primaire antilichamen van muizen of ratten worden gebruikt.
- Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat uit het magnetische rek en breng elk monster opnieuw uit in 25 μL wasbuffer.
- Maak een pA-MNase master mix (25 μL Wash Buffer + geoptimaliseerde hoeveelheid pA-MNase per reactie).
- Voeg tijdens het vortexen voorzichtig 25 μL van de pA-MNase-mastermix toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters.
OPMERKING: De concentratie van pA-MNase varieert afhankelijk van de bereiding, indien zelfgemaakt, en moet vóór gebruik bij elke onafhankelijke zuivering worden getest. Voor pA/G-MNase moet 2,5 μL van de 20x bouillon worden gebruikt.
- Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat van het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspendatie door zacht pipetteren.
7. Gerichte DNA-vertering
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 bronnen, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg.
- Verwijder de monsters uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 50 μL wasbuffer door zachtjes te pipetteren.
- Breng de monsters gedurende 5 minuten in evenwicht tot 0 °C in een mengsel van ijs en water.
- Verwijder de monsters uit het ijs-/waterbad van 0 °C en voeg 1 μL van 100 mM CaCl2 toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng goed (3-5 keer) met zacht pipetteren met een meerkanaalspipet met een groter volume en breng de monsters terug tot 0 °C.
OPMERKING: Goed mengen is hier essentieel. CaCl2 wordt toegevoegd om de MNase-vertering van DNA te activeren dat het eiwit van belang flankeert.
- Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijs/waterbad ligt.
- Stop de reactie door 50 μL 2XRSTOP+ Buffer in elke put te pipetteren, in dezelfde volgorde als de CaCl2 werd toegevoegd.
OPMERKING: Maak 2XRSTOP + Buffer voordat de 10 minuten vertering voorbij is om oververtering te voorkomen.
8. Fractionering van monsters
- Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Draai de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C op 16.000 x g .
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten leegmaken en breng de bovennatuurlijke stoffen over naar een verse plaat met 96 putten. Gooi de kralen weg.
9. DNA-extractie
- Voeg 1 μL 10% natriumdodecylodylsulfaat (SDS) en 0,83 μL 20 mg/ml proteïnase K toe aan elk monster.
LET OP: SDS poeder is schadelijk bij inademing. Gebruikers moeten in goed geventileerde ruimtes een bril, handschoenen en een N95-grade gasmasker dragen, waarbij ze voorzichtig moeten omgaan.
- Meng de monsters door zachtjes te pipetteren.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 °C.
- Breng de plaat terug op kamertemperatuur en voeg 46,6 μL van 5 M NaCl en 90 μL van 50% PEG 4000 toe. Meng door zachtjes te pipetteren.
- Voeg 33 μL polystyreen-magnetietkorrels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u polystyreen-magnetiet kralen op kamertemperatuur brengt (~ 30 min) en meng goed voor gebruik.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant gedurende ~ 5 minuten wissen en gooi het supernatant vervolgens voorzichtig weg zonder de kralen te verstoren.
- Spoel 2x met 150 μL 80% ethanol zonder de kralen te storen.
LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en veroorzaakt huid-, oog- en longirritatie. Voer deze stap uit met geschikte laboratoriumkleding en in een geventileerde capuchon.
- Draai de plaat kort op 1000 x g gedurende 30 s. Plaats de plaat terug op een 96-well magnetisch rek en verwijder alle resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.
- Droog de monsters aan de lucht gedurende ~ 2-5 minuten.
LET OP: Droog de kralen niet langer dan 5 min. Als u ijverig bent over het verwijderen van de EtOH, is 2-3 minuten drogen voldoende.
- Resuspend de kralen met 37,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de kralen 5 minuten binden.
- Breng 36,5 μL van het supernatant over op een verse thermocycler compatibele 96-well plaat. Gooi de kralen weg.
OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door monsters op te slaan bij -20 °C of kan doorgaan met het bouwen van de bibliotheek (stappen 10-15).
10. Eindreparatie, fosforylering, adenylering
OPMERKING: De reagentia zijn afkomstig zoals vermeld in de tabel met materialen. Het onderstaande protocol volgt een vergelijkbare methode als de commerciële kit zoals DE NEBNext Ultra DNA II-kit.
- Verdun 5 U/μL T4 DNA polymerase 1:20 in 1x T4 DNA ligase buffer.
- Bereid een eindreparatie/3'A mastermix voor: 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer, 2,5 μL van 10 mM dNTPs, 1,25 μL van 10 mM ATP, 3,13 μL van 40% PEG 4000, 0,63 μL van 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL verdund T4 DNA polymerase, 0,5 μL van 5U/μL Taq DNA polymerase, met een totaal volume van 13,5 μL per reactie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u 40% PEG 4000 op kamertemperatuur brengt voordat u pipettert.
- Voeg 13,5 μL eindreparatie/3'A mastermix toe aan 36,5 μL DNA.
- Meng de reactie door een snelle vortex en vervolgens een snelle spin (500 x g gedurende 10 s).
- Incubeer met behulp van de volgende reactieomstandigheden in een voorgekoelde thermocycler met een verwarmd deksel voor temperaturen >20 °C. Gebruik de reactieomstandigheden: 12 °C gedurende 15 minuten, 37 °C gedurende 15 minuten, 72 °C gedurende 20 minuten, houd bij 4 °C.
11. Adapter ligatie
OPMERKING: Houd de monsters op ijs tijdens het instellen van de volgende reactie. Laat de ligasebuffer op kamertemperatuur komen voordat u gaat pipetteren. Verdun de adapter (zie materiaaltabel) in een oplossing van 10 mM Tris-HCl met 10 mM NaCl (pH 7,5). Vanwege de lage opbrengst, niet vooraf kwantificeren van het CUT & RUN-verrijkte DNA. Genereer in plaats daarvan 25-voudige verdunningen van de adapter, met behulp van een eindwerkadapterconcentratie van 0,6 μM.
- Maak een ligatiemastermix: 55 μL ligasebuffer (2x), 5 μL T4 DNA-ligase en 5 μL verdunde adapter, met een totaal volume van 65 μL per reactie.
- Voeg 65 μL van het hoofdligatiemengsel toe aan 50 μL DNA uit stap 10.5.
- Meng door snel vortexen, gevolgd door snel draaien (500 x g gedurende 10 s).
- Incubeer bij 20 °C in een thermocycler (zonder verwarmd deksel) gedurende 15 min.
OPMERKING: Ga onmiddellijk verder met de volgende stap.
12. Gebruikersvertering
- Voeg 3 μL USER-enzym toe aan elk monster, vortex en spin (500 x g gedurende 10 s).
- Incubeer in thermische cycler bij 37 °C gedurende 15 minuten (verwarmd deksel ingesteld op 50 °C).
13. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen na ligatiereactie
OPMERKING: Laat polystyreen-magnetietparels in evenwicht brengen bij kamertemperatuur (~ 30 min). Vortex om de kraaloplossing te homogeniseren voor gebruik. Voer de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.
- Voeg 39 μL (0,33x) polystyreen-magnetietkraaloplossing toe aan elke put die adaptor-geligeerd DNA bevat.
- Meng grondig door te pipetteren en incubeer de monsters vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om DNA aan de kralen te laten binden.
- Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten en incubeer gedurende 5 minuten totdat het supernatant helder is.
- Houd de plaat op het magnetische rek en verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
- Spoel de kralen af met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.
- Incubeer gedurende 30 s op een magnetisch rek met 96 putten om de oplossing te laten wissen.
- Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Herhaal stap 13,5-13,7 voor in totaal twee wasbeurten.
- Draai de plaat kort op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder de resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.
- Houd de plaat op het magneetrek en droog de monsters gedurende 2 minuten aan de lucht.
LET OP: Droog de kralen niet te veel.
- Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw uit in 28,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).
LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief. Gebruikers moeten er voorzichtig mee omgaan in een chemische zuurkast met een bril, handschoenen en een laboratoriumjas.
- Reuspend kralen grondig door pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbels ontstaan.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.
- Breng 27,5 μL supernatant over op een nieuwe PCR-plaat en gooi de kralen weg.
14. Bibliotheekverrijking
OPMERKING: Primers worden verdund met dezelfde oplossing als de adapter. Gebruik voor deze bibliotheekopbouw een eindwerkprimerconcentratie van 0,6 μM.
- Voeg 5 μL verdunde geïndexeerde primer (zie Materiaaltabel) toe aan elk monster.
OPMERKING: Elk monster heeft een andere index nodig die na sequencing moet worden geïdentificeerd.
- Bereid een PCR-mastermix voor: 10 μL 5x high fidelity PCR-buffer, 1,5 μL van 10 mM dNTPs, 5 μL verdunde Universal primer, 1 μL van 1 U hot start high fidelity polymerase, met een totaal mastermixvolume van 17,5 μL per monster.
- Voeg 17,5 μL pf PCR-mix toe aan 32,5 μL gezuiverd adaptor-geligeerd DNA (5 μL geïndexeerde primer is inbegrepen in dit volume).
- Meng de oplossing door te pipetteren.
- Incubeer in een thermocycler met behulp van de volgende reactieomstandigheden met een maximale hellingsnelheid van 3 °C/s: 98 °C gedurende 45 s, 98 °C gedurende 45 s, 60 °C gedurende 10 s, herhaal de tweede en derde stap 21 keer, 72 °C gedurende 1 minuut, houd bij 4 °C.
OPMERKING: De monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C voor opslag op korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.
15. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen
- Voeg 60 μL (1,2x) polystyreen-magnetietparels toe aan elk monster.
- Resuspend de kralen door te pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is.
- Gooi het supernatant weg en spoel de kralen met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.
- Herhaal de wasstap voor in totaal twee 80% EtOH-wasbeurten.
- Draai de plaat op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de kralen 5 minuten binden.
- Pipetteer om overtollige EtOH te verwijderen zonder de kralen te storen en laat de kralen 2 minuten aan de lucht drogen.
LET OP: Droog de kralen niet te veel.
- Resuspend de kralen in 21 μL nucleasevrij water en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.
- Breng 20 μL van het supernatant over op een nieuwe plaat.
OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door het monster bij -20 °C te bewaren.
- Kwantificeer bibliotheekconcentraties met een fluorometer (zie Tabel met materialen), met behulp van een 1x HS-reagens.
- Als de concentratie het toelaat, voer dan 30 ng monster uit op 1,5% agarosegel met een ladder met een laag molecuulgewicht om te visualiseren. U kunt ook visualiseren op een Fragment Analyzer of een gerelateerd instrument.
- Sequentiebibliotheken op een Illumina-platform om ~ 50.000-100.000 uniek in kaart gebrachte reads te verkrijgen.