Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

Summary

CUT&RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT & RUN.

Abstract

Het bepalen van de bindingslocaties van een eiwit op chromatine is essentieel voor het begrijpen van de functie en potentiële regulerende doelen. Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) is al meer dan 30 jaar de gouden standaard voor het bepalen van eiwitlokalisatie en wordt gedefinieerd door het gebruik van een antilichaam om het eiwit van belang uit gesoniseerd of enzymatisch verteerd chromatine te halen. Meer recent zijn antilichaam-tetheringtechnieken populair geworden voor het beoordelen van eiwitlokalisatie op chromatine vanwege hun verhoogde gevoeligheid. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) is het genoombrede derivaat van Chromatin Immunocleavage (ChIC) en maakt gebruik van recombinant Protein A vastgebonden aan micrococcebasnuclease (pA-MNase) om het IgG-constante gebied van het antilichaam te identificeren dat zich richt op een eiwit van belang, waardoor site-specifieke splitsing van het DNA mogelijk wordt dat het eiwit van belang flankeert. CUT & RUN kan worden gebruikt om histonmodificaties, transcriptiefactoren en andere chromatine-bindende eiwitten zoals nucleosoomremodelleringsfactoren te profileren. Belangrijk is dat CUT&RUN kan worden gebruikt om de lokalisatie van euchromatische of heterochromatische geassocieerde eiwitten en histonmodificaties te beoordelen. Om deze redenen is CUT&RUN een krachtige methode voor het bepalen van de bindingsprofielen van een breed scala aan eiwitten. Onlangs is CUT&RUN geoptimaliseerd voor transcriptiefactorprofilering in lage populaties van cellen en enkele cellen en het geoptimaliseerde protocol wordt ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN) genoemd. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige factorprofilering met behulp van uliCUT & RUN in een handmatig 96-well-formaat.

Introduction

Veel nucleaire eiwitten functioneren door interactie met chromatine om DNA-gemodelleerde activiteiten te bevorderen of te voorkomen. Om de functie van deze chromatine-interagerende eiwitten te bepalen, is het belangrijk om de genomische locaties te identificeren waarop deze eiwitten gebonden zijn. Sinds de ontwikkeling in 1985 is Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) de gouden standaard om te bepalen waar een eiwit bindt aan chromatine ^1,2. De traditionele ChIP-techniek heeft de volgende basisworkflow: cellen worden geoogst en gecrosslinkt (meestal met formaldehyde), chromatine wordt geschoren (meestal met agressieve ultrasoonapparaatmethoden, waardoor crosslinking nodig is), het eiwit van belang wordt immunoprecipiteerd met behulp van een antilichaam dat zich richt op het eiwit (of gelabeld eiwit) gevolgd door een secundair antilichaam (gekoppeld aan agarose of magnetische kralen), crosslinking wordt omgekeerd, eiwit en RNA worden verteerd om DNA te zuiveren, en dit ChIP verrijkt-DNA wordt gebruikt als de sjabloon voor analyse (met behulp van radioactief gelabelde sondes ^1,2, qPCR³, microarrays ^5,6 of sequencing⁴). Met de komst van microarrays en massaal parallelle diepe sequencing, zijn ChIP-chip ^5,6 en ChIP-seq⁴ recenter ontwikkeld en maken genoombrede identificatie van eiwitlokalisatie op chromatine mogelijk. Crosslinking ChIP is sinds zijn komst een krachtige en betrouwbare techniek met grote vooruitgang in resolutie door ChIP-exo⁷ en ChIP-nexus⁸. Parallel aan de ontwikkeling van ChIP-seq zijn native (niet-crosslinking) protocollen voor ChIP (N-ChIP) vastgesteld, die nucleasevertering gebruiken (vaak met behulp van microkokkennuclease of MNase) om het chromatine te fragmenteren, in tegenstelling tot ultrasoonapparaat uitgevoerd in traditionele crosslinking ChIP-technieken⁹. Een groot nadeel van zowel crosslinking ChIP- als N-ChIP-technologieën is echter de vereiste voor hoge celaantallen vanwege de lage DNA-opbrengst na de experimentele manipulatie. Daarom zijn er in meer recente jaren veel inspanningen geleverd om ChIP-technologieën te optimaliseren voor lage celinvoer. Deze inspanningen hebben geresulteerd in de ontwikkeling van vele krachtige ChIP-gebaseerde technologieën die variëren in hun toepasbaarheid en invoervereisten 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Eencellige ChIP-seq-gebaseerde technologieën ontbreken echter, vooral voor niet-histoneiwitten.

In 2004 werd een alternatieve technologie ontwikkeld om de eiwitbezetting te bepalen op chromatine genaamd Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) en Chromatin Immunocleavage (ChIC)¹⁹. Deze single-locus technieken maken gebruik van een fusie van MNase met het eiwit van belang (ChEC) of met eiwit A (ChIC) voor directe knip van DNA naast het eiwit van belang. In meer recente jaren zijn zowel ChEC als ChIC geoptimaliseerd voor genoombrede eiwitprofilering op chromatine (respectievelijk ChEC-seq en CUT&RUN)^20,21. Hoewel ChEC-seq een krachtige techniek is voor het bepalen van factorlokalisatie, vereist het de ontwikkeling van MNase-fusie-eiwitten voor elk doelwit, terwijl ChIC en zijn genoombrede variatie, CUT & RUN, vertrouwen op een antilichaam gericht op het eiwit van belang (zoals bij ChIP) en recombinant eiwit A-MNase, waar het eiwit A het IgG-constante gebied van het antilichaam kan herkennen. Als alternatief is een fusie-eiwit A / Eiwit G-MNase (pA / G-MNase) ontwikkeld dat een breder scala aan antilichaamconstante regio's kan herkennen²². CUT&RUN is snel een populair alternatief geworden voor ChIP-seq voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine genoombreed.

Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), een variant van CUT&RUN die het gebruik van lage en single-cell ingangen mogelijk maakt, werd beschreven in 2019²³. Hier wordt de methodologie voor een handmatige 96-well formaat single-cell applicatie beschreven. Het is belangrijk op te merken dat sinds de ontwikkeling van uliCUT&RUN twee alternatieven voor histonprofilering, CUT&Tag en iACT-seq, zijn ontwikkeld, die robuuste en zeer parallelle profilering van histoneiwitten^24,25 bieden. Bovendien is scCUT&Tag geoptimaliseerd voor het profileren van meerdere factoren in een enkele cel (multiCUT&Tag) en voor toepassing op niet-histoneiwitten²⁶. Samen biedt CUT&RUN een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq met lage input, waar uliCUT&RUN kan worden uitgevoerd in elk laboratorium voor moleculaire biologie dat toegang heeft tot een celsorteerder en standaardapparatuur.

Protocol

Ethische verklaring: Alle studies werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Office of Research Protections aan de Universiteit van Pittsburgh.

1. Bereid magnetische kralen voor

OPMERKING: Voer uit voordat u de cel sorteert en houd ijs vast tot gebruik.

1. Pipetteer 30 μL conA-geconjugeerde paramagnetische microsferen pareldrijfmestmengsel per reactie op een verse microfugebuis van 1,5 ml en voeg 850 μL bindingsbuffer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen.
   OPMERKING: ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen zijn lectine-gecoate magnetische kralen die lipidemembraanbinding mogelijk maken.
2. Plaats de buis op een magnetisch rek en laat de kralen 1-2 minuten magnetiseren. Zodra het supernatant is opgeruimd, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg zonder de kralen te storen.
3. Verwijder de buis uit het magneetrek en was de kralen door ze opnieuw te gebruiken in 1 ml bindingsbuffer.
4. Herhaal stap 1.2 en 1.3.
5. Magnetiseer de kralen gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant om weg te gooien.
6. Verwijder de buis uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 30 μL bindingsbuffer per reactie.
7. Houd het gewassen kralenmengsel op ijs totdat de cellen zijn gesorteerd.

2. Oogst cellen

OPMERKING: Deze stap is geschreven voor gehechte cellen en geoptimaliseerd voor murine E14 embryonale stamcellen. Het kweken en oogsten van de cellen is afhankelijk van het celtype.

1. Verwijder de cellen uit de incubator van 37 °C en onderzoek ze onder een microscoop om de kwaliteit te garanderen.
2. Zuig de media uit de celplaat en spoel af met 5 ml 1x PBS.
3. Zuig PBS uit de plaat en oogst de cellen (met behulp van traditionele celoogstmethoden die per celtype zullen verschillen). Verkrijg eencellige suspensie door zo nodig voorzichtig op en neer te pipetteren met een serologische pipet tegen de kweekschaal.
4. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en draai gedurende 5 minuten met 200 x g naar beneden.
5. Zuig de media af om de celkorrel weg te gooien en te wassen met 5 ml PBS + 1% FBS.
6. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g , gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 5 ml PBS + 1% FBS.
7. Tel de cellen en breng 1 ml van 1 x 10⁶ cellen over in een verse microfugebuis van 1,5 ml.
8. Voeg 5 μL 7-Amino-Actinomycine D (7-AAD) toe, keer de buis goed om om te mengen en breng het monster vervolgens aan op de celsorteerder om levende afzonderlijke cellen te sorteren in individuele putten van een 96-well plaat.
   OPMERKING: 7-AAD-kleurstof is uitgesloten van levende cellen en kan daarom worden gebruikt bij het sorteren van levende cellen.

3. Cel sorteren en lysis

1. Bereid een celsorteerder-compatibele 96-well plaat met 100 μL nucleaire extractie (NE) buffer in elke put voordat de cel wordt gesorteerd.
2. Sorteer de cellen in 96-putplaten volgens de instructies van de fabrikant.
3. Draai de plaat snel (600 x g gedurende 30 s) om ervoor te zorgen dat cellen zich in de buffer in de putten bevinden.
   OPMERKING: Het is de moeite waard om in een voorlopig experiment te testen of de cellen die worden gebruikt betrouwbaar naar de bodem van de putten worden gebracht.
4. Houd de monsters 15 minuten op ijs.
5. Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g en pipetteer voorzichtig om het supernatant te verwijderen (5 μL achterlatend).
6. Resuspend elk monster in 55 μL NE-buffer en voeg 30 μL van de voorgewassen ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen (vanaf stap 1.7; in Binding Buffer) toe aan elke reactie.
7. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.

4. Pre-block monsters om vroege vertering door MNase te voorkomen

1. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat de kralen minimaal 5 minuten binden en verwijder en gooi het supernatant weg.
2. Voeg 100 μL Blocking Buffer toe aan de kerngebonden kralen en meng met zacht pipetteren.
3. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

5. Toevoeging van primair antilichaam

1. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
2. Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 100 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.
3. Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg.
4. Resuspend de kralen in 25 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.
5. Maak een primaire antilichaammastermix: 25 μL washbuffer + 0,5 μl antilichaam per reactie.
6. Terwijl u de kerngebonden kralen voorzichtig vortext, voegt u 25 μL van de primaire antilichaammastermix toe aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang (meestal 1:100 uiteindelijke verdunning). Voeg 25 μL wasbuffer zonder antilichaam toe als u een controle uitvoert.
7. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
8. Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.
9. Verwijder de plaat uit het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspenderend door pipetteren.

6. Toevoeging van pA-MNase of pA/G-MNase

OPMERKING: Eiwit A heeft een hoge affiniteit voor IgG-moleculen van bepaalde soorten zoals konijnen, maar is niet geschikt voor Igg's van andere soorten zoals muizen of ratten. Als alternatief kan Protein A /G-MNase worden gebruikt. Deze hybride bindt IgG's van konijnen, muizen en ratten, waardoor de noodzaak van secundaire antilichamen wordt vermeden wanneer primaire antilichamen van muizen of ratten worden gebruikt.

1. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.
2. Verwijder de plaat uit het magnetische rek en breng elk monster opnieuw uit in 25 μL wasbuffer.
3. Maak een pA-MNase master mix (25 μL Wash Buffer + geoptimaliseerde hoeveelheid pA-MNase per reactie).
4. Voeg tijdens het vortexen voorzichtig 25 μL van de pA-MNase-mastermix toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters.
   OPMERKING: De concentratie van pA-MNase varieert afhankelijk van de bereiding, indien zelfgemaakt, en moet vóór gebruik bij elke onafhankelijke zuivering worden getest. Voor pA/G-MNase moet 2,5 μL van de 20x bouillon worden gebruikt.
5. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
6. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
7. Verwijder de plaat van het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspendatie door zacht pipetteren.

7. Gerichte DNA-vertering

1. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 bronnen, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg.
2. Verwijder de monsters uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 50 μL wasbuffer door zachtjes te pipetteren.
3. Breng de monsters gedurende 5 minuten in evenwicht tot 0 °C in een mengsel van ijs en water.
4. Verwijder de monsters uit het ijs-/waterbad van 0 °C en voeg 1 μL van 100 mM CaCl₂ toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng goed (3-5 keer) met zacht pipetteren met een meerkanaalspipet met een groter volume en breng de monsters terug tot 0 °C.
   OPMERKING: Goed mengen is hier essentieel. CaCl₂ wordt toegevoegd om de MNase-vertering van DNA te activeren dat het eiwit van belang flankeert.
5. Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijs/waterbad ligt.
6. Stop de reactie door 50 μL 2XRSTOP+ Buffer in elke put te pipetteren, in dezelfde volgorde als de CaCl₂ werd toegevoegd.
   OPMERKING: Maak 2XRSTOP + Buffer voordat de 10 minuten vertering voorbij is om oververtering te voorkomen.

8. Fractionering van monsters

1. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C.
2. Draai de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C op 16.000 x g .
3. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten leegmaken en breng de bovennatuurlijke stoffen over naar een verse plaat met 96 putten. Gooi de kralen weg.

9. DNA-extractie

1. Voeg 1 μL 10% natriumdodecylodylsulfaat (SDS) en 0,83 μL 20 mg/ml proteïnase K toe aan elk monster.
   LET OP: SDS poeder is schadelijk bij inademing. Gebruikers moeten in goed geventileerde ruimtes een bril, handschoenen en een N95-grade gasmasker dragen, waarbij ze voorzichtig moeten omgaan.
2. Meng de monsters door zachtjes te pipetteren.
3. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 °C.
4. Breng de plaat terug op kamertemperatuur en voeg 46,6 μL van 5 M NaCl en 90 μL van 50% PEG 4000 toe. Meng door zachtjes te pipetteren.
5. Voeg 33 μL polystyreen-magnetietkorrels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u polystyreen-magnetiet kralen op kamertemperatuur brengt (~ 30 min) en meng goed voor gebruik.
6. Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant gedurende ~ 5 minuten wissen en gooi het supernatant vervolgens voorzichtig weg zonder de kralen te verstoren.
7. Spoel 2x met 150 μL 80% ethanol zonder de kralen te storen.
   LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en veroorzaakt huid-, oog- en longirritatie. Voer deze stap uit met geschikte laboratoriumkleding en in een geventileerde capuchon.
8. Draai de plaat kort op 1000 x g gedurende 30 s. Plaats de plaat terug op een 96-well magnetisch rek en verwijder alle resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.
9. Droog de monsters aan de lucht gedurende ~ 2-5 minuten.
   LET OP: Droog de kralen niet langer dan 5 min. Als u ijverig bent over het verwijderen van de EtOH, is 2-3 minuten drogen voldoende.
10. Resuspend de kralen met 37,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
11. Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de kralen 5 minuten binden.
12. Breng 36,5 μL van het supernatant over op een verse thermocycler compatibele 96-well plaat. Gooi de kralen weg.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door monsters op te slaan bij -20 °C of kan doorgaan met het bouwen van de bibliotheek (stappen 10-15).

10. Eindreparatie, fosforylering, adenylering

OPMERKING: De reagentia zijn afkomstig zoals vermeld in de tabel met materialen. Het onderstaande protocol volgt een vergelijkbare methode als de commerciële kit zoals DE NEBNext Ultra DNA II-kit.

1. Verdun 5 U/μL T4 DNA polymerase 1:20 in 1x T4 DNA ligase buffer.
2. Bereid een eindreparatie/3'A mastermix voor: 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer, 2,5 μL van 10 mM dNTPs, 1,25 μL van 10 mM ATP, 3,13 μL van 40% PEG 4000, 0,63 μL van 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL verdund T4 DNA polymerase, 0,5 μL van 5U/μL Taq DNA polymerase, met een totaal volume van 13,5 μL per reactie.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u 40% PEG 4000 op kamertemperatuur brengt voordat u pipettert.
3. Voeg 13,5 μL eindreparatie/3'A mastermix toe aan 36,5 μL DNA.
4. Meng de reactie door een snelle vortex en vervolgens een snelle spin (500 x g gedurende 10 s).
5. Incubeer met behulp van de volgende reactieomstandigheden in een voorgekoelde thermocycler met een verwarmd deksel voor temperaturen >20 °C. Gebruik de reactieomstandigheden: 12 °C gedurende 15 minuten, 37 °C gedurende 15 minuten, 72 °C gedurende 20 minuten, houd bij 4 °C.

11. Adapter ligatie

OPMERKING: Houd de monsters op ijs tijdens het instellen van de volgende reactie. Laat de ligasebuffer op kamertemperatuur komen voordat u gaat pipetteren. Verdun de adapter (zie materiaaltabel) in een oplossing van 10 mM Tris-HCl met 10 mM NaCl (pH 7,5). Vanwege de lage opbrengst, niet vooraf kwantificeren van het CUT & RUN-verrijkte DNA. Genereer in plaats daarvan 25-voudige verdunningen van de adapter, met behulp van een eindwerkadapterconcentratie van 0,6 μM.

1. Maak een ligatiemastermix: 55 μL ligasebuffer (2x), 5 μL T4 DNA-ligase en 5 μL verdunde adapter, met een totaal volume van 65 μL per reactie.
2. Voeg 65 μL van het hoofdligatiemengsel toe aan 50 μL DNA uit stap 10.5.
3. Meng door snel vortexen, gevolgd door snel draaien (500 x g gedurende 10 s).
4. Incubeer bij 20 °C in een thermocycler (zonder verwarmd deksel) gedurende 15 min.
   OPMERKING: Ga onmiddellijk verder met de volgende stap.

12. Gebruikersvertering

1. Voeg 3 μL USER-enzym toe aan elk monster, vortex en spin (500 x g gedurende 10 s).
2. Incubeer in thermische cycler bij 37 °C gedurende 15 minuten (verwarmd deksel ingesteld op 50 °C).

13. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen na ligatiereactie

OPMERKING: Laat polystyreen-magnetietparels in evenwicht brengen bij kamertemperatuur (~ 30 min). Vortex om de kraaloplossing te homogeniseren voor gebruik. Voer de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.

1. Voeg 39 μL (0,33x) polystyreen-magnetietkraaloplossing toe aan elke put die adaptor-geligeerd DNA bevat.
2. Meng grondig door te pipetteren en incubeer de monsters vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om DNA aan de kralen te laten binden.
3. Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten en incubeer gedurende 5 minuten totdat het supernatant helder is.
4. Houd de plaat op het magnetische rek en verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
5. Spoel de kralen af met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.
6. Incubeer gedurende 30 s op een magnetisch rek met 96 putten om de oplossing te laten wissen.
7. Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
8. Herhaal stap 13,5-13,7 voor in totaal twee wasbeurten.
9. Draai de plaat kort op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder de resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.
10. Houd de plaat op het magneetrek en droog de monsters gedurende 2 minuten aan de lucht.
    LET OP: Droog de kralen niet te veel.
11. Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw uit in 28,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief. Gebruikers moeten er voorzichtig mee omgaan in een chemische zuurkast met een bril, handschoenen en een laboratoriumjas.
12. Reuspend kralen grondig door pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbels ontstaan.
13. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
14. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.
15. Breng 27,5 μL supernatant over op een nieuwe PCR-plaat en gooi de kralen weg.

14. Bibliotheekverrijking

OPMERKING: Primers worden verdund met dezelfde oplossing als de adapter. Gebruik voor deze bibliotheekopbouw een eindwerkprimerconcentratie van 0,6 μM.

1. Voeg 5 μL verdunde geïndexeerde primer (zie Materiaaltabel) toe aan elk monster.
   OPMERKING: Elk monster heeft een andere index nodig die na sequencing moet worden geïdentificeerd.
2. Bereid een PCR-mastermix voor: 10 μL 5x high fidelity PCR-buffer, 1,5 μL van 10 mM dNTPs, 5 μL verdunde Universal primer, 1 μL van 1 U hot start high fidelity polymerase, met een totaal mastermixvolume van 17,5 μL per monster.
3. Voeg 17,5 μL pf PCR-mix toe aan 32,5 μL gezuiverd adaptor-geligeerd DNA (5 μL geïndexeerde primer is inbegrepen in dit volume).
4. Meng de oplossing door te pipetteren.
5. Incubeer in een thermocycler met behulp van de volgende reactieomstandigheden met een maximale hellingsnelheid van 3 °C/s: 98 °C gedurende 45 s, 98 °C gedurende 45 s, 60 °C gedurende 10 s, herhaal de tweede en derde stap 21 keer, 72 °C gedurende 1 minuut, houd bij 4 °C.
   OPMERKING: De monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C voor opslag op korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.

15. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen

1. Voeg 60 μL (1,2x) polystyreen-magnetietparels toe aan elk monster.
2. Resuspend de kralen door te pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Plaats de plaat gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is.
4. Gooi het supernatant weg en spoel de kralen met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.
5. Herhaal de wasstap voor in totaal twee 80% EtOH-wasbeurten.
6. Draai de plaat op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de kralen 5 minuten binden.
7. Pipetteer om overtollige EtOH te verwijderen zonder de kralen te storen en laat de kralen 2 minuten aan de lucht drogen.
   LET OP: Droog de kralen niet te veel.
8. Resuspend de kralen in 21 μL nucleasevrij water en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
9. Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.
10. Breng 20 μL van het supernatant over op een nieuwe plaat.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door het monster bij -20 °C te bewaren.
11. Kwantificeer bibliotheekconcentraties met een fluorometer (zie Tabel met materialen), met behulp van een 1x HS-reagens.
12. Als de concentratie het toelaat, voer dan 30 ng monster uit op 1,5% agarosegel met een ladder met een laag molecuulgewicht om te visualiseren. U kunt ook visualiseren op een Fragment Analyzer of een gerelateerd instrument.
13. Sequentiebibliotheken op een Illumina-platform om ~ 50.000-100.000 uniek in kaart gebrachte reads te verkrijgen.

Results

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige eiwitprofilering op chromatine met behulp van een 96-well handmatig formaat uliCUT & RUN. Hoewel de resultaten zullen variëren op basis van het eiwit dat wordt geprofileerd (vanwege de overvloed aan eiwitten en de kwaliteit van antilichamen), celtype en andere bijdragende factoren, worden de verwachte resultaten voor deze techniek hier besproken. Celkwaliteit (celuitstraling en percentage levensvatbare cellen) en eencellige sortering moeten worden beoord...

Discussion

CUT&RUN is een effectief protocol om eiwitlokalisatie op chromatine te bepalen. Het heeft veel voordelen ten opzichte van andere protocollen, waaronder: 1) hoge signaal-ruisverhouding, 2) snel protocol en 3) lage sequencing leesdekking vereist, wat leidt tot kostenbesparingen. Het gebruik van Protein A- of Protein A/G-MNase maakt het mogelijk om CUT&RUN toe te passen met elk beschikbaar antilichaam; daarom heeft het de potentie om snel en gemakkelijk veel eiwitten te profileren. Aanpassing aan eencellige voor elke eiwitp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL clear microfuge tubes	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL tube magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge	Eppendorf	5404000537
10 cm sterile tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
15 mL conical tubes	VWR	89039-656
1X TE buffer	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR tubes	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96-well plate	VWR	82006-636
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest	varies
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
Cell sorter	BD FACSAria II cell sorter		Requires training
Cell-specific media for cell culture	Varies
Chloroform	ThermoFisher Scientific	C298-500	Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster			For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP set	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Electrophoresis equipment	varies
Ethanol	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycogen	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in	homemade		Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket	varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)	Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood	Bakery Company	SG404
Manganese Chloride (MnCl2)	Sigma Aldrich	244589
Micropipette set	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB Adaptor	New England Biolabs	E6612AVIAL	Adaptor
NEB Universal primer	New England Biolabs	E6611AVIAL	Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit	New England Biolabs	E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L	Indexed Primers
Negative control antibody	Antibodies-Online	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10814010
Pipette aid	Drummond Scientific	# 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000	VWR	A16151
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-1	CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
Sodium Acetate  (NaOAc)	ThermoFisher Scientific