Method Article

Echocardiografische karakterisering van linkerventrikelstructuur, functie en coronaire stroom bij pasgeboren muizen

DOI:

10.3791/63539

⸱

April 7th, 2022

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, Center for Cardiovascular Research, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft de echocardiografische beoordeling van de morfologie, functie en coronaire bloedstroom van de linkerventrikel bij 7-dagen oude pasgeboren muizen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Echocardiografie is een niet-invasieve procedure die de evaluatie van structurele en functionele parameters in diermodellen van hart- en vaatziekten mogelijk maakt en wordt gebruikt om de impact van mogelijke behandelingen in preklinische studies te beoordelen. Echocardiografische studies worden meestal uitgevoerd bij jongvolwassen muizen (d.w.z. 4-6 weken oud). De evaluatie van de vroege neonatale cardiovasculaire functie wordt meestal niet uitgevoerd vanwege de kleine omvang van de muispups en de bijbehorende technische problemen. Een van de belangrijkste uitdagingen is dat de korte lengte van de ledematen van de pups voorkomt dat ze de elektroden in het echocardiografieplatform bereiken. Lichaamstemperatuur is de andere uitdaging, omdat pups erg gevoelig zijn voor temperatuurveranderingen. Daarom is het belangrijk om een praktische gids op te stellen voor het uitvoeren van echocardiografische studies bij kleine muispups om onderzoekers te helpen vroege pathologische veranderingen te detecteren en de progressie van hart- en vaatziekten in de loop van de tijd te bestuderen. Het huidige werk beschrijft een protocol voor het uitvoeren van echocardiografie bij muizenpups op de vroege leeftijd van 7 dagen oud. De echocardiografische karakterisering van cardiale morfologie, functie en coronaire stroom bij neonatale muizen wordt ook beschreven.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene doel van dit protocol is om cardiale morfologie, functie en kransslagaderstroom bij 7 dagen oude neonatale muispups te onderzoeken met behulp van echocardiografie. De redenering achter de ontwikkeling van deze techniek is het bepalen van vroege veranderingen in coronaire stroming en hartfunctie in muismodellen vanhartaandoeningen 1. De niet-invasieve aard van echocardiografie is voordelig omdat het onderzoekers in staat stelt om de cardiovasculaire functie onder fysiologische omstandigheden te beoordelen en onderzoekers een screeningsinstrument biedt voor de studie van gerichte therapieën voor de behandeling van hart- en vaatziekten 2,3. Traditioneel worden echocardiografische studies uitgevoerd met jongvolwassen muizen (4-6 weken); sommige muizenmodellen (d.w.z. genetisch gemodificeerde modellen) vertonen echter al pathologische veranderingen en hartdisfunctie op deze leeftijd. Daarom heeft cardiaal onderzoek met behulp van diermodellen zich voornamelijk gericht op therapeutische middelen die hartdisfunctie verbeteren of behandelen. Meer recent zijn de onderzoeksinspanningen daarentegen heroriënteerd om zich te concentreren op preventieve maatregelen en vroege interventies bij hartaandoeningen4.

Eerdere studies hebben het gebruik van echocardiografie beschreven om de hartfunctie te meten in modellen van myocardinfarct bij neonatale muizen 5,6; deze studies slaagden er echter niet in om de coronaire stroom te meten en, belangrijker nog, het niet registreren van een elektrocardiogram (ECG) en hartslag (HR) gegevens tijdens de procedure, hoogstwaarschijnlijk vanwege de kleine omvang van de ledematen van de pups, die de elektrodepads niet konden bereiken. We overwinnen dit probleem in dit protocol door aluminiumfolie aan de ledematen te bevestigen om ze in staat te stellen de elektrodepads te bereiken en een ECG-circuit te creëren. Bovendien beschrijft en karakteriseert dit protocol de kransslagaderstroom bij neonatale muizen.

Deze studie verkreeg B-mode en M-mode beelden in parasternale lange en korte asweergaven om structurele en functionele parameters te meten 2,3. De morfologische parameters omvatten linker atriale dimensies, linkerventrikel (LV) afmetingen, LV wanddikte, LV massa en relatieve wanddikte (RWT). De functionele parameters omvatten ejectiefractie (EF), fractionele verkorting (FS), cardiale output (CO) en snelheid van circumferentiële vezelverkorting (Vcf). Pulse wave (PW) Doppler werd gebruikt om de aortastroom in de parasternale korte-as (PSAX) weergave te meten en om mitralisbloedstroom te meten in de apicale vierkamerweergave. De apicale vierkamerweergave werd ook gebruikt om Tissue Doppler uit te voeren op het septumgedeelte van de mitralisklep annulus. Coronaire stroming bij de linker anterieur dalende (LAD) kransslagader werd ook onderzocht met behulp van een gemodificeerde parasternale lange-as (PLAX) weergave. Coronaire stroomreserve (CFR) werd berekend na een stressuitdaging geïnduceerd door verhoogde isofluraanconcentratie.

Het huidige protocol toont aan dat echocardiografische studies op zeer jonge leeftijd kunnen worden uitgevoerd bij neonatale muizen, waardoor vroege herkenning van cardiale pathologieën en longitudinale follow-upstudies van LV-hemodynamiek en coronaire flowparameters in verschillende muizenmodellen mogelijk zijn. Deze techniek kan worden gebruikt om de rol van genetische veranderingen of farmacologische interventies in de hartfunctie op vroege postnatale leeftijden te bestuderen. Bovendien biedt het protocol een waardevol hulpmiddel voor het bepalen van het begin van hartaandoeningen vroeg in het leven, waardoor onderzoekers de moleculaire mechanismen kunnen ontgrendelen die ten grondslag liggen aan de beginstadia van hartaandoeningen in verschillende muismodellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Illinois in Chicago. Voor de experimenten werden 7 dagen oude FVB/N-muizen gebruikt. Het protocol is onderverdeeld in muisvoorbereiding, echocardiografie beeldacquisitie en post-imaging dierverzorging.

1. Muisvoorbereiding

  1. Haal de 7 dagen oude muizen uit de broedkooi.
    OPMERKING: Op deze vroege leeftijd is het moeilijk om het geslacht van het dier te bepalen door lichamelijk onderzoek.
  2. Plaats ECG-gel (zie Materiaaltabel) op de verwarmde platformelektrodepads. Plaats aluminiumfoliestrips (~ 1,5 in x 0,25 inch) bovenop de elektrodepads om het elektrodebereik uit te breiden en vast te zetten met tape (figuur 1A). Plaats vervolgens de ECG-gel bovenop de aluminiumfoliestrips.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de gel onder de aluminiumfoliestrips niet uitdroogt tijdens de procedure. Als dat gebeurt, voeg dan meer gel toe om de geleidbaarheid te behouden.
  3. Knip een vinger uit een nitrilhandschoen en plaats deze op zowel de isofluraan/zuurstofneuskegel aan de ene kant als de muizenneus aan de andere kant (figuur 1B).
  4. Plaats de muisjong in de inductiekamer van de isofluraan en start de isofluraanafgifte met een concentratie van 2,5% aangedreven door 100% zuurstof (figuur 1C).
  5. Plaats de verdoofde pup in rugligging op het beeldvormingsplatform met de poten bovenop de aluminiumfoliepads en bevestig met tape. Zorg ervoor dat het elektrische circuit is voltooid en dat het ECG wordt opgenomen.
  6. Verlaag de isofluraanafgifte tot 1,5% aangedreven door 100% zuurstof. Bevestig de uitgesneden vinger van de handschoen rond de neus van de pup met tape. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de poten van de pup te knijpen.
  7. Leg een dikke laag voorbewarmde ultrasone gel op het bovenlichaam van de pup. Gebruik twee gaasrollen om de ultrasone gel op zijn plaats te houden (figuur 1D).
  8. Gebruik een verwarmingslamp om de normale lichaamstemperatuur van de pup op peil te houden (figuur 1E).
    OPMERKING: Een rectale sonde werd in het huidige onderzoek niet gebruikt om de lichaamstemperatuur te controleren vanwege de kleine omvang van de pup.

2. Echocardiografische beeldacquisitie en -analyses

  1. Transthoracale echocardiografie uitvoeren met behulp van een echocardiografie-instrument uitgerust met een lineaire array-transducer op 40 MHz voor B-modus en op 32 MHz voor Doppler (framesnelheid 233) (zie Tabel van materialen), volgens echocardiografieprotocollen voor volwassen muizen 7,8,9.
  2. Vermijd het plaatsen van overmatige druk op de borstholte van de pup bij het plaatsen van de echotransducer tijdens echocardiografische beeldacquisitie.
    OPMERKING: Vanwege het kleine formaat van de pup kan het gewicht van de transducer zelf leiden tot een veranderde hartfunctie of de dood.
  3. Leg het PLAX-beeld vast van het linkerventrikeluitstroomkanaal en het linkeratrium.
    1. Plaats de transducer in de houder, met het indexteken naar de rechterschouder van de pup.
    2. Laat de transducer zakken totdat deze in contact is met de gel en visualiseer het linkerventrikeluitstroomkanaal in B-modus (figuur 2A).
    3. Gebruik M-modus bij de aortablaadjes om de maximale diameter van het linkeratrium (LA) bij end-systole te meten (figuur 2B, tabel 1). Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen.
  4. Leg de PSAX-weergave van de linker ventrikel vast om de kamerafmetingen, wanddikte, aortastroom en longstroom te meten.
    1. Draai de transducer ~90° met de klok mee van de PLAX om de PSAX-weergave te verkrijgen.
    2. Plaats de sonde op het niveau van de papillaire spieren en gebruik de M-modus om de linkerventrikelinterne diameters (LVID), interventriculaire septumdikte (IVS) en PW te meten tijdens systole en diastole (figuur 3A, tabel 1). Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen.
    3. Bereken de RWT, een index van hypertrofie, met behulp van diastolische kamerafmetingen als volgt 3,10:
      (PW + IVS bij einddiastole) / (LVID bij einddiastole)
    4. Beweeg de transducer naar de basis van het hart en gebruik de kleur Doppler om de longslagader te visualiseren. Druk op PW Doppler om de pulmonale piekstroomsnelheid, pulmonale stroomprofielen, pulmonale ejectietijd (PET) en pulmonale versnellingstijd (PAT)11,12 (figuur 3B) te kwantificeren. Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen.
    5. Beweeg de transducer verder naar de basis en gebruik de kleurendoppler om de aortastroom te visualiseren (figuur 3C). Gebruik PW Doppler om de bloedstroom te visualiseren en de aorta-ejectietijd (AET) te meten. Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen.
    6. Bereken de Vcf (circ/sec)13,14, een indicator van de myocardiale prestaties, met behulp van LVID-einddiastole (LVIDd), LVID-eindsysteem (LVIDs) en AET als volgt (tabel 1):
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
  5. Leg het apicale uitzicht met vier kamers vast.
    1. Plaats het platform in de Trendelenburg-positie, kantel het naar links en pas de sonde aan om de vier kamers te visualiseren (figuur 4A).
    2. Gebruik kleur Doppler om de bloedstroom te visualiseren en PW Doppler aan de punt van de mitralisklepblaadjes in het midden van de mitralisklepopening om de mitralisstroom te registreren. Druk op de Cine Store om de gegevens vast te leggen.
    3. Bereken in deze weergave de volgende parameters 2,3,10 (figuur 4B en tabel 1):
      1. Bereken de E /A-ratio, wat de maximale snelheid van de bloedstroom in de vroege fase van diastole (E) is over de maximale snelheid van de bloedstroom in de late fase van diastole (A).
      2. Bepaal de E-golfvertragingstijd (DT), de tijd van piek E tot het einde van de vroege diastole.
      3. Bereken LV isovolumic relaxation time (IVRT), de tijd van aortaklepsluiting tot mitralisklepopening.
      4. Bereken LV isovolumic contractietijd (IVCT), dat is de tijd van mitralisklepsluiting tot aortaklepopening.
    4. Gebruik Tissue Doppler aan de septale kant van de mitralisklep annulus in een vierkamerweergave om de piek myocardiale ontspanningssnelheid in de vroege diastolische vulling (e') en late diastolische vulling (a) te meten, evenals de piek systolische myocardiale contractiesnelheid (s') (figuur 4C en tabel 1). Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen.
  6. Leg de gewijzigde PLAX-weergave vast om de linker voorste dalende kransslagader te onderzoeken.
    1. Gebruik een aangepaste PLAX-weergave15, waarbij u de transducer zijdelings beweegt en de straal naar de voorste kant kantelt (figuur 5A).
    2. Verplaats de sonde en gebruik de kleur Doppler om de oorsprong van de linker hoofdkransslagader (LCA) te visualiseren die uit de aorta wordt gegenereerd. Identificeer de LAD-slagader die uit de LCA wordt gegenereerd en loopt tussen de linkerventrikel-voorste wand en het rechterventrikeluitstroomkanaal16,17. Breng in deze positie PW Doppler aan om de LAD-stroom te meten (figuur 5B). Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen.
    3. Bereken de volgende LAD-kransslagaderstroomparameters (figuur 5C en tabel 2): piek coronaire stroomsnelheid (CFV), gemiddelde CFV en snelheid-tijdintegraal (VTI).
      OPMERKING: Al deze parameters worden gemeten bij een basale isofluraanconcentratie van 1,5% (baseline).
    4. Verhoog de isofluraanconcentratie tot 2,5% en wacht 5 minuten om een maximale stroom te bereiken (figuur 5C). Druk op de Cine Store-knop om de gegevens vast te leggen. Bereken CFR als de verhouding tussen diastolische piek-CFV bij maximale stroom en diastolische piek-CFV bij baseline 18,19,20 (tabel 2):
      CFR = diastolische piek CFV (2,5%) / diastolische piek CFV (1,5%)

3. Monitoring en verzorging van dieren na beeldvorming

  1. Na het voltooien van de echocardiografische beeldvorming, reinigt u de pup zorgvuldig en laat u hem ongeveer 2 minuten herstellen van de anesthesie.
  2. Voordat u de pup terugbrengt naar zijn kooi, smeert u de pup in met het beddengoed van de kooimoeder om afstoting of kannibalisatie te voorkomen.
  3. Observeer het gedrag van de moeder gedurende ongeveer 30 minuten na de procedure. Als agressief gedrag wordt waargenomen, euthanaseer de pup volgens de richtlijnen voor de dierprocedure.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie gebruikte 7-dagen oude muispups om cardiale morfologie, functie en kransslagaderstroom te karakteriseren. Het hanteren van de muis moet met zorg gebeuren en het muisplatform moet worden aangepast aan de kleine omvang van de pups, zoals beschreven in figuur 1. Een representatieve afbeelding van de PLAX-weergave wordt weergegeven in figuur 2A en aanvullende video 1. In deze weergave werd de M-modus gebruikt om de diameter van het linke...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het tijdperk van de preventieve geneeskunde is een vroege beoordeling van veranderingen in de cardiovasculaire functie vereist om het begin van de ziekte vast te stellen en geschikte interventionele therapieën te ontwerpen. Muizen worden steeds vaker gebruikt als preklinische modellen in hartonderzoek en echocardiografische studies worden meestal uitgevoerd met jongvolwassen muizen. Om de rol van genetische veranderingen of farmacologische interventies in de vroege stadia van hartaandoeningen te bestuderen, moet echoc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Chad M. Warren, MS (University of Illinois at Chicago), voor het redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH/NHLBI K01HL155241 en AHA CDA849387 subsidies aan PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Depilating agentNair Hair Remover
Electrode gelParker Laboratories15-60
High Frequency UltrasoundFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100
IsofluraneMedVetRXISO-250
Linear array high frequency transducerFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS550D
Mice breeding pairCharles River LaboratoriesFVB/NStrain Code 207
Ultrasound GelParker Laboratories11-08
Vevo Lab SoftwareFUJIFILM VisualSonics, Inc.Verison 5.5.1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le, V. P., Wagenseil, J. E. Echocardiographic Characterization of Postnatal Development in Mice with Reduced Arterial Elasticity. Cardiovascular Engineering and Technology. 3 (4), 424-438 (2012).
  2. Nagueh, S. F., et al. Recommendations for the Evaluation of Left Ventricular Diastolic Function by Echocardiography: An Update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 17 (12), 1321-1360 (2016).
  3. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 16 (3), 233-270 (2015).
  4. Chrysant, S. G. A new paradigm in the treatment of the cardiovascular disease continuum: focus on prevention. Hippokratia. 15 (1), 7-11 (2011).
  5. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial infarction in neonatal mice, a model of cardiac regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100(2016).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocol. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Chowdhury, S. A. K., et al. Modifications of sarcoplasmic reticulum function prevent progression of sarcomere-linked hypertrophic cardiomyopathy despite a persistent increase in myofilament calcium response. Frontiers in Physiology. 11, 107(2020).
  8. Batra, A., et al. Deletion of P21-activated kinase-1 induces age-dependent increased visceral adiposity and cardiac dysfunction in female mice. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1337-1349 (2021).
  9. Capote, A. E., et al. B-arrestin-2 signaling is important to preserve cardiac function during aging. Frontiers in Physiology. 12, 1302(2021).
  10. Armstrong, W. F., Ryan, T., Feigenbaum, H. Feigenbaum's Echocardiography. 7th ed. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2010).
  11. Su, J., et al. Impact of chronic hypoxia on proximal pulmonary artery wave propagation and mechanical properties in rats. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 314 (6), 1264-1278 (2018).
  12. Rudski, L. G., et al. Guidelines for the echocardiographic assessment of the right heart in adults: a report from the American Society of Echocardiography endorsed by the European Association of Echocardiography, a registered branch of the European Society of Cardiology, and the Canadian Society of Echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (7), 685-713 (2010).
  13. Wilson, J. R., Reichek, N. Echocardiographic indices of left ventricular function. A comparison. Chest. 76 (4), 441-447 (1979).
  14. Stypmann, J., et al. Echocardiographic assessment of global left ventricular function in mice. Lab Animal. 43 (2), 127-137 (2009).
  15. Wikstrom, J., Gronros, J., Bergstrom, G., Gan, L. M. Functional and morphologic imaging of coronary atherosclerosis in living mice using high-resolution color Doppler echocardiography and ultrasound biomicroscopy. Journal of the American College of Cardiology. 46 (4), 720-727 (2005).
  16. Douglas, P. S., Fiolkoski, J., Berko, B., Reichek, N. Echocardiographic visualization of coronary artery anatomy in the adult. Journal of the American College of Cardiology. 11 (3), 565-571 (1988).
  17. Lambertz, H., Lethen, H., Tries, H. P., Kersting, S. Non-invasive assessment of coronary flow reserve - valuable functional information in cardiac workflow. Ultraschall in der Medizin. 25 (1), 25-33 (2004).
  18. Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: A Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (4), 999-1009 (2016).
  19. Gan, L. M., Wikstrom, J., Bergstrom, G., Wandt, B. Non-invasive imaging of coronary arteries in living mice using high-resolution echocardiography. Scandinavian Cardiovascular Journal. 38 (2), 121-126 (2004).
  20. Gan, L. M., Wikstrom, J., Fritsche-Danielson, R. Coronary flow reserve from mouse to man--from mechanistic understanding to future interventions. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (5), 715-728 (2013).
  21. Krzanowski, M., Bodzon, W., Dimitrow, P. P. Imaging of all three coronary arteries by transthoracic echocardiography. An illustrated guide. Cardiovascular Ultrasound. 1, 16(2003).
  22. Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), 21-31 (2011).
  23. Ha, T. W., Oh, B., Kang, J. O. Electrocardiogram recordings in anesthetized mice using lead II. Journal of Visualized Experiments. (160), e61583(2020).
  24. Chu, V., et al. Method for non-invasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6(2001).
  25. Hartley, C. J., et al. Effects of isoflurane on coronary blood flow velocity in young, old and ApoE(-/-) mice measured by Doppler ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (4), 512-521 (2007).
  26. You, J., Wu, J., Ge, J., Zou, Y. Comparison between adenosine and isoflurane for assessing the coronary flow reserve in mouse models of left ventricular pressure and volume overload. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 303 (10), 1199-1207 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Echocardiography Neonatal MiceLeft Ventricular FunctionCoronary Flow MeasurementCardiac MorphologyTransthoracic EchocardiographyPulse Wave DopplerParasternal Long AxisApical Four Chamber ViewTissue Doppler ImagingCardiovascular Disease Models

Related Articles