Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63561

⸱

10 mei 2022

 ,  ,  , 
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Samenvatting

Ubiquitylering is een posttranslationele modificatie die optreedt in eukaryote cellen die van cruciaal belang is voor de regulatie van verschillende biologische routes, waaronder celoverleving, proliferatie en differentiatie. Het is een omkeerbaar proces dat bestaat uit een covalente aanhechting van ubiquitine aan het substraat door een cascadereactie van ten minste drie verschillende enzymen, samengesteld uit E1 (Ubiquitine-activeringsenzym), E2 (Ubiquitine-conjugaterend enzym) en E3 (Ubiquitine-ligase-enzym). Het E3-complex speelt een belangrijke rol bij substraatherkenning en alomtegenwoordigheid. Hier wordt een protocol beschreven om substraatubiquitylering in zoogdiercellen te evalueren met behulp van voorbijgaande co-transfectie van een plasmide dat codeert voor het geselecteerde substraat, een E3-ubiquitineligase en een gelabeld ubiquitine. Vóór lysis worden de getransfecteerde cellen behandeld met de proteasoomremmer MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) om proteasomale afbraak van substraat te voorkomen. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan kleinschalige immunoprecipitatie (IP) om het polyubiquityleerde substraat te zuiveren voor daaropvolgende detectie door western blotting (WB) met behulp van specifieke antilichamen voor ubiquitine-tag. Daarom wordt een consistent en ongecompliceerd protocol voor alomtegenwoordyleringstest in zoogdiercellen beschreven om wetenschappers te helpen bij het aanpakken van alomtegenwoordigheid van specifieke substraten en E3-ubiquitine-ligases.

Inleiding

Posttranslationele modificaties (PTM's) zijn een belangrijk mechanisme met betrekking tot eiwitregulatie, wat essentieel is voor celhomeostase. Eiwitubiquitylering is een dynamische en ingewikkelde modificatie die een assortiment van verschillende signalen creëert die resulteren in verschillende cellulaire uitkomsten in eukaryote organismen. Ubiquitylering is een omkeerbaar proces dat bestaat in de aanhechting van een ubiquitine-eiwit met 76 aminozuren aan het substraat, dat plaatsvindt in een enzymatische cascade bestaande uit drie verschillende reacties1. De eerste stap wordt gekenmerkt door ubiquitine-activering, die afhankelijk is van een ATP-hydrolyse om een hoogenergetisch thioester-gebonden ubiquitine te vormen tussen de ubiquitine C-terminus en het cysteïneresidu dat aanwezig is op de actieve plaats van het E1-enzym. Vervolgens wordt het ubiquitine overgebracht naar het E2-enzym dat een thioester-achtig complex vormt met het ubiquitine. Daarna wordt het ubiquitine covalent aan het substraat gehecht door de E2, of vaker, door het E3-enzym, dat het substraat herkent enermee interageert 2,3. Af en toe zijn E4-enzymen (Ubiquitine-keten rekfactoren) nodig om multiubiquitineketenassemblage te bevorderen3.

Ubiquitine heeft zeven lysineresiduen (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63), waardoor de vorming van polyubiquitineketens mogelijk is die verschillende koppelingen genereren om verschillende driedimensionale structuren te produceren die door verschillende effectoreiwitten zullen worden herkend 4,5. Daarom is het soort polyubiquitineketen dat in het substraat wordt geïntroduceerd essentieel om het lot van de cel te bepalen 6,7,8. Bovendien kan het substraat ook worden alomtegenwoordig via zijn N-terminale residuen die N-degrons worden genoemd. Specifieke E3-ubiquitine-ligases zijn verantwoordelijk voor N-degron-herkenning, waardoor de polyubiquitylering van nabijgelegen lysineresidu9 mogelijk is.

Tegenwoordig zijn er meer dan 40 verschillende SCF-specifieke substraten gekarakteriseerd. Onder die, belangrijke regulatoren van verschillende biologische routes, waaronder celdifferentiatie en ontwikkeling, evenals celoverleving en dood, kunnen worden gevonden 10,11,12,13. De identificatie van specifieke substraten van elke E3-ubiquitine-ligase is dus essentieel om een uitgebreide kaart van verschillende biologische gebeurtenissen te ontwerpen. Hoewel de identificatie van echte substraten biochemisch uitdagend is, is het gebruik van biochemische methoden zeer geschikt om ketenspecificiteit en het onderscheid tussen mono- en polyubiquitylering te evalueren14. Deze studie beschrijft een compleet protocol voor ubiquityleringstest met behulp van de zoogdiercellijn HEK293T die het substraat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) overexpressie met het E3 ubiquitine-ligase complex SCF (Fbxo7). UXT-V2 is een essentiële co-factor voor NF-κB-signalering, en zodra dit eiwit in cellen wordt neergehaald, remt het TNF-α-geïnduceerde NF-κB-activering11. Om polyubiquitylated UXT-V2 te detecteren, wordt de proteasoomremmer MG132 gebruikt, omdat deze het vermogen heeft om de proteolytische activiteit van de 26S-subeenheid van het proteasoomcomplex15 te blokkeren. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan een kleinschalig IP om het substraat te zuiveren, met behulp van een specifiek antilichaam geïmmobiliseerd tot agarosehars voor latere detectie door WB met behulp van geselecteerde antilichamen. Dit protocol is zeer nuttig om substraatubiquitylering in de cellulaire omgeving te valideren, en het kan ook worden aangepast voor verschillende soorten zoogdiercellen en andere E3 ubiquitine-ligasecomplexen. Het is echter noodzakelijk om het geteste substraat ook te valideren door middel van een in vitro ubiquityleringstest, omdat beide protocollen elkaar aanvullen met betrekking tot de identificatie van echte substraten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Een overzicht van het ubiquitylatie-assayprotocol in zoogdiercellen is weergegeven in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1. Overzicht van de ubiquitylatietestprocedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Celkweek

  1. Kweek HEK293T cellijn in een 100 mm TC-behandeld kweekschaal tot 80%-90% samenvloeiing in groeimedia (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en penicilline (100 eenheden), streptomycine (100 μg) en L-glutamine (0,292 mg/ml)). Incubeer de kweek bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator bij 5% CO2.
  2. Om de cellen te passeren, aspirateert u de media uit de kweekschaal met behulp van een serologische pipet. Was de cellen eenmaal met 1 ml gesteriliseerde 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS 1x).
  3. Maak de cellen los door toevoeging van 1 ml trypsine/EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) oplossing. Incubeer het gerecht bij 37 °C gedurende 5 min. Resuspendeer de cellen met behulp van een serologische pipet in 2 ml groeimedia.
  4. Breng de celsuspensie over in een frisse en schone buis van 15 ml en centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant door het voorzichtig uit te gieten. Resuspenseer de celpellet voorzichtig in 3 ml groeimedia door op en neer te pipetteren om een homogene celsuspensie te verkrijgen.
  5. Breng 1 ml van de celsuspensie over naar een 100 mm TC-behandelde kweekschaal met 9 ml groeimedia.
    OPMERKING: Als de cellen zich in goede omstandigheden bevinden, kan elk kweekschotel van HEK293T, waarbij de samenvloeiing 80% -90% is, 2 dagen na de passage drie kweekgerechten genereren met 80% samenvloeiing.

2. Celtransfectie

OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om de celcultuur te transfecteren als de bereikte samenvloeiing minder dan 80% is.

  1. Verklaar vóór transfectie of de cellen vrij zijn van verontreiniging en zich in een adequate samenvloeiing bevinden voor voorbijgaande transfecties.
  2. Bereid voor elk transfectiemonster de DNA-polyethylenimine (PEI 1 μg/μL bij pH 7,2) complexen als volgt:
    1. Verdun 3 μg van elk plasmide in 100 μL opti-MEM I gereduceerd serummedium zonder suppletie en meng het voorzichtig door de oplossing op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Hier werden de cellen getransfecteerd met 4 μg van elk plasmide: Lege vector (pcDNA3) of FLAG-Fbxo7-constructen en UXT-V2-HA, met of zonder 6xHis-myc-ubiquitine. Het totale DNA-gehalte was 12 μg.
    2. Ontdooi de PEI bij RT en voeg deze toe aan de oplossing na een verhouding van 3 μL PEI per 1 μg DNA. Homogeniseer de oplossing door op en neer te pipetteren. Incubeer het vervolgens gedurende 15 minuten bij RT om de vorming van DNA-PEI-complexen mogelijk te maken.
      OPMERKING: Het optimale aandeel PEI-volume per DNA-hoeveelheid verschilt afhankelijk van de geselecteerde cellijn.
  3. Voeg het totale volume DNA-PEI-complexen toe aan elk gerecht dat de celcultuur bevat en meng het voorzichtig door de plaat heen en weer te wiegen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% CO2.
  4. Vervang het groeimedium na 5 uur, omdat langdurige blootstelling aan PEI giftig kan zijn voor HEK293T-cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% CO2 gedurende 36 uur.

3. Cellyse en immunoprecipitatie

  1. Behandel na de incubatietijd en 6 uur voorafgaand aan de cellyse de getransfecteerde cellen met 10 μM van de proteasoomremmer MG-132. Incubeer de cellen nogmaals bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% CO2.
  2. Haal de media uit elke kweekschaal met behulp van een serologische pipet en was deze eenmaal met 1 ml 1x PBS. Maak de cellen los door 1 ml trypsine toe te voegen en het gerecht gedurende 5 minuten bij 37 °C te broeden. Resuspendeer de cellen in 1 ml groeimedia.
  3. Breng de celsuspensie over in een frisse en schone buis van 15 ml en centrifugeer deze bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  4. Verwijder het supernatant door het voorzichtig uit te gieten. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 200 μL ijskoude NP-40 lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl en 1% NP-40), aangevuld met de cocktail van protease- en fosfataseremmers (10 mM NaF en 1 mM Na3VO4) en breng de oplossing over in een schone microbuis van 1,5 ml.
  5. Incubeer de cel lysaat gedurende 30 minuten op ijs. Na incubatie centrifugeert de cellysaten bij 16.900 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  6. Breng ondertussen de agarose-anti-HA-kralen in evenwicht met ijskoude NP-40 lysisbuffer. Gebruik 15 μL agarose-anti-HA kralen voor elk monster. Was de kralen met 200 μL NP-40 lysisbuffer door deze gedurende 1 minuut bij 4 °C in een microcentrifugebuis van 3.000 x g te pulseren. Met een pipet, aspirateer en gooi het supernatant heel voorzichtig weg; herhaal dit proces drie keer. Houd daarna de kralen in evenwicht op ijs tot gebruik.
  7. Na het centrifugeren van de cellysaten, herstelt u het supernatant. Kwantificeer het eiwitgehalte in het totale lysaat met behulp van de Bradford-methode16.
  8. Zorg ervoor dat elk monster dat wordt onderworpen aan immunoprecipitatie een gelijke hoeveelheid eiwit presenteert. Incubeer het benodigde volume cellysaat met de gebalanceerde agarose-anti-HA-kralen gedurende 4 uur, voorzichtig draaiend in een roterende incubator bij 4 °C, waardoor de UXT-V2-HA zich kan binden aan de agarose-anti-HA-kralen.
  9. Verzamel de agarose-anti-HA kralen door ze te pulseren in een microcentrifugebuis bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Aspirateer voorzichtig en gooi het supernatant weg. Was de kralen drie keer met ijskoude NP-40 cellysisbuffer en twee keer met ijskoude FLAG/HA-buffer (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl en 0,1% NP-40).
  10. Verwijder na de laatste wasbeurt al het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en eluuteer het polyubiquityleerde eiwit met HA-peptide (300 μg / ml) verdund op FLAG / HA-buffer. Incubeer de agarose-anti-HA kralen met HA peptide gedurende 1 uur bij 4 °C in een schommelend shakerplatform.
  11. Spin de kralen op 3.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C en pipetteer voorzichtig het supernatant dat de polyubiquitinated eiwitten bevat. Bewaar het eluaat zo nodig in een frisse en schone microbuis bij -20 °C.
  12. Los de eluaten en de cellysaten op in 10% SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese)17 en immunoblotting.
  13. In dit onderzoek werd een natte transfer WB uitgevoerd. Voor dit soort overdracht plaatst u de gel in een transfersandwich bestaande uit filterpapier-gel-membraanfilterpapier, dempt u het met pads en drukt u het samen door een ondersteuningsraster. Plaats dit systeem verticaal in een tank gevuld met transferbuffer en tussen roestvrijstalen/platina draadelektroden. De overdracht vindt plaats gedurende 90 minuten bij 150 V in natte overdrachtsbuffer (glycine 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% Methanol).
    OPMERKING: Aangezien de celextracten zijn gekwantificeerd (stap 3.7), voert u een SDS-PAGINA uit met een gelijke hoeveelheid eiwit voor elk monster. Om het eluaat op te lossen, voert u ook gelijke volumes van elk monster uit.
  14. Onderzoek het immunoblotmembraan met behulp van geselecteerde antilichamen 11. Zorg ervoor dat een uitstrijksignaal wordt gedetecteerd in het eluaat van het polyubiquityleerde substraat dat in het IP-proces wordt getrokken door anti-myc-antilichamen te gebruiken in de monsters die het wild-type E3-ligase, het substraat en myc-ub bevatten. Zorg er in de cel lysaat (input) voor dat het signaal van het gekozen substraat, het Fbxo7-eiwit, ubiquitylated eiwitten en een huishoudeiwit (bijv. GAPDH en β-actine) wordt gedetecteerd om dezelfde hoeveelheid eiwitten in elke rijstrook te garanderen.
    OPMERKING: De verdunning voor elk gebruikt antilichaam werd bereid volgens de instructies van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

UXT (alomtegenwoordig uitgedrukt transcript) is een prefoldine-achtig eiwit dat alomtegenwoordig tot expressie gebrachte eiwitvouwcomplexen vormt in muizen- en menselijke weefsels zoals hart, hersenen, skeletspieren, placenta, pancreas, nieren en lever18. Twee splicing-isovormen van UXT, die UXT-V1 en UXT-V2 heten, zijn beschreven met verschillende functies en subcellulaire locaties. UXT-V1 is voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma en in de mitochondriën, en het is betrokken bij TNF-α-geïndu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ubiquitylering is een essentiële posttranslationele modificatie die de niveaus van verschillende eiwitten reguleert en een cruciale rol speelt in veel signaalroutes en biologische processen, waardoor een gezonde intracellulaire omgeving wordt gewaarborgd. Het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS) is een van de belangrijkste aandachtspunten van recent farmaceutisch onderzoek en biedt de mogelijkheid om tumorsuppressoren te stabiliseren of de afbraak van oncogene producten te induceren22. De afwijkende...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

F.R.T wordt ondersteund door FAPESP-subsidienummer 2020/15771-6 en CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P en V.S worden ondersteund door CAPES. C.R.S.T.B.C werd ondersteund door FAPESP-beursnummer 2019/23466-1. Wij danken Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) voor de materiële ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microtubeAxygenPMI110-06A
100 mm TC-treated culture dishCorning430167
15 mL tubeCorning430766
96-well plateCralplast655111
Agarose-anti-HA beadsSigma-AldrichE6779
Anti Mouse antibodySeracare5220-0341Geiten anti-Muis IgG
Anti Rabbit antibodySeracare5220-0337Geiten anti-Konijn IgG
Anti-Actin antibodySigma-AldrichA3853Gebruikte verdunning: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibodySigma-AldrichSAB1407251Gebruikte verdunning: 1:1000
Anti-HA antibodySigma-AldrichH3663Gebruikte verdunning: 1:1000
Anti-Myc antibodyCell Signalling2272Gebruikte verdunning: 1:1000
Bradford reagentSigma-AldrichB6916-500ML
BSASigma-AldrichA9647-100GBovien Serum Albumine
Cell incubatorNuaireNU-4850
CentrifugeEppendorf5804R500 x g gedurende 5 min
ChemiDocBioRad
Digital pH meterKasviK39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumCorning10-017-CRVHoge glucose
Fetal bovine serumGibcoF4135Filtraat vóór gebruik
HA peptideSigma-AldrichI2149
HEK293T cellsATCCCRL-3216
HepesGibco15630080
KClVWR Life Science0365-500G
Kline rotatorGlobal Trade TechnologyGT-2OIBD
MG-132Boston BiochemI-130
MicrocentrifugeEppendorf5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membraneGE Healthcare10600016
NP40 (IGEPAL CA-630)Sigma-AldrichI8896-100ML
Optical microscopeOPTIKA microscopesSN510768
Opti-MEMGibco31985-070
pcDNA3InvitrogenV79020Voor expressie in zoogdieren
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo DamárioTag 2xFlag (N-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo DamárioTag 2xFlag (N-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo DamárioTag HA (C-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo DamárioTag 6x-His-Myc (N-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en KpnI
Pen Strep Glutamine 100xGibco10378-016
Phosphate buffered saline 10xAccuGENE51226Om een 1x PBS te verkrijgen, verdun de 10x PBS in ultrapuur water
Polyethylenimine (PEI)Sigma-Aldrich9002-98-6
Ponceau SVWR Life Science0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFASTSigma-AldrichS8820
Rocking ShakerKasvi19010005
SDS-PAGE systemBioRad165-8004
Solution HomogenizerPhoenix LufercoAP-22
Trizma baseSigma-AldrichT6066-500G
Trypsine (TrypLe Express)Gibco12605-028
Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz BiotechnologySC-2048

Referenties

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
  3. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  4. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).
  5. Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
  6. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
  7. Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
  8. Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
  9. Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
  10. Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
  11. Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).
  12. Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
  13. Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
  14. van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
  15. Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
  16. Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
  18. Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
  19. Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
  20. Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
  21. Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
  22. Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
  23. Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
  24. Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
  25. Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
  26. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  27. Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
  28. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  29. Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
  30. Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
  31. Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Immunoprecipitatie assayWestern blottingproteasoomremmerpolyubiquitineerd eiwittransi nte transfectiecellyseF box eiwit
Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.