Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63569

⸱

16 maart 2022

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Samenvatting

Dynamische fusieporieopening en -sluiting bemiddelen exocytose en endocytose en bepalen hun kinetiek. Hier wordt in detail gedemonstreerd hoe confocale microscopie werd gebruikt in combinatie met patch-clamp-opname om drie fusiemodi in primaire cultuur bovine adrenal chromaffine cellen te detecteren. De drie fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken is, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij het fusie-gegenereerde Ω-vormige profiel krimpt totdat het volledig samensmelt bij het plasmamembraan.

Om deze fusiemodi te detecteren, werd het plasmamembraan gelabeld door mNeonGreen te overexpresseren dat verbonden is met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH-mNG), dat bindt aan fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PtdIns(4,5)P2) in de cytosolgerichte folder van het plasmamembraan; blaasjes werden geladen met de fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 om vesiculaire inhoudsafgifte te detecteren; en Atto 655 werd opgenomen in de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren. Deze drie fluorescerende sondes werden gelijktijdig in beeld gebracht met ~ 20-90 ms per frame in levende chromaffinecellen om fusieporieopening, inhoudsafgifte, fusieporiesluiting en veranderingen in de grootte van blaasjes te detecteren. De analysemethode wordt beschreven om drie fusiemodi van deze fluorescentiemetingen te onderscheiden. De hier beschreven methode kan in principe van toepassing zijn op veel secretoire cellen buiten chromaffinecellen.

Inleiding

Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies, waaronder synaptische transmissie, bloedglucosehomeostase, immuunrespons en virale entry 1,2,3. Exocytose, waarbij blaasjesfusie op het plasmamembraan betrokken is, geeft neurotransmitters en hormonen vrij om veel belangrijke functies te bereiken, zoals neuronale netwerkactiviteiten. Fusie opent een porie om vesiculaire inhoud vrij te maken, waarna de porie kan sluiten om het fuserende blaasje op te halen, dat kiss-and-run 1,4 wordt genoemd. Zowel onomkeerbare als omkeerbare fusieporieopening kan worden gemeten met celgebonden capaciteitsregistraties in combinatie met fusieporiegeleidingsopnamen van enkelvoudige blaasjesfusie.

Dit wordt vaak geïnterpreteerd als een weerspiegeling van volledige collapsfusie, waarbij de fusie wordt verwijd tot het afvlakken van het fuserende blaasje, en kiss-and-run, waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken zijn, respectievelijk 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recente confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) beeldvormingsstudies in chromaffinecellen hebben direct waargenomen dat fusieporieopening en -sluiting (kiss-and-run, ook wel close-fusion genoemd), fusieporieopening die lange tijd een Ω-vorm met een open porie handhaaft, genaamd stay-fusion, en krimpen van het fuserende blaasje totdat het volledig samensmelt met het plasmamembraan, dat volledige fusie vervangt voor het samenvoegen van fuserende blaasjes met het plasmamembraan4, 8,14,15,16,17.

In neuronen zijn het openen en sluiten van fusieporiën gedetecteerd met beeldvorming die de afgifte laat zien van quantum dots die vooraf zijn geladen in blaasjes die groter zijn dan de fusieporie en met fusieporiegeleidingsmetingen aan het afgiftevlak van zenuwterminals 5,18,19. Bijnierchromaffinecellen worden veel gebruikt als model voor de studie van exo- en endocytose20,21. Hoewel chromaffinecellen grote blaasjes met dichte kern bevatten, terwijl synapsen kleine synaptische blaasjes bevatten, zijn de exocytose- en endocytose-eiwitten in chromaffinecellen en synapsen vrij analoog 10,11,12,20,21,22,23.

Hier wordt een methode beschreven om deze drie fusiemodi te meten met behulp van een confocale beeldvormingsmethode in combinatie met elektrofysiologie in boviene bijnierchromaffinecellen (figuur 1). Deze methode omvat het laden van fluorescerende valse neurotransmitters (FFN511) in blaasjes om exocytose te detecteren; toevoeging van Atto 655 (A655) in de badoplossing om het door fusie gegenereerde Ω-vormige profiel te vullen, en etikettering van het plasmamembraan met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH), dat bindt aan PtdIns(4,5)P2 op het plasmamembraan 8,15,24. Fusieporiëndynamiek kan worden gedetecteerd door veranderingen in verschillende fluorescerende intensiteiten. Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van deze hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De procedure voor het gebruik van dieren volgde de NIH-richtlijnen en werd goedgekeurd door de NIH Animal Care and Use Committee.

1. Boviene chromaffine celcultuur

  1. Bereid Locke's oplossing (tabel 1) en autoclaafgereedschappen 1 dag vóór de chromaffinecelkweek.
  2. Verkrijg runderbijnieren uit een lokaal slachthuis op de cultuurdag en houd ze ondergedompeld in ijskoude Locke's oplossing voordat ze worden gedissectie.
    OPMERKING: Bijnieren zijn van 21-27 maanden oud, gezonde, zwarte Angus van beide geslachten (voornamelijk mannelijk) met een lichaamsgewicht van ongeveer 1.400 pond (~ 635 kg).
  3. Bereid 30 ml (voor 3 bijnieren) verse enzymoplossing die collagenase P, trypsineremmer en runderserumalbumine bevat (tabel 1) voor dissectie en houd het op kamertemperatuur.
  4. Kies 3 intacte klieren zonder snijwonden of bloedingen op het oppervlak en verwijder het vetweefsel met een schaar (figuur 1A). Was de klieren door perfusie met Locke's oplossing totdat er geen bloed uitkomt. Om dit te bereiken, blaast u de klier op door de bijnierader (figuur 1B) met behulp van een spuit van 30 ml die is bevestigd met een filter van 0,22 μm, zo vaak als nodigis 25.
    OPMERKING: Ongeveer 150 ml Locke's oplossing is meestal nodig om 3 klieren te wassen.
  5. Voor de spijsvertering injecteert u de enzymoplossing door de bijnierader met behulp van een spuit van 30 ml die is bevestigd met een filter van 0,22 μm totdat de klier begint op te zwellen. Laat de klieren vervolgens 10 min op 37 °C staan. Injecteer nogmaals en laat de klieren nog 10 minuten op 37 °C staan.
    OPMERKING: Ongeveer 30 ml enzymoplossing is nodig om 3 klieren te verteren.
  6. Snijd na de spijsvertering de klier in de lengterichting van de ader naar het andere uiteinde met een schaar om de klier te ontvouwen (figuur 1C). Isoleer de medullae door het witte medulla uit te tweeten in een petrischaaltje van 10 cm met locke's oplossing.
    OPMERKING: De vergelijking van het inwendige van de klier voor en na de spijsvertering is weergegeven in figuur 1C. De details van de spijsvertering en medullae-isolatie zijn eerder gemeld 23,25.
  7. Knip en gehakt het medulla in kleine stukjes met een schaar (figuur 1D). Filtreer de medulla suspensie met een nylon gaas van 80-100 μm in een bekerglas. Breng vervolgens het filtraat over in een conische buis van 50 ml voor centrifugatie bij 48 × g, kamertemperatuur, gedurende 3 minuten met een vertraging van 3.
    OPMERKING: Het hakken van de medullae duurt meestal ~ 10 minuten. Om een goede opbrengst aan cellen te verkrijgen, moeten de gehakte stukjes erg klein zijn, totdat ze niet kunnen worden getweezed.
  8. Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspenseer de celpellet met locke's oplossing door pipetteren. Filtreer de celsuspensie met een zeef van 80-100 μm en centrifugeer bij 48 x g, kamertemperatuur, gedurende 3 minuten met vertraging van 3.
  9. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met 30 ml kweekmedium (tabel 1). Bepaal het celnummer met behulp van hemacytometertelkamers25.

2. Transfectie met elektroporatie

  1. Breng 2,8 × 106 cellen over in een buis van 15 ml. Pelleteer de cellen door centrifugering bij 48 × g gedurende 2 minuten met een vertraging van 3. Voeg 100 μL transfectiebuffer (zie de door de fabrikant verstrekte materiaaltabel) toe aan de celpellet en voeg vervolgens 2 μg PH-mNG-plasmide toe.
    OPMERKING: Het PH-mNG-plasmide is gemaakt door het verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP) te vervangen door mNG in PH-EGFP15 (zie de tabel met materialen).
  2. Meng de suspensie voorzichtig door de oplossing op en neer te pipetteren en breng het mengsel onmiddellijk over in een elektroporatiecuvet (figuur 1E). Breng de cuvette onmiddellijk over naar de elektroporator (zie de tabel met materialen), selecteer het O-005-programma in de schermlijst en druk op Enter om elektroporatie uit te voeren.
    OPMERKING: Bereid de celsuspensie voor op transfectie in een celkweekkap. Breng geen luchtbellen in de suspensie tijdens de mengstap. Ga zonder vertraging verder met de volgende stap.
  3. Voeg na elektroporatie onmiddellijk 1,8 ml medium toe aan de cuvette en meng voorzichtig met een micropipettor uitgerust met een steriele punt. Voeg vervolgens 300 μL van de suspensie van de geëlektroporated cellen toe aan de coverslip (zie de tabel met materialen) in elke schotel, waarbij in totaal 5-6 schotels worden geplateerd voor één elektroporatiereactie.
  4. Breng de gerechten voorzichtig over naar een bevochtigde incubator bij 37 °C met 9% CO2 gedurende 30 minuten en voeg na 30 minuten voorzichtig 2 ml voorgewarmd medium toe aan elk gerecht.
  5. Bewaar de getransfecteerde cellen in de bevochtigde incubator bij 37 °C met 9% CO2 gedurende 2-3 dagen vóór het experiment.
    OPMERKING: De gekweekte cellen gaan een week mee. Het is het beste om gekweekte cellen te gebruiken op dag 2-3.

3. Voorbereiding voor patch-clamp opname en confocale beeldvorming

OPMERKING: Dit protocol werd uitgevoerd met een laserscan confocale microscoop en patch-clamp versterker met spanning-klem opname samen met een lock-in versterker voor capaciteitsopname. Een XY-vlak confocale beeldvorming op een vast Z-vlak (XY/Zfixed scanning) werd gebruikt om alle drie de fluorescerende signalen tegelijkertijd in beeld te brengen. Het Z-vlak was gericht op de celbodem waar het plasmamembraan zich aan de coverslips hechtte.

  1. Observeer op de dag van het patch-clamp en imaging experiment de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik brightfield om ervoor te zorgen dat de celcultuur niet verontreinigd is (figuur 1F) en epifluorescentie om te controleren op de juiste expressie van het fluorescerende eiwit.
    OPMERKING: PH-mNG wordt bijvoorbeeld uitgedrukt op het plasmamembraan van ~ 20-30% van de cellen.
  2. Bereid patchpipetjes van borosilicaatglascapillairen. Om dit te doen, trekt u de pipetten met een pipettrekker, bedekt u hun uiteinden met vloeibare was en polijst u ze met een microforge (zie de materiaaltabel).
  3. Schakel de patchklem-opnameversterker in en start de patchklemregistratiesoftware (zie de Materiaaltabel). Stel de juiste parameters in voor de opname van calciumstroom en capaciteit in de software (zie de materiaaltabel).
    1. Stel een opnameprotocol in van in totaal 60 s, waarbij de stimulatie begint bij 10 s.
    2. Stel de houdpotentiaal voor spanningsklemregistratie in op -80 mV. Stel een depolarisatie van 1 s in van -80 mV naar 10 mV als de stimulans om calciuminstroom en capaciteitssprong te induceren.
    3. Stel voor capaciteitsmetingen de frequentie van de sinusoïdale stimulus in op een bereik van 1.000-1.500 Hz met een piek-tot-piekspanning van niet meer dan 50 mV.
  4. Sla het protocol op en maak een nieuw bestand voor opname.
  5. Schakel het confocale microscoopsysteem in en stel de juiste parameters in de software in (zie de materiaaltabel).
    1. Schakel de lasers in, waaronder 458 nm, 514 nm en 633 nm, en stel het emissieverzamelingsbereik voor elke laser in volgens elke fluorescentiesonde zoals hieronder. FFN511: excitatiegolflengte (EX), 458 nm; emissiegolflengte (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
    2. Gebruik sequentiële beeldvorming voor FFN511 en mNG om kruisverwijzing tussen deze twee sondes te voorkomen. Stel een timelapse van 1 minuut in voor beeldopname (figuur 1G).

4. Patch-clamp opname en confocale beeldvorming

  1. Kies een gerecht met een goede celtoestand en de juiste expressie en voeg 2 μL fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 (10 mM voorraad, 1:1.000 werkoplossing) toe aan het medium. Zet het gerecht 20 min terug in de couveuse. U kunt ook FFN511 laden na stap 3.2 en stappen 3.3-3.5 uitvoeren terwijl u wacht om tijd te besparen.
  2. Nadat het laden van FFN511 is voltooid, bereidt u de opnamekamer voor en voegt u 2 μL fluorescerende kleurstof A655 toe aan 500 μL van de badoplossing (figuur 2A en tabel 1). Breng de coverslip van de schaal over in de opnamekamer (zie de tabel met materialen) met een pincet en voeg onmiddellijk A655-bevattende badoplossing toe (figuur 2B).
    OPMERKING: De A655 wordt in -20 °C gehouden met een concentratie van 10 mM en de werkconcentratie is 40 μM.
    LET OP: Draag handschoenen om direct huidcontact met FFN511 of A655 te voorkomen.
  3. Plaats een druppel olie (brekingsindex: 1,518; zie de tabel met materialen) op het 100x olie-onderdompelingsobjectief (numeriek diafragma = 1,4). Monteer de kamer in de microscoop en gebruik de instelknop om de olie gewoon contact te laten maken met de onderkant van de afdekplaat en dompel vervolgens de aardingsdraadpunt onder in de badoplossing (figuur 2C, D).
    OPMERKING: Kies een dompelolie die geschikt is om bij kamertemperatuur te werken. Schakelen tussen de lens met lage en hoge vergroting is niet nodig. De kamertemperatuur wordt tijdens de opname rond de 20-22 °C gehouden.
  4. Breng de cellen in beeld en gebruik brightfield en confocale beeldvorming om een goede cel met mNG-expressie te vinden. Zoom in op de geselecteerde cel en pas deze aan in het midden van de weergave om lege gebieden te minimaliseren.
    OPMERKING: De schematische tekening van fluorescentielabeling is weergegeven in figuur 3A. Een goede cel heeft meestal een glad membraan en een schone rand (figuur 3B). Bij epifluorescentie of confocale beeldvorming lijkt een goede cel een grote en platte bodem te hebben met heldere mNG-expressie (figuur 3C).
    De pixelgrootte is ~ 50 nm, binnen een bereik van ~ 40-80 nm volgens verschillende celgrootte en zoomfactor.
  5. Stel parameters in voor XY-vlak confocale beeldvorming op een vast Z-vlak (XY/Zvast scannen) van FFN511, PH-mNG en A655, met een geminimaliseerd tijdsinterval. Pas de scherpstelling aan de onderkant van de cel aan met de fijnstelknop.
    OPMERKING: PH-mNG signaleert de contour van het celplasmamembraan bij de confocale XY-vlakkruissectie (behalve de celbodem). In de buurt van de bodem van het celmembraan kunnen A655-vlekken worden waargenomen, die Ω- of Λ-vormige membraaninvaginaties weerspiegelen. Als het Z-focale vlak lager is dan de celbodem, zal de intensiteit van alle fluorescentie zwakker worden.
  6. Pas het excitatielaservermogen in de software aan om een instelling te vinden om de beste signaal-ruisverhouding te krijgen en significante fluorescentiebleking te voorkomen. Om dit te doen, begint u met een initiële testwaarde van 2,5 mW vermogen voor FFN511 opgewonden bij 458 nm en 1 mW voor mNG geëxciteerd bij 514 nm. Voor A655 geëxciteerd bij 633 nm met een HeNe-laser, gebruik een hoog laservermogen, ~ 12-15 mW (d.w.z. 70% -80% van het maximum), dat, bij continue excitatie, alle fluorescerende A655 in een Ω-vormig profiel kan bleken wanneer de porie gesloten is.
    OPMERKING: Als het laservermogen te hoog is, worden PH-mNG en FFN511 fluorescentie snel gebleekt. Als het laservermogen te laag is, zijn de signalen te zwak of luidruchtig om te worden geanalyseerd.
  7. Voeg 9 μL interne oplossing (tabel 1) toe aan een patchpipet en bevestig de pipet aan de houder in de patchklemversterkertrap (zie de materiaaltabel).
  8. Breng een kleine hoeveelheid positieve druk aan met een spuit en beweeg de pipetpunt om de badoplossing aan te raken met een micromanipulator. Zorg ervoor dat de versterker laat zien dat de pipetweerstand ~ 2-4 MΩ is met een spanningspulstest. Druk op LJ/Auto om de vloeistofverbinding te annuleren.
  9. Verplaats de pipet naar de geselecteerde cel met de micromanipulator. Om een cel-attached modus te vormen, verplaatst u de pipetpunt om de cel aan te raken (de weerstand zal toenemen); voorzichtig onderdruk uitoefenen met de spuit (weerstand zal toenemen tot meer dan 1 GΩ), verander de houdkracht van 0 tot -80 mV.
  10. Zodra de weerstand 1 GΩ passeert, wacht u op ~ 30 s voordat de configuratie is gestabiliseerd. Druk op C-fast/Auto om de snelle capaciteit te compenseren.
  11. Om een hele celmodus te vormen, past u gepulseerde korte maar krachtige negatieve druk toe met de spuit om het membraan te scheuren (de vorm van de huidige puls verandert met een geladen en ontladen membraancondensator). Druk op C- slow/Auto om de trage capaciteit te compenseren.
  12. Pas de beeldfocus iets aan om scherp te stellen op de onderkant van de cel. Start confocale timelapse imaging en patch-clamp opname tegelijkertijd door tegelijkertijd op de Start-knoppen in de twee verschillende softwaretoepassingen te klikken.
    OPMERKING: De confocale beeldvormingssoftware maakt een film met een snelheid van ~ 20-90 ms / frame. De patch-clamp-opname omvat de rusttoestand gedurende 10 s, de 1 s depolarisatiestimulatie en nog eens 49 s na stimulatie. De patch-clamp configuratie maakt het mogelijk om calciumstroom, capaciteitssprong en verval geïnduceerd door de 1 s depolarisatie van -80 tot +10 mV te registreren (figuur 3D).
  13. Zodra de opname is voltooid, moet u ervoor zorgen dat de gegevens zijn opgeslagen. Wijzig de inhoudspotentiaal terug naar 0 mV. Haal de pipet uit de badoplossing en gooi deze weg.
  14. Herhaal stap 4.7-4.13 om een andere cel in het gerecht op te nemen. Na 1 uur opname, verander naar een andere schotel voor opname.
    OPMERKING: Na 1 uur opname neemt het slagingspercentage van patchklemregistratie aanzienlijk af. Om de efficiëntie van gegevensverzameling te verhogen, wordt opname gedurende slechts 1 uur in elk gerecht aanbevolen.

5. Patch-clamp data-analyse

  1. Open geschikte software (zie de materiaaltabel) voor gegevensanalyse. Klik op de PPT-| Laad PULSE-bestand | Bestandsknoppen om het .dat bestand te laden. Klik op Doe het en vier sporen worden automatisch in één grafiek uitgezet, inclusief de calciumstroom- en capaciteitssporen.
  2. Klik op de Windows-| Nieuwe grafiekknoppen , kies de Pulse_1_1_1, de eerste golf in Y Wave(s), en klik op Doe het om de calciumstroomgrafiek te plotten. Klik op de Windows-| Nieuwe tabelknoppen , kies de Pulse_1_1_1 en klik op Doen om de onbewerkte gegevens van calciumstroom weer te geven, die kunnen worden gebruikt om het gemiddelde spoor van meerdere cellen te plotten.
  3. Teken een vierkant dienovereenkomstig in de calciumstroomgrafiek, klik met de rechtermuisknop en vouw het huidige signaal uit om de basislijn en de piek van de calciumstroom op te nemen. Klik op Graph | Toon Info om cursors A en B weer te geven en deze respectievelijk naar de basislijn en de piek te verplaatsen. De grafiekinformatie wordt onderaan weergegeven en parameters kunnen worden geschat.
  4. Herhaal stap 5.2, maar kies de Pulse_1_1_1_Cm, de tweede golf in Y Wave(s), om het capaciteitsspoor uit te zetten. Herhaal stap 5.3 en plaats de A- en B-cursors op de juiste positie om de capaciteitsparameters te meten, zoals basislijn, amplitude en vervalsnelheid.
  5. Kopieer onbewerkte gegevens in stap 5.2 naar een spreadsheet, bereken de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor een groep geregistreerde cellen en plot de gemiddelde sporen van calciumstroom en membraancapaciteit (figuur 3E) in een geschikte software.

6. Confocale beeldvorming data analyse

  1. Open de ONBEWERKTE beeldbewerkingsbestanden met alle door de fabrikant geleverde software (zie de tabel met materialen).
    OPMERKING: Sommige andere gratis programma's, zoals ImageJ of Fiji, kunnen worden gebruikt voor gegevensverwerking en het kwantificeren van de afbeeldingen die zijn verkregen in sectie 4.
  2. Klik op | Verwerken ProcessTools en gebruik de tools om voortschrijdend gemiddelde (bijvoorbeeld voortschrijdend gemiddelde voor elke 4 afbeeldingen) bestanden te genereren voor elke timelapse-afbeelding en die bestanden op te slaan.
    OPMERKING: Na het voortschrijdend gemiddelde kan de juiste aanpassing van de helderheid en achtergrond worden gedaan om de fluorescentieveranderingen van drie kanalen beter weer te geven, wat kan helpen om fusiegebeurtenissen te identificeren. Controleer de fluorescerende intensiteit in sommige regio's zonder fusiegebeurtenis kan helpen om het fluorescerende signaal van fusiegebeurtenissen te onderscheiden van achtergrondsignalen.
  3. Klik op de knoppen Quantify | Gereedschap | Stack Profile, controleer tijdspunten voor en na stimulatie om fluorescentieveranderingen in elk kanaal te identificeren. Klik op de knop Ellips tekenen om de interessante regio's (ROI's) voor fusiegebeurtenissen te omcirkelen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op ROIs opslaan om de ROI's op te slaan.
    OPMERKING: De grootte van ROI, die alle drie de fluorescerende signalen omvat, was vergelijkbaar met de grootte van blaasjes in chromaffinecellen24. Ruwe gegevens werden gebruikt voor de analyse, terwijl de rolling averaging-gegevens die de signaal-ruisverhouding verhogen, werden verstrekt om de drie signalen duidelijk weer te geven.
  4. Klik op Projecten openen om het RAW-bestand te zoeken, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op ROIs laden om het ROI-bestand in de RAW-afbeeldingsbestanden te laden om de fluorescentie-intensiteiten te meten.
    OPMERKING: Het ruwe fluorescerende signaal wordt gebruikt om sporen van verschillende kanalen te plotten. Voor elke ROI wordt de basislijn gedefinieerd als de intensiteit vóór stimulatie en kunnen de intensiteitssporen worden genormaliseerd naar de basislijn.
  5. Klik op Extra | Sorteer ROI's in de software en plot de sporen voor alle drie de kanalen van elke ROI. Klik op Rapport om de ROI-gegevens, inclusief zowel digitale gegevens als beeldtraceringen voor elke ROI, op te slaan in een bestandsmap.
    1. Identificeer een fusiegebeurtenis door de gelijktijdige toename van de intensiteit van PH-mNG (FPH) en A655 (F655) spotfluorescentie (binnen een enkel frame), vergezeld van een afname van FFN511-spotfluorescentie (FFFN).
    2. Zoek naar het uiterlijk van FPH en F655, wat wijst op PH-mNG / A655-spotvorming als gevolg van een Ω-profiel gegenereerd door fusie, waardoor de diffusie van PH-mNG uit het plasmamembraan en aanhoudende diffusie van A655 uit het bad mogelijk is.
    3. Zoek naar FFFN-afname , die aangeeft dat het vrijkomt uit een blaasje als gevolg van fusieporiënopening en de mogelijkheid uitsluit dat FPH en F655 verschijnen van membraaninatie veroorzaakt door endocytose.
    4. Inspecteer de timelapse XY/Zvaste afbeeldingen die fusiegebeurtenissen laten zien die plaatsvinden op de celbodem. Analyseer drie manieren van fusiegebeurtenissen: 1) close-fusion, 2) stay-fusion en 3) shrink-fusion.
      OPMERKING: Fusiegebeurtenissen werden zelden waargenomen vóór depolarisatie, terwijl tientallen fusiegebeurtenissen konden worden waargenomen na depolarisatie. Na fusie kan het Ω-profiel zijn porie sluiten, zijn open porie behouden of krimpen om op te gaan in het plasmamembraan.
      1. Om nauwe fusie te identificeren, zoekt u naar het dimmen van F655 , omdat fusieporiënsluiting de uitwisseling van bad A655 voorkomt, terwijl FPH onderhoudt, wat de voortdurende omzetting van PtdIns (4,5) P2 in PtdIns (4) P, of FPH vervalt met een vertraging, reflecterende blaasjes knijpen (close-fusion, figuur 4A, B).
      2. Zoek naar aanhoudende FPH en F655 om verblijfsfusie te identificeren (figuur 4C).
      3. Zoek naar parallelle dalingen van FPH en F655, wat wijst op Ω-profielkrimp om krimpfusie te identificeren (figuur 4D).
        OPMERKING: Controleer de originele afbeeldingsbestanden om de beeldsporen te inspecteren als u niet zeker bent van het gebeurtenistype. Het controleren van de fluorescerende intensiteit in sommige regio's zonder fusiegebeurtenis kan helpen om het fluorescerende signaal van fusiegebeurtenissen te onderscheiden van achtergrondsignalen.
  6. Plot representatieve sporen van intensiteitsveranderingen voor deze drie kanalen: FFN511, PH-mNG en A655. Kwantificeer het percentage verschillende fusiemodi in elke cel en plotcijfers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens de experimentele procedures in figuur 1 en figuur 2 werden chromaffinecellen uit runderbijnieren getransfecteerd met PH-mNG om het plasmamembraan te labelen; A655 werd toegevoegd aan de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren; en fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 werd geladen in blaasjes voor detectie van afgifte. Vervolgens werd XY-plane confocale timelapse beeldvorming van FFN511, PH-mNG en A655 elke 20-90 ms aan de celbodem uitgev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een confocale microscopische beeldvormingsmethode wordt beschreven om de dynamiek van fusieporie en zenderafgifte te detecteren, evenals drie fusiemodi, close-fusion, stay-fusion en shrink-fusion in bovine adrenal chromaffin cells 4,24. Een elektrofysiologische methode om de cel te depolariseren en daarbij exo- en endocytose op te roepen wordt beschreven. Systematische confocale beeldverwerking biedt informatie over verschillende vormen van poriegedrag voor fusie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de NINDS Intramurale Onderzoeksprogramma's (ZIA NS003009-13 en ZIA NS003105-08) voor het ondersteunen van dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenosine 5'-trifosfaat magnesiumzoutSigmaA9187-500MGATP voor het bereiden van interne oplossing
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Atto kleurstof om badoplossing te labelen
Basic Nucleofector voor primaire neuronenLonzaVSPI-1003Elektroporatiotransfectiebuffer samen met kit
Borosilcaat capillaire glazen pijpWarner Instruments64-0795Standaard wand met filament OD=2,0 mm ID=1,16 mm Lengte=7,5 cm
RundserumalbumineSigmaA2153-50GReagens voor kliervertering
Calciumchloride 2 MQuality Biological351-130-721Reagens voor het bereiden van badoplossing
Celfilter, 100 µmFalcon352360Materiaal voor het filteren van chromaffine celsuspensie
Cesiumhydroxide-oplossingSigma232041Reagens voor het bereiden van interne oplossing en Cs-glutamaat/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase PSigma11213873001Enzym voor kliervertering
DekglasNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 dik 60 stuks Laminine gecoat Duitse dekglazen
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KGReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing en badoplossing
DMEMThermoFisher Scientific11885092Reagens voor het bereiden van kweekmedium
EGTASigma324626-25GMReagens voor het bereiden van Cs-EGTA stock buffer voor badoplossing
Elektroporatio en NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IIPlasmiden in cellen transfecteren
Foetaal rundserumThermoFisher Scientific10082147Reagens voor het bereiden van kweekmedium
FFN511Abcamab120331Fluorescente valse neurotransmitter om blaasjes te labelen
Guanosine 5'-trifosfaat natriumzout hydraatSigmaG8877-250MGGTP voor het bereiden van interne oplossing
HEPESSigmaH3375-500GReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing
Igor ProWaveMetricsIgor proSoftware voor patch-clamp analyse en weergave van beeldgegevens
Leica Application Suite X softwareLeicaLAS X softwareConfocale software voor verzameling en analyse van beeldgegevens
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning MicroscoopLeicaLeica TCS SP5Confocale microscoop voor verzameling van beeldgegevens
L-GlutaminzuurSigma49449-100GReagens voor het bereiden van Cs-glutamaat stock buffer voor badoplossing
Lock-in versterkerHekaLock-inSoftware voor capacitieve registratie
Magnesiumchloride 1 MQuality Biological351-033-721EAReagens voor het bereiden van interne oplossing en badoplossing
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Tellingkamer
MicroforgeNarishigeMF-830Polijst pipetten om de vorming en stabiliteit van giga-ohm seals te verbeteren
Millex-GP Spuitfiltereenheid, 0,22 µmMilliporeSLGPR33RBMateriaal voor wassen en vertering van klieren
mNG(mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBTemplate voor PH-mNeonGreen constructie
Nylon gaas filterscherm 100 micrometerEIKO filtering co03-100/32Materiaal voor het filteren van medulla suspensie
Patch clamp EPC-10HekaEPC-10Versterker voor patch-clamp gegevensverzameling
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407Backbone voor PH-mNeonGreen constructie
PijpettentrekkerSutter InstrumentP-97Pijpetten maken voor patch-clamp registratie
KaliumchlorideSigmaP5404-500GReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing en badoplossing
Pulse softwareHekaPulseSoftware voor patch-clamp gegevensverzameling
OpnamekamerWarner Instruments64-1943/QR-40LPdekglas kamer, patch-clamp pijp op levende cellen toepassen
NatriumchlorideSigmaS7653-1KGReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing, badoplossing en interne oplossing
NatriumhydroxideSigmaS5881-500GReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing
Natriumfosfaat dibasischSigmaS0876-500GReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing
Natriumfosfaat monobasischSigmaS8282-500GReagens voor het bereiden van Locke’s oplossing
Roerende hot plateBarnsted/Thermolynetype 10100Verwarmer voor pipettencoating met was
Spuit, 30 mLBecton Dickinson302832Materiaal voor wassen en vertering van klieren
TetraethylammoniumchlorideSigmaT2265-100GTEA voor het bereiden van badoplossing
Trypsine remmerSigmaT9253-5GReagens voor kliervertering
Type F ImmersievloeistofLeica195371-10-9Leica confocale montageolie

Referenties

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356(2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503(2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604(2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

PatchclampExocytose EndocytoseOpenen van de fusieporieSluiten van de fusieporieFluorescente probesPrimaire celkweekVesikelfusiemodi
Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.