Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63570

⸱

2 mei 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Illinois Wesleyan University, 2Department of Biosciences, Rice University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

Samenvatting

Kuiken embryonale hoornvlieswonden vertonen een opmerkelijk vermogen om volledig en snel te regenereren, terwijl volwassen gewonde hoornvliezen een verlies van transparantie ervaren als gevolg van fibrotische littekens. De weefselintegriteit van gewonde embryonale hoornvliezen is intrinsiek hersteld zonder detecteerbare littekenvorming. Gezien de toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, is het kuikenembryo een ideaal model voor het bestuderen van littekenloos hoornvlieswondherstel. Dit protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om toegang te krijgen tot het oog. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties naar de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd. Ten derde worden lineaire hoornvlieswonden die de buitenste epitheellaag en het voorste stroma binnendringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure. Studies tot nu toe met behulp van dit model hebben aangetoond dat gewonde embryonale hoornvliezen activering van keratocytendifferentiatie vertonen, gecoördineerde remodellering van ECM-eiwitten ondergaan naar hun oorspronkelijke driedimensionale macrostructuur en adequaat opnieuw worden geïnnerveerd door cornea-sensorische zenuwen. In de toekomst kan de potentiële impact van endogene of exogene factoren op het regeneratieve proces worden geanalyseerd bij het genezen van hoornvliezen met behulp van ontwikkelingsbiologische technieken, zoals weefseltransplantatie, elektroporatie, retrovirale infectie of kraalimplantatie. De huidige strategie identificeert het embryonale kuiken als een cruciaal experimenteel paradigma voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire factoren die de genezing van littekenloze hoornvlieswonden coördineren.

Inleiding

Het hoornvlies is het transparante, buitenste weefsel van het oog dat licht doorgeeft en breekt dat bevorderlijk is voor de gezichtsscherpte. In het volwassen hoornvlies leidt schade of infectie aan het corneastroma tot een snelle en robuuste wondgenezingsreactie die wordt gekenmerkt door keratocytenproliferatie, fibrose, verhoogde ontsteking die leidt tot cytokine-geïnduceerde apoptose, generatie van reparatiemyofibroblasten en algehele remodellering van de extracellulaire matrix (ECM)1,2 . Na letsel resulteert een dergelijk herstel van hoornvliesweefsel in ondoorzichtig littekenweefsel dat de transparantie van het hoornvlies vermindert en de doorgang van licht afsluit, waardoor het gezichtsvermogen wordt vervormd en, in de meest ernstige gevallen, leidt tot hoornvliesblindheid3. Er is dus een duidelijke behoefte om betrouwbare diermodellen te ontwikkelen om de complexiteit van wondgenezing aan te pakken en om de cellulaire en moleculaire factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor wondsluiting en weefselregeneratie.

Tot op heden hebben de meeste onderzoeken naar de genezing van hoornvlieswonden postnatale4- of volwassen diermodellengebruikt 1,2,5,6,7. Hoewel deze studies hebben geleid tot een aanzienlijke vooruitgang in het begrip van de cornea wondgenezingsrespons en de mechanismen die ten grondslag liggen aan littekenvorming, slagen de beschadigde corneaweefsels in deze genezingsmodellen er niet in om volledig te regenereren, waardoor hun nut voor het identificeren van de moleculaire factoren en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het volledig recapituleren van corneamorfologie en structuur na letsel wordt beperkt. Foetale wonden die met een mes in het embryonale hoornvlies van het kuiken worden gegenereerd, bezitten daarentegen een intrinsiek vermogen om volledig te genezen op een littekenloze manier8. In het bijzonder vertoont het embryonale hoornvlies van het kuiken nonfibrotische regeneratie met de volledige recapitulatie van de extracellulaire matrixstructuur en innervatiepatronen 8,9.

Het huidige protocol beschrijft een opeenvolging van stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om de toegang tot het embryo te vergemakkelijken. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties van de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd en verwonding gewenst is. Ten derde worden lineaire centrale hoornvliesincisies die door het cornea-epitheel en in het voorste stroma doordringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De stam eieren die in dit protocol werd gebruikt, was White Leghorn en alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Illinois Wesleyan University.

1. Incubatie van kuikeneieren

  1. Bewaar de eieren op ~ 10 ° C tot 1 week nadat ze zijn gelegd om de ontwikkeling te stoppen. Wanneer u klaar bent om de ontwikkeling van kuikenembryo's te starten, veegt u de hele eierschaal af met pluisvrije doekjes (zie Materiaaltabel) verzadigd met water op kamertemperatuur om vuil en vuil te verwijderen.
  2. Zorg ervoor dat de eierschaal is ontsmet. Veeg het hele eioppervlak af met pluisvrije doekjes bevochtigd met 70% ethanol. Veeg de ethanol snel af om het ei te drogen en vermijd ethanolabsorptie door de eierschaal naar het embryo.
  3. Schik de eieren horizontaal op een bakje. Markeer de bovenkant van het ei om de verwachte positie van het embryo aan te geven. Incubeer de eieren horizontaal, met de schommelfunctie geactiveerd, in een bevochtigde incubator van 38 °C.

2. De eieren vensteren om zich voor te bereiden op membraandissectie

  1. Verwijder eieren uit de couveuse op de derde dag van de embryonale ontwikkeling (E3). Steriliseer de bovenkant van de eieren met pluisvrije doekjes bevochtigd met 70% ethanol. Droog de ethanol van de eierschaaloppervlakken.
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de ontwikkeling niet werd vertraagd tijdens de vensterprocedure, werden 6-12 eieren verwijderd en de procedure werd snel uitgevoerd terwijl de resterende eieren in de broedmachine werden achtergelaten.
  2. Plaats een ei horizontaal in een veilige eierhouder (zie Materiaaltabel). Maak met behulp van het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een klein gaatje in de bovenkant van de eierschaal nabij het puntige uiteinde van het ei.
    OPMERKING: Dit gat vergemakkelijkt de verwijdering van albumine, wat nodig is om de dooier en het embryo weg te laten vallen van het binnenste eierschaaloppervlak. Voor eierhouders werden papierpulp-eiervullers gebruikt, waarbinnen de eieren worden verzonden.
  3. Steek door het gat (stap 2.2.) een afgeschuinde injectienaald van 18 G. Met de naald naar het onderste binnenoppervlak van het ei geduwd en de schuine kant van de naald naar het puntige uiteinde van het ei gericht (bijvoorbeeld weg van de verwachte locatie van de dooier en het embryo in het midden van het ei), verwijder 2-3 ml albumine uit het kippenei en gooi weg.
    OPMERKING: Als iemands naald tijdens deze stap het embryo of de bijbehorende vasculatuur insnijdt, zal dit ertoe leiden dat bloed wordt geaspireerd met het albumine. Dit zal resulteren in embryodood. Verder, als de dooier per ongeluk samen met het albumine tijdens deze stap wordt geaspireerd, zal het embryo niet levensvatbaar zijn. In beide gevallen moet het ei worden weggegooid als het embryo niet onmiddellijk voor andere doeleinden kan worden gebruikt.
  4. Reinig het eierschaaloppervlak rond het gat met pluisvrije doekjes die licht zijn bevochtigd met 70% ethanol en veeg droog. Dicht het gat dat is gemaakt voor het verwijderen van albumine af met doorzichtige tape.
  5. Maak met het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een tweede "venster" -gat in de bovenkant van de eierschaal op de markeringsplaats (stap 1.3.). Zorg ervoor dat de schaar zich niet te ver in de eierschaal uitstrekt om te voorkomen dat het embryo of de embryonale vasculatuur, die vaak in het ei direct onder de plaats van het tweede gat wordt geplaatst, in contact komt en beschadigd raakt.
  6. Gebruik gebogen iristangen om het "venster" -gat te verbreden tot een diameter van ~ 2-3 cm en dien als een "venster" voor het zich ontwikkelende embryo onder de schaal.
    1. Steek het ene uiteinde van de tang in het gat en houd het parallel aan en dicht bij de eierschaal. Met het uiteinde van de andere tang buiten de eierschaal, knijp je de twee tanguiteinden voorzichtig samen, zodat ze kunnen breken en kleine stukjes van de eierschaal kunnen verwijderen. Ga door met het breken en verwijderen van eierschaalfragmenten totdat er een venster van 2-3 cm overblijft dat het embryo direct bedekt.
      OPMERKING: Eieren waarin embryo's niet direct onder het gat liggen dat in stap 2.6 is gemaakt. mogen niet worden gebruikt omdat de komende membraandissecties een uitdaging zouden zijn om te voltooien. Zelfs met het horizontaal schommelen van de eieren is ongeveer 10% van de eieren onbruikbaar vanwege de slechte positionering van het embryo. Deze embryo's kunnen voor andere doeleinden worden gebruikt.
  7. Om bacteriële besmetting te beperken, voegt u door het raamgat (bijv. in het ei) ~ 100-200 μL Ringer's oplossing (8 g NaCl, 0,37 g KCl en 0,23 g CaCl2,2H 2 0 per L gedestilleerde H20) toe die Penicilline / Streptomycine-antibiotica bevatten (50 U / ml penicilline en 50 μg / ml streptomycine, zie Materiaaltabel).
  8. Dicht het raamgat af met doorzichtig plakband. Voer de eierafdichting uit door een hoek van de tape op de lange as van het gat uit te lijnen en de tape op de schaal ~ 1-2 cm van de rand van het gat te drukken.
    1. Blijf rond de opening afdichten totdat een hangende klep van tape aan één kant is achtergelaten. Druk de twee stukjes tape tegen elkaar, waardoor een koepelvormige vorm over het gat ontstaat en druk de flap van overhangende tape op de schaal om het ei af te sluiten.
      OPMERKING: Eieren moeten worden vensterd op E2 of E3. Volgens de ervaring resulteert windowing voorafgaand aan E2 in een lage levensvatbaarheid van het embryo. Bovendien worden door E4 de embryonale en extra-embryonale membranen gehecht aan de eierschaal10, en elke poging om op E4 of later te vensteren, resulteert vaak in embryoschade of scheuren van extra-embryonale bloedvaten, waarbij beide gebeurtenissen leiden tot de uitkomst van embryodood.
  9. Breng de "venstervormige" eieren terug naar de broedmachine voor verdere ontwikkeling. Zorg ervoor dat u de eieren horizontaal houdt en schakel de schommelfunctie van de incubator uit.
  10. Herhaal stap 2.2.-2.9. voor elk ei.

3. Microdissecties van de extra-embryonale membranen

  1. Verwijder een E5.5-vensterei uit de broedmachine. Leg het embryo bloot door de tape weg te snijden van het raam met een gesteriliseerde ontleedschaar.
  2. Gebruik een ontleedmicroscoop om het embryo en zijn extra-embryonale membranen door het raam te observeren. Gebruik indien nodig een schaar of een gebogen iristang om het venster te verbreden, zodat het embryo goed onder het raam wordt geplaatst en zorg ervoor dat de embryonale vasculatuur niet wordt beschadigd.
    1. Voeg twee druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine-antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
  3. Gebruik een ontleedmicroscoop om ervoor te zorgen dat het embryo zich in het juiste ontwikkelingsstadium bevindt (Hamburger Hamilton stadium 27, ~E5.5)11,12 en lokaliseer de posities van het vruchtwatervlies (ACM) en het chorioallantoïsche membraan (CAM).
    OPMERKING: In dit stadium wordt het embryo omringd door de ACM, die bestaat uit het vruchtwatermembraan en het bovenliggende chorionmembraan gefuseerd en gedeeltelijk bedekt door de sterk gevasculariseerde allantois, die zich uitstrekt van het darmgebied van het embryo en fuseert met het overlappende chorion om de CAM11,12 te vormen. De ACM is niet zwaar gevasculariseerd, waardoor men deze membranen kan ontleden om het embryo bloot te stellen zonder de bloedvaten te beschadigen en het embryo te beschadigen.
  4. Voer in dit stadium extra-embryonale membraandissecties uit (E5.5).
    OPMERKING: E5.5 is het ideale moment om de extra-embryonale membraandissecties uit te voeren. Het eerder ontleden van de membranen (bijvoorbeeld bij E4) vóór CAM-vorming vermindert de toegankelijkheid van het embryo in latere stadia11. Bovendien wordt het embryo op E5.5 slechts gedeeltelijk bedekt door de sterk gevasculariseerde CAM, maar in de komende 1-2 dagen omhult de CAM snel en sluit verdere toegang tot het embryouit 11,12. Om deze reden is membraandissectie op E6 of later een uitdaging, omdat het risico op scheurende bloedvaten toeneemt.
    1. Gebruik een paar gesteriliseerde fijne tangen om de ACM voorzichtig vast te pakken en weg te trekken van het embryo. Gebruik vervolgens een gesteriliseerde micro-ontleedschaar om een gat in de ACM direct boven de voorpoot te snijden dat zich uitstrekt van het membraan boven de voorpoot tot het membraan boven het hoofd.
      OPMERKING: Deze stap ontspant de chorion- en amnionmembranen, waardoor ze gemakkelijker te grijpen zijn en verder te ontleden met een tang in de volgende stappen. Zie figuur 1 voor een nuttig schema van hoe membranen worden ontleed door het eierschaalvenster.
  5. Gebruik twee paar fijne, steriele tangen om het amnion voorzichtig vast te pakken in twee aangrenzende posities tussen de ACM en de CAM (bijvoorbeeld een gebied tussen de snede boven de voorpoot en de dichtstbijzijnde rand van de CAM).
    1. Beweeg voorzichtig elk paar tangen, beide stevig het vruchtwatermembraan vastpakkend, van elkaar af, waarbij het ene paar dorsaal naar het embryo beweegt en het andere ventraal.
      OPMERKING: Deze beweging dient om het amnion verder te scheuren en tegelijkertijd de ACM (die door de ene tang in de dorsale richting ten opzichte van het embryo wordt getrokken) en de CAM (die door de andere tang in de ventrale richting ten opzichte van het embryo wordt getrokken) te scheiden.
    2. Zorg ervoor dat de membranen worden gescheiden wanneer de CAM het embryo niet langer bedekt en de allantoïsche slagader en ader, die afkomstig zijn van de embryonale darm naar de CAM, gemakkelijk zichtbaar zijn.
  6. Gebruik gesteriliseerde fijne tangen om het resterende amnionmembraan dat het embryo bedekt te ontleden en te verwijderen. Het wordt meestal waargenomen dat het resterende amnion de caudale helft van het embryo gedeeltelijk bedekt.
    1. Pak met behulp van een gesteriliseerde tang het amnion in de buurt van het midden van de schedel van het embryo en trek het amnion voorzichtig in een caudale richting met betrekking tot het embryo naar de eerder verplaatste CAM. Het embryo zal nu volledig worden blootgesteld en verdere groei van de CAM zal voornamelijk plaatsvinden buiten het zich ontwikkelende embryo.
      OPMERKING: Zie figuur 1 voor een nuttig schema over hoe het blootgestelde embryo zal verschijnen na membraandissectie. Raadpleeg ook een eerder gepubliceerd rapport11 voor nuttige schematische diagrammen van stap 3.3.-3.6.
  7. Voeg een paar druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
  8. Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape, zoals beschreven in stap 2.8. Breng het ei terug naar de incubator voor verdere ontwikkeling, houd het ei horizontaal en houd de schommelfunctie van de incubator geïnactiveerd.
  9. Herhaal stap 3.1.-3.8. voor elk ei.
    OPMERKING: De hierboven beschreven extra-embryonale membraandissecties op E5.5 maken toegang tot het embryo mogelijk via E7, wanneer wonden kunnen worden uitgevoerd 8,9. Tegen E8 begint de voortdurende groei van het CAM-weefsel het schedelgebied van het embryo te bedekken, waardoor verdere toegang tot het hoornvlies wordt uitgesloten. Als men wonden wil uitvoeren in oudere E8-E9 hoornvliezen, is het mogelijk om de groeiende CAM ventraal te herpositioneren ten opzichte van het embryo (stap 3.10.). Als men op E7 wil verwonden, stap 3.10. is niet nodig om uit te voeren en men kan doorgaan naar stap 4, hoornvlieswonden.
  10. Verwijder een E7-ei uit de couveuse waarvan de extra-embryonale membranen eerder werden ontleed bij E5.5 (stappen 3.1.-3.8.). Pak met gesteriliseerde tang alle beschikbare amnionmembraanweefsels vast die met de CAM zijn gefuseerd en trek het amnionmembraan voorzichtig weg van het schedelgebied van het embryo in een ventrale richting ten opzichte van het embryo.
    OPMERKING: Aangezien het amnionische membraan dat van het embryo wordt verplaatst, is gefuseerd met de CAM, zal de groeiende en sterk gevasculariseerde CAM de amnion-grijpende tang volgen en weggaan van het schedelgebied. Herhaal deze stap dagelijks om de CAM voortdurend weg te verplaatsen van het embryo totdat het embryo de gewenste leeftijd heeft om te verwonden.

4. Hoornvlies verwonding

  1. Verkrijg een ei uit de couveuse voor verwonding op de gewenste embryonale leeftijd, E7-E9. Leg het embryo bloot door de tape weg te snijden van het raam met een gesteriliseerde ontleedschaar. Voeg een paar druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
  2. Gebruik een micro-ontleedmes om een incisie te maken die de omvang van het hoornvlies van het rechteroog overspant (vanwege de manier waarop het embryo in het ei ligt, is het linkeroog niet toegankelijk maar kan het dienen als een niet-gewonde controle), die parallel loopt aan en in overeenstemming is met de koraalspleet (figuur 1). De eerste snede doorkruist het hoornvliesepitheel.
    1. Gebruik het micro-ontleedmes om het hoornvlies opnieuw te scheuren op dezelfde plek als de eerste incisie 2x meer (bijv. drie sneden in totaal, waarbij snede 2 en snij 3 optreden, samen met dezelfde positie in het hoornvlies als gesneden 1)11. De tweede scheur zal het keldermembraan doorkruisen en de derde zal het voorste stroma binnendringen.
      OPMERKING: Als het embryo zich onder de ontleedde CAM heeft gevestigd, kan men gesteriliseerde gebogen iristangen gebruiken om het hoofd voorzichtig onder de CAM vandaan te bewegen. Plaats de gebogen iristang onder het hoofd en maak contact met de linkerkant van het hoofd. Wieg het hele hoofd bovenop de gesloten gebogen iristang en til het hoofd voorzichtig rond en boven de CAM op. Om te helpen bij de levensvatbaarheid, gebruikt u een vergelijkbare techniek met de gebogen iristang om het embryo na de operatie terug onder de CAM te stoppen om een goede groei van de CAM te bevorderen.
  3. Voeg 3-4 druppels Ringer's oplossing met Penicilline / Streptomycine-antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
  4. Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape en keer terug naar de broedmachine, waarbij het ei horizontaal blijft. Laat het embryo zich ontwikkelen en de hoornvlieswond gedurende een gewenste periode genezen (bijv. 0,5-11 dagen) en euthanaseer het embryo vervolgens op humane wijze door onthoofding.
  5. Gebruik gebogen iristangen om het oog te oogsten van een geëuthanaseerd embryo dat in een petrischaaltje van Ringer's zoutoplossing zweeft door het oog voorzichtig aan de achterste kant te grijpen, waar het oog en gezichtsweefsel elkaar ontmoeten, en voorzichtig het hele oog weg te tillen en vrij van het gezichtsweefsel.
    1. Gebruik een fijne tang om een klein gaatje (3-5 cm) in de achterkant van het hele oog te prikken en fixeer het hele oog in 4% paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts met milde agitatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na de eerdere dissectie van de ACM en CAM op E5.5 om het schedelgebied van het zich ontwikkelende embryo bloot te leggen, werd een reeks scheuren gemaakt die het centrale hoornvlies van E7 overspanden in ovo (figuur 1). Een ideale wond om de regeneratie van het hoornvlies te bestuderen, vindt plaats na drie scheuren, elk gemaakt op dezelfde locatie van het hoornvlies. De eerste scheur doorkruist het cornea-epitheel, terwijl de tweede en derde scheuren respectievelijk het onderliggen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het kuiken is een ideaal modelsysteem voor het bestuderen van foetaal, littekenloos hoornvlieswondherstel. In tegenstelling tot zoogdieren is het kuiken gemakkelijk toegankelijk tijdens de ontwikkeling met behulp van ovo8 of ex ovo strategieën24. Het embryonale hoornvlies van het kuiken is veel groter dan hoornvliezen van knaagdieren, met bijna 50% van het schedelvolume gewijd aan het oog25, waardoor het zeer vatbaar is voor fysieke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen met betrekking tot de informatie die in dit manuscript wordt gepresenteerd.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een artistieke en wetenschappelijke ontwikkelingsbeurs via Illinois Wesleyan University aan TS en gedeeltelijk gefinancierd door NIH-R01EY022158 (PL).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
18 G hypodermic needleFisher Scientific14-826-5D
30 degree angled microdissecting knifeFine Science Tools10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Molecular ProbesD1306
5 mL syringeFisher Scientific14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodiesMolecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)SigmaC8106
Chicken egg traysGQFO246
Dissecting Forceps, Fine Tip, SerratedVWR82027-408
Dissecting scissors, sharp tipVWR82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full CurvedVWR100494-908
KimwipesSigmaZ188956
Microdissecting ScissorsVWR470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)Developmental Studies Hybridoma BankB3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)Developmental Studies Hybridoma Bank3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)Biolegend801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)Developmental Studies Hybridoma BankM1-B4
ParaformaldehydeSigma158127
Penicillin/StreptomycinSigmaP4333
Potassium chloride (KCl)SigmaP5405
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificBP358
Sportsman 1502 egg incubatorGQF1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)Scotchn/a
```

Referenties

  1. Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
  2. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  3. Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
  4. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
  5. Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
  6. Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
  7. Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
  8. Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
  9. Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).
  10. Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
  11. Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  13. Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
  14. Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
  15. Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
  16. Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
  17. Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
  18. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
  19. Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
  20. Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
  21. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
  22. Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
  23. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  24. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  25. Waldvogel, J. A. The bird's eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
  26. Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
  27. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Embryonaal hoenhoornvlies van het kuikenwondgenezing van het hoornvliesstroma van het hoornvliesdifferentiatie van keratocytenremodellering van de extracellulaire matriximmunohistochemieweefseltransplantatieDNA electroporatieorganisatie van collageenvezels
Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.