Dit protocol biedt een praktische gids voor de chirurgie voor het creëren van aortaklepinsufficiëntie (AR) bij de muis. Beoordeling van de AR-muis door middel van echocardiografie en invasieve hemodynamische meting recapituleert de klinisch relevante kenmerken van door volumeoverbelasting geïnduceerde excentrische hypertrofie, wat wijst op de veelbelovende toepassing ervan in de studie van cardiale hypertrofie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chirurgisch geïnduceerde overbelasting van het hartvolume door aortaregurgitatie bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aortaklepinsufficiëntie (AR) is een veel voorkomende hartklepaandoening die volumeoverbelasting van het hart uitoefent en een wereldwijd probleem voor de volksgezondheid vormt. Hoewel muizen veel worden toegepast om licht te werpen op de mechanismen van hart- en vaatziekten, zijn muismodellen van AR, vooral die geïnduceerd door chirurgie, nog steeds schaars. Hier werd een muismodel van AR in detail beschreven dat chirurgisch wordt geïnduceerd door verstoring van de aortakleppen onder echocardiografie met hoge resolutie. In overeenstemming met de uitgebraakte bloedstroom vertonen AR-muizenharten een onderscheidend en klinisch relevant fenotype van volumeoverbelasting, dat wordt gekenmerkt door excentrische hypertrofie en hartdisfunctie, zoals blijkt uit echocardiografische en invasieve hemodynamische evaluatie. Ons voorstel biedt, op een betrouwbare en reproduceerbare manier, een praktische gids voor het opzetten en beoordelen van een muismodel van AR voor toekomstige studies naar moleculaire mechanismen en therapeutische doelen van cardiomyopathie met volumeoverbelasting.
Inleiding
In aanwezigheid van verhoogde volumeoverbelasting (preload) of drukoverbelasting (afterload) ondergaat het hart een vergroting, een aandoening die hypertrofie wordt genoemd. Hoewel cardiale hypertrofie een compenserende respons is om de perfusie van perifere organen te behouden vóór hartfalen, is het ook een onafhankelijke risicofactor voor ernstige cardiovasculaire gebeurtenissen 1,2. Volumeoverbelasting is een van de belangrijke manifestaties van verhoogde mechanische belasting. Volumeoverbelasting treedt op tijdens hartdiastole en induceert excentrische harthypertrofie, die niet alleen vaak wordt gezien bij klepaandoeningen, zoals aortaklepinsufficiëntie en mitralisinsufficiëntie, maar ook bij hypertensieve hartziekte in het eindstadium, myocardinfarct, gedilateerde cardiomyopathie en overmatige lichaamsbeweging. Bovendien hebben in de klinische praktijk sommige geneesmiddelen die de myocardiale hypertrofie veroorzaakt door drukoverbelasting beter kunnen verminderen, onbevredigende effecten bij de behandeling van myocardiale hypertrofie veroorzaakt door volumeoverbelasting1. Het is daarom van groot belang om het mechanisme en de interventiemethoden van excentrische cardiale remodellering veroorzaakt door volumeoverbelasting te ontdekken. Dergelijk onderzoek naar volumeoverbelasting is echter lange tijd aanzienlijk belemmerd, wat grotendeels kan worden toegeschreven aan het ontbreken van kleine diermodellen die gemakkelijk kunnen worden bediend, efficiënt kunnen worden gekwantificeerd en stabiel kunnen worden gerepliceerd3.
Wat kleine diersoorten betreft, zijn muizen het reguliere modeldier geworden voor onderzoek naar hart- en vaatziekten vanwege hun korte levenscyclus, gemakkelijke bediening, duidelijk genoom en gemak van genetische modificatie4. In termen van modelcategorieën hebben chirurgische modellen in vergelijking met genetische modificatiemodellen en met geneesmiddelen behandelde modellen duidelijke unieke voordelen. Het chirurgische model kan overmatige en moeizame muizenfokkerij en genidentificatie vermijden die nodig zijn voor het genetische modificatiemodel en kan ook de niet-specifieke effecten op extracardiale weefsels en organen vermijden die moeilijk te controleren zijn in met geneesmiddelen behandelde modellen. In eerdere literatuur is gedocumenteerd dat het muismodel van een aortocavale shunt overbelasting van het hartvolume induceert5. Aortocavale shunt is echter verantwoordelijk voor een klein deel van de cardiale excentrische hypertrofie in de kliniek en veroorzaakt biventriculaire overbelasting5, waardoor het van weinig translationele betekenis is om te worden gebruikt in onderzoek naar excentrische hypertrofie van de linkerventrikel Niettemin vormt hartklepaandoening wereldwijd een groot probleem voor de volksgezondheid; Geschat wordt dat ongeveer 15% van de bevolking >75 jaar een significante klepaandoening heeft6. Hoewel aortaklepinsufficiëntie (AR) een deel van de hartklepaandoeningen in beslag neemt, veroorzaakt het duidelijk excentrieke linkerventrikel (LV) hypertrofie als gevolg van een toename van volumeoverbelasting door regurgitante bloedstroom 7,8. Aangezien de juiste gemeenschappelijke halsslagader (RCCA) een route biedt om de locatie van aortakleppen te bereiken, is het conceptueel intrigerend om aortakleppen via de RCCA te verstoren om regurgitante bloedstroom bij muizen te veroorzaken. Geïnspireerd door de technieken voor het creëren van oscillerende aortastroom9, is onlangs in ons laboratorium een muismodel van aortainsufficiëntie (AR) ontwikkeld om volumeoverbelasting7 chirurgisch te induceren. Deze AR-muis vertoont duidelijke LV excentrische hypertrofie, wat een klinisch transformatieve benadering is en een groot translationeel potentieel vertoont voor het bestuderen van het overbelaste hartfenotype en het onderliggende mechanisme. Hier werd een gedetailleerde stapsgewijze procedure beschreven om AR-chirurgie bij muizen uit te voeren, gerecapituleerd door hoogfrequente echocardiografie en invasieve hemodynamica om het succes van de operatie te garanderen (Figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol heeft ethische goedkeuring gekregen van het Animal Care and Use Committee van het Zhongshan Hospital, Fudan University, en volgt de aanbevelingen van de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (nr. 85-23, herzien 2011; Nationale Instituten voor Gezondheid, Bethesda, MD, VS).
OPMERKING: Dierproeven werden uitgevoerd op mannelijke C57BL/6J-muizen >10 weken oud. De chirurg in dit protocol moet bekwaam zijn in het manipuleren van echocardiografie bij muizen, voordat hij/zij de AR-operatie in de muis uitvoert. Bij de meeste onderzoeksinstellingen wordt echocardiografie van kleine knaagdieren echter uitgevoerd door een kernfaciliteit, zodat de chirurg nauw kan samenwerken met kernexperts, zo niet een ervaren chirurg in echocardiografie. Ervaring met invasieve hemodynamische meting bij muizen is een pluspunt.
1. Voorbereiding op echografie (verplicht) en invasieve hemodynamische meting (optioneel)
- Start het ultrasone apparaat op dat is aangesloten op een 30 MHz-sonde. Zet het temperatuurgeregelde ultrasone dierplatform in de positie voor de aortaboogaanzicht, waarbij de rechterkant van de muis omhoog wordt gekanteld.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het schedeluiteinde van het ultrasone dierplatform in de richting van de chirurg te plaatsen. Of het craniale uiteinde of het caudale uiteinde naar de chirurg toe is, moet echter afhangen van bij welke de chirurg zich het prettigst voelt. - Sluit een micromanometer (drukkatheter) aan op het data-acquisitieapparaat en de analoge/digitale converter. Dompel de kalibratiecuvet van de micromanometer onder in zoutoplossing voor kalibratie van zoutoplossing.
NOTITIE: Als de toestand het toelaat, kan ook een druk-volumekatheter worden gebruikt. We gebruiken een drukkatheter omdat het apparaat voor het verzamelen van drukgegevens in het laboratorium alleen drukgegevens verzamelt en niet de capaciteit heeft om volumegerelateerde gegevens te verzamelen, hoewel de echocardiografische resultaten in het huidige onderzoek ook LV-volumes kunnen afbakenen.
2. Anesthesie van muizen, voorbereiding van chirurgische hulpmiddelen en isolatie van de RCCA
OPMERKING: Chirurgisch gereedschap moet voor gebruik worden gesteriliseerd en geautoclaveerd. Het wordt aanbevolen om alle stappen onder aseptische omstandigheden uit te voeren. Het wordt ook aanbevolen om de ontharing 1 dag van tevoren uit te voeren om tijd te besparen tijdens de beeldvormingsprocedure, mogelijke ongewenste stressreacties bij de muizen te minimaliseren en om de borst en ledematen schoon en droog te houden.
- Verdoof de muis in de inductiekamer, die is aangesloten op een verdamper die is ingesteld op 4% isofluraan gemengd met 0,8 l/min zuurstof. Wanneer de muis in slaap valt of de staartknijpreflex verdwijnt, verwijdert u het dier uit de inductiekamer.
- Plaats het dier in rugligging op een koperen plaat, die wordt verwarmd door een verwarmingskussen. Sluit de neus aan op een neuskegel, waaraan 1,5% isofluraan gemengd met 0,8 l/min zuurstof wordt toegediend om een constant niveau van anesthesie te behouden.
OPMERKING: Een koperen plaat wordt aanbevolen omdat deze gemakkelijk schoon te maken is en roestvrij is, hoewel deze kan worden vervangen door een ander type metalen plaat. - Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen en plak de ledematen op de koperen plaat. Verwijder het haar van de nek en borst met ontharingscrème en reinig het onthaarde gebied met 75% ethanol.
- Bereid de benodigde chirurgische instrumenten voor, waaronder verschillende tangen en scharen (Figuur 2A; zie Materiaaltabel).
- Maak een longitudinale mediane incisie, ongeveer 1 cm, in de nek met een gebogen duimtang en een rechte schaar, tussen de onderkaak en het borstbeen.
- Ontleed botweg het linker- en rechterdeel van de schildklier met behulp van twee tangen. Met de gebogen fijne duimtang scheidt u de stemohyoideus-spier en het vetweefsel in het rechter paratracheale gebied om de RCCA zo lang mogelijk bloot te leggen. Vermijd te allen tijde letsel van de nervus vagus, omdat dit hypotensie, bradycardie en de dood kan veroorzaken (Figuur 2B).
3. Katheterisatie via het RCCA en de aorta ascendens onder echografische begeleiding
- Steek twee 6-0 zijden draden van elk ongeveer 5 cm onder het vat door. Ligate de distale RCCA met een strakke knoop met behulp van één draad en bevestig de twee uiteinden van de strakke knoop naast de kop van het dier om lichte spanning op de RCCA te behouden. Deze actie zal de katheterisatie in de komende stappen vergemakkelijken.
- Leg een losse knoop op de proximale RCCA met behulp van de tweede draad. Dit vult het afgesloten gebied van de RCCA met bloed, waardoor het gemakkelijk kan worden ingesneden.
- Gebruik een kleine knijpschaar om een wigvormige opening af te knippen, 1-2 mm proximaal van de strakke knoop, om de RCCA te openen. Zorg ervoor dat de incisie niet te klein is om een katheter in te brengen en ook niet te groot om tijdens het inbrengen te breken.
OPMERKING: Incisie onder een microscoop wordt ten zeerste aanbevolen. Het doorboren van een klein gaatje in het vat met een naald van 26 G is een alternatieve methode. - Bereid een plastic katheter voor met een metalen draad (Figuur 2C). Rek de incisie uit met een gebogen bindtang met lange handen, steek de plastic katheter met de metalen draad in de RCCA en ga verder naar de losse knoop.
- Maak de losse knoop los om de katheter en draad ongeveer 2 cm vooruit te schuiven. Breng de koperen plaat met het dier over op het ultrasone dierplatform, breng ultrasone gel aan op de nek en borst van de muis en stuur vervolgens de katheter en draad voorzichtig door de RCCA en de stijgende aorta onder echografische begeleiding.
4. Doorprikken van de aortakleppen onder echografische geleiding
- Verzamel basale ultrasone gegevens in Doppler-kleurenmodus en pulsgolf Doppler-modus voordat de plastic katheter en metaaldraad de aorta-opening bereiken.
- Met de echografie gelijktijdig en duidelijk de aorta ascendens, het LV-uitstroomkanaal, de katheter en de draad, wanneer de katheter en draad de aortaopening bereiken, steekt u de punt van de draad uit de katheter en doorboort u de aortakleppen (Figuur 1).
OPMERKING: Wanneer de aortaklep is geperforeerd, moet de chirurg deze breuk kunnen voelen. - Trek de katheter en de draad iets terug uit de aortaopening en verzamel ultrasone gegevens na perforatie in kleuren-Doppler-modus en pulsgolf-Doppler-modus na punctie van de aortakleppen. De regurgitantstroom is rood van kleur tijdens hartdiastole in de Doppler-kleurenmodus en kan kwantitatief worden bevestigd in de pulsgolf Doppler-modus.
- Beschouw een piekdiastolische snelheid van de aortastroom (PSVa) tussen 300-500 mm/s als bevredigend. Als de regurgiterende mate van bloedstroom onbevredigend is, herhaal dan stap 4.2.
- Optioneel: Breng een micromanometer aan voor en direct na perforatie van de aortakleppen om het bestaan van regurgitant flow verder te bevestigen. Om dit te controleren, wordt zowel de aorta-einddiastolische druk (AEDP) verlaagd als de aortapulsdruk verhoogd met ongeveer 20 mmHg.
OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van een micromanometerkatheter om invasieve LV-hemodynamische metingen uit te voeren, is elders elegant gepresenteerd10,11.
5. Terugtrekken van de plastic katheter en metaaldraad, en perioperatieve zorg
- Verwijder de ultrasone gel en droog de muis af met steriel gaas of weefsel na bevestiging van succesvolle perforatie van de aortakleppen, en trek vervolgens voorzichtig de plastic katheter terug met de centrale metalen draad, voordat de RCCA wordt afgebonden.
- Sluit de huid met behulp van een 5-0 zijden hechtdraad in een doorlopend hechtpatroon en breng povidon-jodiumoplossing aan op de hechtplaats. Dien de muis met meloxicam (0,13 mg) subcutaan toe voor analgesie en plaats de muis in een voorverwarmde kooi onder een verwarmende lamp tot hij volledig wakker is voor herstel.
6. Schijnoperatie
- Voer de paragrafen 1-3 uit zoals beschreven. Voer voor de schijnmuis dezelfde procedures uit als in sectie 4 zonder de aortakleppen te verstoren.
- Voer sectie 5 uit zoals beschreven, hoewel AR niet aanwezig mag zijn in een van de schijnoperatiemuizen.
7. Beoordeling van de perforatie van de aortaklep, de hartmorfologie en de functie met behulp van echocardiografie en invasieve hemodynamische meting
- Gebruik na 4 weken AR de echocardiografische B-modus, de kleurendopplermodus en de pulsgolf Doppler-modus om de bloedstroom van de aortaboog in de aortaboog te beoordelen en meet PDVa volgens stap 4.1 en elders 1,12.
- Gebruik echocardiografische B-modus en M-modus om de LV-dimensie en contractiliteit in de parasternale lengteasweergave te beoordelen, waarbij de LV-einddiastolische (LVEDD) en eindsystolische (LVESD) afmetingen, LV achterwand einddiastolische (LVPWTd) en eindsystolische (LVPWT's) dikte, LV-ejectiefractie (LVEF) en fractionele verkorting (LVFS) zijn afgeleid.
OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van het ultrasone apparaat en het manipuleren van ultrasone beelden is eerder elegant beschreven12. - Voer na de echocardiografische beeldvorming invasieve hemodynamische metingen uit, op een manier die vergelijkbaar is met stap 4.3 en elders10. Registreer de maximale contractie- en relaxatiesnelheid (+dp/dt en −dp/dt). Steek de micromanometer in de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA, niet RCCA), aangezien de RCCA permanent is geligeerd tijdens de AR-operatie.
- Na de invasieve hemodynamische meting, euthanaseer de muis via cervicale dislocatie. Open de borstkas, spoel het hart door met 10% formaline, gevolgd door 0,9% natriumchloride-oplossing, snijd het hart weg door de aorta af te snijden en snijd dwars door ter hoogte van de onderrand van de linker oorschelp. Verkrijg afbeeldingen met behulp van lichtmicroscopie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om succesvolle AR te garanderen, hebben we de regurgitante bloedstroom gevalideerd met behulp van kleurendoppler- en pulsgolf-Doppler-echocardiografie. Bij muizen met AR vertoonde het kleurendopplerspectrum van de aortaboog direct na de operatie regurgitante stroom (rood), die afwezig was bij schijnmuizen (geen stroom in diastole; Figuur 3A). Consequent vertoonde de pulsgolf Doppler een robuust verhoogde regurgitantstroom bij AR-muizen (...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De chirurgische inductie van AR in de muis is een technisch uitdagende, nieuwe techniek, maar heeft een aanzienlijke translationele relevantie. Om de techniek onder de knie te krijgen, moet een chirurg op zijn minst van tevoren bekend zijn met de cervicale en cardiale anatomie van muizen, het hanteren van muizen en echocardiografie. Bekwame bediening bij invasieve hemodynamische metingen is een pluspunt. Voor een succesvolle AR-operatie moet speciale aandacht worden besteed aan verschill...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81941002, 82170389, 82170255, 81730009, 81670228 en 81500191), Laboratory Animal Science Foundation of Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai (201409004300 en 21140904400), Health Science and Technology Project van Shanghai Pudong New Area Health Commission (PW2019A-13) en "Rising Sun" Excellent Young Medical Talents Program van Shanghai East Hospital (2019xrrcjh03).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Koperplaat | JD.com Inc. | Aangepast | 20 X 15 cm of groter is bij voorkeur |
| Gebogen vastbindtang | 66 Vision Tech | 53324A | om spier, weefsel en vaat te rekken en isoleren |
| Verwarmingskussen | JD.com Inc. | Changzhi 55 | warm de koperplaat en muis trouwens |
| Gebogen vastbindtang voor lange handen | MECHENIC | TS-15 | om vaat te rekken |
| Metalen draad (roestvrij staal) | JD.com Inc. | 0,18 mm in diameter | werk met een plastic katheter om aortakleppen te puncteren |
| Naaldhouder | Shanghai Jinzhong | 131110 | naad van huid |
| Kunststof katheter | Anilab software & instrumenten | PE-0402 | werk met een metalen draad om aortakleppen te puncteren |
| Drukkatheter | Millar Instruments | SPR 835 | 1,4F in grootte |
| Drukgegevensverwervingsapparaat en analoog/digitaal converter | AD Instruments | Labchart 5 | verbonden met drukkatheter |
| Schaar | Suzhou Shiqiang | Stronger 13Cr | om huid te snijden |
| Kleine knijpschaar | Shanghai Jinzhong | YBE030 | om vaat te snijden |
| Stereomicroscoop | Olympus Corporation | SMZ845 | voor incisie en intubatie van vaat |
| Rechte vastbindtang | 66 Vision Tech | 53320A | om spier, weefsel en vaat te rekken en isoleren |
| Tergazyme enzymatische detergent | Alconox, Inc. | 13051.0 | Verwijdert eiwitmateriaal, weefsel en bloed uit de katheter |
| Duimtang | Suzhou Shiqiang | 5307B | om huid en spier vast te klemmen en te rekken |
| Ultrasone gel | PARKER | Aquasonic-100 | om ultrasone signaal over te dragen |
| Ultrasone beeldvormingssysteem | VisualSonics | 2100 | omvat B-modus, M-model, kleuren Doppler en pulsgolf Doppler |
| Verdamper | RWD Life Science | R540 | voor anesthesie |
Referenties
- You, J., et al. Differential cardiac hypertrophy and signaling pathways in pressure versus volume overload. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 314 (3), 552-562 (2018).
- Wu, J., et al. Variations in energy metabolism precede alterations in cardiac structure and function in hypertrophic preconditioning. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 602100(2020).
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Pilz, P. M., et al. Large and small animal models of heart failure with reduced ejection fraction. Circulation Research. 130 (12), 1888-1905 (2022).
- Bartelds, B., et al. Differential responses of the right ventricle to abnormal loading conditions in mice: pressure vs. volume load. European Journal of Heart Failure. 13 (12), 1275-1282 (2011).
- Badheka, A. O., et al. Trends of hospitalizations in the United States from 2000 to 2012 of patients >60 Years with aortic valve disease. The American Journal of Cardiology. 116 (1), 132-141 (2015).
- Wu, J., et al. Left ventricular response in the transition from hypertrophy to failure recapitulates distinct roles of Akt, β-arrestin-2, and CaMKII in mice with aortic regurgitation. Annals of Translational Medicine. 8 (5), 219(2020).
- Qi, Y. F. Aortic regurgitation and heart valve disease in mice. Journal of Thoracic Disease. 7 (10), 1676-1677 (2015).
- Zhou, Y. Q., Zhu, S. N., Foster, F. S., Cybulsky, M. I., Henkelman, R. M. Aortic regurgitation dramatically alters the distribution of atherosclerotic lesions and enhances atherogenesis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (6), 1181-1188 (2010).
- Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. Journal of Visualized Experiments. (137), e57621(2018).
- Wu, J., et al. Early estimation of left ventricular systolic pressure and prediction of successful aortic constriction in a mouse model of pressure overload by ultrasound biomicroscopy. Ultrasound in Medicine & Biology. 38 (6), 1030-1039 (2012).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101(2016).
- Toischer, K., et al. Cardiomyocyte proliferation prevents failure in pressure overload but not volume overload. Journal of Clinical Investigation. 127 (12), 4285-4296 (2017).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (7), 708-714 (2002).
- Nakanishi, M., et al. Genetic disruption of angiotensin II type 1a receptor improves long-term survival of mice with chronic severe aortic regurgitation. Circulation Journal. 71 (8), 1310-1316 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
