Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een iSCAT-gebaseerde beeldverwerking en single-particle tracking-benadering die het gelijktijdige onderzoek van de moleculaire massa en het diffusieve gedrag van macromoleculen die interageren met lipidemembranen mogelijk maakt. Stapsgewijze instructies voor monstervoorbereiding, massa-naar-contrastconversie, filmacquisitie en nabewerking worden gegeven naast aanwijzingen om mogelijke valkuilen te voorkomen.

Samenvatting

Kortstondige of voorbijgaande interacties van macromoleculen op en met lipidemembranen, een interface waar een veelheid aan essentiële biologische reacties plaatsvinden, zijn inherent moeilijk te beoordelen met standaard biofysische methoden. De introductie van massagevoelige deeltjestracering (MSPT) vormt een belangrijke stap in de richting van een grondige kwantitatieve karakterisering van dergelijke processen. Technisch werd dit mogelijk gemaakt door de komst van interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT)-gebaseerde massafotometrie (MP). Wanneer de achtergrondverwijderingsstrategie wordt geoptimaliseerd om de tweedimensionale beweging van membraangeassocieerde deeltjes te onthullen, maakt deze techniek de real-time analyse van zowel diffusie als moleculaire massa van niet-gelabelde macromoleculen op biologische membranen mogelijk. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het uitvoeren en analyseren van massagevoelige deeltjestracering van membraangerelateerde systemen. Metingen uitgevoerd op een commerciële massafotometer bereiken een tijdresolutie in het milliseconderegime en, afhankelijk van het MP-systeem, een massadetectielimiet tot 50 kDa. Om het potentieel van MSPT voor de diepgaande analyse van membraangekatalyseerde macromolecuuldynamica in het algemeen te demonstreren, worden resultaten gepresenteerd die zijn verkregen voor voorbeeldige eiwitsystemen zoals de native membraaninter interactor annexine V.

Inleiding

Ooit slechts gezien als een barrière tegen het brede scala van omgevingsfysische omstandigheden, worden biologische membranen tegenwoordig beschouwd als functionele entiteiten en katalytische platforms ^1,2. Op basis van hun vermogen om signalen te lokaliseren, te versterken en te sturen als reactie op membraangeassocieerde macromolecuulreacties, vormen lipide-interfaces een cruciaal element voor een breed scala aan cellulaire processen zoals membraanhandel en signaalcascades ^3,4,5. Als nucleatieplaats voor de assemblage van stabiele complexen is membraanaanhechting vaak afhankelijk van een dynamisch evenwicht tussen membraangeassocieerde en cytosolische vormen van macromoleculen en is daarom van voorbijgaande aard ^6,7.

Ondanks hun grote belang in de biologie, is het tot nu toe een uitdaging geweest om methoden te ontwikkelen die toegang kunnen bieden tot de compositorische, ruimtelijke en temporele heterogeniteiten van membraangeassocieerde macromolecuulreacties in realtime ^7,8. Om de onderliggende moleculaire processen op te lossen, zijn twee experimentele aspecten doorslaggevend: voldoende tijdsresolutie en gevoeligheid voor één deeltje. Daarom hebben ensemblegemiddelde technieken zoals fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP) maar ook de veel gevoeligere fluorescentiescorrelatiespectroscopie (FCS) beperkingen, omdat ze ruimtelijke informatie grotendeels loskoppelen van temporele informatie⁹. Een belangrijke stap in de richting van de karakterisering van individuele molecuuldynamica is dus de komst van single-particle tracking (SPT) in combinatie met zeer gevoelige microscopie. Met name twee SPT-benaderingen zijn in dit opzicht doeltreffend gebleken. Ten eerste maakte het gebruik van fluoroforen als labels en de bijbehorende fluorescentiedetectiesystemen de weg vrij voor nanometerprecisie en milliseconde tijdresolutie 10,11,12. Ten tweede verbeterde op verstrooiing gebaseerde detectie met behulp van gouden nanodeeltjes zowel de lokalisatieprecisie als de tijdresolutie tot het subnanometer- en microsecondebereik, respectievelijk 13,14,15,16. Ondanks de vele voordelen van beide benaderingen en hun belangrijke bijdragen met betrekking tot het mechanistische begrip van membraan-geassocieerde systemen^17,18, zijn beide technieken tot nu toe beperkt: ze vereisen etikettering van de moleculen van belang, wat mogelijk hun oorspronkelijke gedrag verstoort en ongevoelig is voor de moleculaire samenstelling van membraan-geassocieerde deeltjes^19,20.

Beide beperkingen zijn onlangs overwonnen door de introductie van een nieuwe interferometrische verstrooiing (iSCAT)-gebaseerde benadering genaamd massafotometrie (MP)21,22,23. Deze techniek maakt het mogelijk om in-solution massaverdelingen van biomoleculen te bepalen op basis van hun iSCAT-contrast bij het landen op een glasinterface. Voor de detectie en karakterisering van mobiele moleculen die zich verspreiden op lipidemembranen, moest echter een meer geavanceerde beeldanalysebenadering worden ontwikkeld. Dit is inmiddels met succes geïmplementeerd en maakt het mogelijk om de moleculaire massa van enkele ongelabelde biomoleculen die diffunderen op een lipideninterface te detecteren, te volgen en te bepalen^24,25. Aangeduid als dynamische massafotometrie of massagevoelige deeltjestracering (MSPT), maakt deze techniek nu de beoordeling van complexe macromolecuulinteracties mogelijk door veranderingen in de moleculaire massa van de gevolgde entiteiten direct vast te leggen en opent zo nieuwe mogelijkheden voor de mechanistische analyse van membraangeassocieerde moleculaire dynamica.

Hier wordt een gedetailleerd protocol voor monstervoorbereiding, beeldvorming en de gegevensanalysepijplijn gepresenteerd die nodig is voor MSPT. In het bijzonder worden monstervereisten en mogelijke problemen die zich tijdens meting en analyse kunnen voordoen, besproken. Bovendien wordt het ongeëvenaarde potentieel om membraaninteragerende macromolecuulsystemen te analyseren aangetoond door middel van verschillende representatieve resultaten.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Generatie van multilamellaire blaasjes (MLV's)
   1. Bereken de hoeveelheid chloroform-opgeloste lipide(s) volgens het gewenste lipidenmengsel en het vereiste suspensievolume.
      OPMERKING: Een uiteindelijke blaasjesconcentratie van 4 mg/ml lipiden wordt aanbevolen voor de resuspensie (reactie) buffer.
   2. Pipetteer het berekende volume lipiden in een glazen injectieflacon van 1,5 ml met behulp van verdringerpipetjes uitgerust met glazen uiteinden.
   3. Verdamp het lipide-oplosmiddel onder een zwakke stroom stikstof en draai de injectieflacon constant om een gelijke verdeling van de lipiden op de glazen wanden te garanderen.
   4. Zorg voor volledige oplosmiddelverdamping door de injectieflacon gedurende 15 minuten onder een gestage stroom stikstof te plaatsen.
   5. Verwijder resterende sporen van chloroform door vacuüm te drogen in een vacuümsiccator gedurende een extra uur.
   6. Rehydrateer het lipidenmengsel in de gewenste resuspensie (reactie) buffer en vortex de suspensie grondig totdat de lipidefilm is opgelost uit de wanden van de injectieflacon.
      OPMERKING: De reactiebuffer moet zorgen voor eiwitactiviteit en stabiliteit. De reactiebuffer die in deze studie wordt gebruikt, bevat 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 150 mM KCl en 5 mM MgCl₂. Merk op dat elke buffer die wordt gebruikt om lipiden of eiwitten te verdunnen, moet worden gefilterd om storende deeltjesverontreinigingen te verwijderen (zie stap 5).
2. Generatie van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's)
   1. Kook voor opeenvolgende vries-dooicycli van de lipide resuspensie (stap 1.1.6) 500 ml water in een bekerglas op een hete plaat (tussen 70 °C en 99 °C) en bereid een recipiënt met vloeibare stikstof.
   2. Shock-freeze de lipide resuspensie in de vloeibare stikstof. Breng de injectieflacon met heet water over in het bekerglas totdat de oplossing volledig is ontdooid. Herhaal deze vries-dooicyclus 8-10 keer of totdat het eerder troebele mengsel helder lijkt.
      LET OP: Gebruik de juiste veiligheidskleding en uitrusting zoals een bril, handschoenen en pincet om direct contact met de vloeibare stikstof, de bevroren lipidenflacon of het kokende water te voorkomen.
   3. Voor het genereren van een monodisperse blaasjesverdeling, monteer een lipide-extruder en test de integriteit ervan met reactiebuffer om ervoor te zorgen dat deze niet lekt.
      OPMERKING: Als lekkage wordt waargenomen, monteer de lipide-extruder dan zorgvuldig opnieuw totdat er geen buffer morsen zichtbaar is.
   4. Extrudeer de lipidensuspensie gedurende 37 passages door een nucleoporemembraan met een poriegrootte van 50 nm²⁶. Het aantal passen moet ongelijk zijn om ervoor te zorgen dat het uiteindelijke SUV-mengsel het nucleopore-membraan passeert en dus vrij is van lipideaggregaten of multilamellaire blaasjes. De geëxtrudeerde blaasjes zullen later worden gebruikt om ondersteunde lipide bilayers te vormen (zie stap 6 en 7).
      OPMERKING: SUV's kunnen ook worden gevormd door ultrasoonapparaat van het gerehydrateerde lipidenmengsel. Voorbereiding via extrusie zorgt echter voor een meer monodisperse verdeling van SUV's, wat het scheuren van de blaasjes vergemakkelijkt tijdens de vorming van ondersteunde lipide bilayer. Geëxtrudeerde blaasjes kunnen maximaal 3 dagen in de koelkast worden bewaard.

2. Reiniging van microscoopglaasjes

1. Verdeel een gelijk aantal microscoopglaasjes (nr. #1.5; 0,17 mm dikte) met afmetingen van 24 mm x 60 mm en 24 mm x 24 mm in polytetrafluorethyleen (PTFE) microscoophouders.
2. Breng PTFE-houders over in bekers die ultrapuur water bevatten en soniceer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Afhankelijk van het bekerglas moet het watervolume worden aangepast om de PTFE-houder volledig te bedekken.
3. Gebruik een pincet om de houders uit het bekerglas te verwijderen en vervang het water door ultrapuur isopropanol. Steek de houder in het bekerglas dat isopropanol bevat en soniceer opnieuw gedurende 15 minuten.
   OPMERKING: Afhankelijk van het bekerglas moet het volume van het isopropanol worden aangepast om de PTFE-houder volledig te bedekken.
4. Vervang isopropanol door ultrapuur water en soniceer het bekerglas met de houders gedurende 15 minuten.
5. Verwijder de PTFE-houders uit de bekers en föhn de microscoopglaasjes in de houder onder een gestage stroom stikstofgas of perslucht.
   OPMERKING: Zorg voor een goede reiniging van de afdekglijbanen door handschoenen, schone bekers en paraffinefilm te gebruiken om elk bekerglas te bedekken. Anders kan reststof aanzienlijke achtergrondschommelingen veroorzaken tijdens MSPT-metingen.

3. Hydrofilisatie van microscoopglaasjes

OPMERKING: Om een homogene en door vloeistof ondersteunde lipide bilayer te verkrijgen, is hydrofilisatie van dia's essentieel en moet deze worden uitgevoerd vlak voordat de stroomkamer wordt gemonteerd.

1. Plaats PTFE-houders met slechts 24 mm x 60 mm microscoopglaasjes in een plasmareiniger met zuurstof als procesgas en reinig de microscoopglaasjes met plasma (parameters die in dit werk worden gebruikt: 30% vermogen, 0,3 mbar zuurstofdruk gedurende 30 s; zie Materialentabel voor details van de gebruikte plasmareiniger).
   OPMERKING: Om vloeistofmembranen te verkrijgen, moeten plasmareinigingsparameters zoals vermogen, zuurstofdruk en reinigingstijd voor elk instrument worden aangepast. Voor dit doel wordt het gebruik van fluorescerend gelabelde lipiden aanbevolen om de vloeibaarheid van het membraan te garanderen, die kan worden gekwantificeerd met fluorescentieherstel na experimenten met fotobleaching (FRAP)²⁷. Als de parameters niet zijn geoptimaliseerd voor de betreffende opstelling, kan de membraandiffusie worden aangetast als gevolg van verminderde membraanfluïditeit.

4. Montage van stroomkamers

1. Houd voor de montage van de stroomkamer de volgende componenten gereed: gereinigde microscoopglaasjes (24 mm x 24 mm), hydrofiliseerde microscoopglaasjes (24 mm x 60 mm), aluminiumfolie, vlak karton, scalpel en dubbelzijdige tape.
2. Wikkel het platte karton in met aluminiumfolie.
3. Verdeel de gereinigde 24 mm x 24 mm microscoopglaasjes op de aluminiumfolie met voldoende afstand van elkaar.
4. Bevestig dubbelzijdige tapestroken aan de boven- en onderranden van de dia's.
5. Snijd elke microscoopglaasjes met het scalpel, zodat deze uit de aluminiumfolie kunnen worden verwijderd. Als gevolg hiervan moet elke dia strepen dubbelzijdige tape hebben die aan de boven- en onderrand van de dia zijn bevestigd (zie figuur 1).
6. Bevestig de glijbaan van 24 mm x 24 mm met de twee dubbelzijdige tapestrips aan de gehydrofiliseerde glijbaan van 24 mm x 60 mm om een stroompad te vormen tussen de kleinere en grotere microscoopglaasjes.
   OPMERKING: Om schone stroomkamers te garanderen, moet u constant handschoenen dragen en ervoor zorgen dat de werkbank stofvrij is.

5. Filtratie van reactiebuffers

1. Steriel filter alle reactiebuffers door 0,45 μm celluloseacetaatmembranen om een minimaal achtergrondsignaal te garanderen tijdens MSPT-metingen.
   OPMERKING: Als de aanwezigheid van nucleotiden, zoals ATP, essentieel is voor een succesvol experiment, moet u zich bewust zijn van een mogelijke toename van het achtergrondsignaal. Het wordt aanbevolen om slechts minimale hoeveelheden te gebruiken die nog steeds zorgen voor eiwitactiviteit.

6. Ondersteunde lipide bilayer (SLB) vorming

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de vorming van ondersteunde lipide bilayers op de massafotometer uit te voeren om visueel te zorgen voor een succesvolle verspreiding van blaasjes en de volledige verwijdering van niet-toegediende blaasjes.

1. Verdun vers geëxtrudeerde SUV's (zie stap 1 voor meer details) tot een eindconcentratie van 0,4 mg/ml in de vereiste reactiebuffer. Voeg eventueel, om het breken van het blaasje te bevorderen, 2 mM CaCl₂ toe aan de suspensie van het blaasje.
   OPMERKING: Divalente kationen kunnen de aggregatie van sommige lipiden zoals PiP₂ veroorzaken. Voor mengsels die dergelijke lipiden bevatten, mag caCl₂ niet worden gebruikt ter bevordering van blaasbreuk of andere divalente kationen in de resuspensiebuffer. Indien nodig voor het experiment kunnen divalente kationen worden toegevoegd na de succesvolle vorming van de ondersteunde lipide bilayer.
2. Spoel 50 μL van de vesikelsuspensie in de stroomkamer (stap 4) en incubeer de kamer gedurende 2 minuten.
   OPMERKING: Buffers, blaasjes of eiwitoplossingen kunnen door de stroomkamer worden gespoeld met een klein stukje weekweefsel. Het is echter ook mogelijk om een mechanisch pompsysteem te gebruiken.
3. Verwijder niet-toegediende blaasjes door de stroomkamer herhaaldelijk (ten minste drie keer) te wassen met telkens 200 μL van de reactiebuffer.
   OPMERKING: Blaasjes moeten grondig uit de stroomkamer worden gewassen om een stabiel achtergrondsignaal te garanderen tijdens MSPT-metingen.

7. Genereren van kalibratiecurve

OPMERKING: Om het contrast van gedetecteerde deeltjes om te zetten in moleculaire massa, moet hun signaal worden gekalibreerd met behulp van eiwitten van bekende grootte. Het wordt aanbevolen om het standaard eiwitgrootteregime aan te passen om het bereik van moleculaire massa's te dekken dat wordt verwacht voor het systeem van belang.

1. Biotinylering van standaardeiwitten met een cysteïneresidu
   1. Bereken de juiste hoeveelheid maleimide-biotine voor het standaardeiwit volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Incubeer het standaardeiwit met het bepaalde volume maleimide-biotine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   3. Om ongeconjugeerde maleimide-biotine uit het geconjugeerde biotine-eiwitcomplex te verwijderen, voert u grootte-uitsluitingschromatografie uit op een kolom die geschikt is voor het eiwit van belang.
   4. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford Assay.
      OPMERKING: Om het standaardeiwit op te slaan voor verdere metingen, vriest u het eiwit in aliquots voor eenmalig gebruik in vloeibare stikstof en bewaart u ze bij -80 °C.
2. Meting van standaardeiwitten voor de kalibratiecurve
   1. Bereid in een stroomkamer een ondersteunde lipide bilayer met 0,4 mg/ml geëxtrudeerde SUV's (zie stappen 1 en 6 voor meer details) met 0,01 mol% (v/v) Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-cap biotinyl).
   2. Voeg 50 μL 2,5 nM tweewaardige streptavidin toe aan de dubbellaag in de stroomkamer en incubeer gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: Divalent streptavidin is uitgedrukt en gezuiverd zoals beschreven in Howarth et ^al.28. Tetravalent streptavidin kan ook worden gebruikt. Het gebruik van tweewaardige streptavidin kan echter de mogelijke reactie stoichiometrieën verminderen tussen gebiotinyleerde lipiden en standaardeiwitten die worden geconjugeerd aan een biotinegroep om de toewijzing van soorten te vergemakkelijken.
   3. Verwijder ongebonden divalente streptavidin met 100 μL reactiebuffer.
   4. Voeg 50 μL 100 nM biotine-geconjugeerd standaardeiwit toe aan de dubbellaag in de stroomkamer en incubeer gedurende 2 minuten.
      OPMERKING: Afhankelijk van de biotinylatie-efficiëntie en of di- of tetravalent streptavidin wordt gebruikt, kunnen de optimale concentraties van biotine-geconjugeerd standaardeiwit en streptavidin variëren.
   5. Voer MSPT-metingen uit volgens de details die in stap 8 worden beschreven.
      LET OP: De beeldvormingsomstandigheden moeten identiek zijn voor zowel monster- als kalibratiestandaarden.

8. Beeldvorming

1. SLB-vorming en monstervoorbereiding
   1. Zoals in meer detail beschreven in stap 6, introduceert u SUV's van het gewenste lipidenmengsel (25 μL) in de monsterstroomkamer en vormt u een ondersteunde lipide bilayer. Was de kamer grondig (drie keer) met 100 μL reactiebuffer om alle niet-toegediende blaasjes te verwijderen.
   2. Voeg 50 μL van het betreffende eiwit toe aan de monsterkamer.
      OPMERKING: Aangezien MSPT een methode met één deeltje is, moet de eiwitconcentratie binnen het pM- tot nM-bereik worden gehouden om ongestoorde deeltjesdetectie en -tracking mogelijk te maken.
2. Video acquisitie
   1. Stel de gewenste beeldcondities in, zoals de grootte van het gezichtsveld (FOV), framesnelheid, belichtingstijd en acquisitietijd in de acquisitiesoftware.
      OPMERKING: De volgende instellingen hebben bewezen te werken voor MSPT op een commerciële massafotometer (zie Tabel met materialen): FOV van 128 pixels x 35 pixels, een framesnelheid van 1 kHz, wat resulteert in ongeveer 200 frames per seconde na daaropvolgende 5-voudige framegemiddelde en een belichtingstijd van 0,95 ms.
   2. Pas de scherpstelling automatisch of handmatig aan. Verplaats indien nodig de FOV naar een positie met een homogeen membraan met behulp van de laterale controle.
   3. Maak een projectmap en begin met het opnemen van de film. Geef na voltooiing van de opname een bestandsnaam op in het dialoogvenster dat wordt gevraagd door de acquisitiesoftware. De film wordt vervolgens automatisch opgeslagen in de projectmap als een MP-bestand voor latere analyse.
      OPMERKING: Noteer ten minste drie replicaties in verschillende stroomkamers om de integriteit van individuele membranen en reproduceerbaarheid van de resultaten te waarborgen. De duur van de film kan van tevoren worden ingesteld en is afhankelijk van het type experiment. In de meeste gevallen wordt een acquisitietijd tussen 5 min en 7 min aanbevolen.
      LET OP: Standaard worden filmopnamen op de commerciële massafotometeracquisitiesoftware gecomprimeerd voordat ze worden opgeslagen om opslagruimte te verminderen. Bestandscompressie moet echter worden uitgeschakeld om aangepaste gegevensanalyse mogelijk te maken, zoals beschreven in dit protocol. Details over het uitschakelen van bestandscompressie zijn te vinden in de gebruikershandleiding van de fabrikant.

9. Data-analyse

OPMERKING: De pijplijn voor gegevensanalyse wordt vergezeld door twee interactieve Jupyter-notebooks (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb). De Jupyter-notebooks en bijbehorende op maat geschreven Python-modules die nodig zijn om de mspt-analyse uit te voeren die hieronder wordt beschreven, zijn beschikbaar in een openbare opslagplaats: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. Voor gedetailleerde instructies over de onderstaande analyse worden lezers verwezen naar MSPT analysis.ipynb die toegankelijk is via de bovenstaande link.

1. Videoverwerking
   1. Verwijder dominante statische verstrooiing van licht met het pixelgewijze achtergrondschattingsalgoritme met behulp van de image_processing.mp_reader-functie .
      1. Als u de achtergrondverwijdering wilt toepassen, kiest u de optie continuous_median voor de parametermodus en stelt u een geschikte lengte in voor het schuifmediaanvenster (window_length) in notebooksectie B.1. Sla de films desgewenst op na verwijdering op de achtergrond om te worden gebruikt voor deeltjesdetectie en trajectkoppeling (door de parameter save_processed_movies in te stellen op Waar).
         OPMERKING: Pas de venstergrootte (window_length) aan op waarden tussen 101 en 2001, afhankelijk van de deeltjesdichtheid op het membraan, de verwachte diffusiecoëfficiënt, de acquisitieframesnelheid en de vereiste verwerkingssnelheid.
         LET OP: De achtergrondverwijderingsstrategie werkt goed als het membraan niet te dicht opeengepakt is en als de diffusie van de deeltjes voldoende snel is (d.w.z. elke pixel is meestal niet bezig met een deeltje). Anders wordt het contrast van de deeltjes systematisch onderschat omdat ze niet goed te onderscheiden zijn van het achtergrondsignaal. Dit kan worden gecompenseerd door de mediane venstergrootte te vergroten ten koste van de rekensnelheid. Houd er echter rekening mee dat het instellen van de venstergrootte te groot de uitvoer negatief kan beïnvloeden als gevolg van steekproefdrift. Een visuele inspectie van de verwerkte video's is cruciaal.
   2. Detecteer deeltjes en hun respectieve positie in de film met behulp van de functie particle_fitting.particle_fitter (zie notitieboeksectie B.2).
      1. Stem de gevoeligheid van deeltjesdetectie af met de drempelparameter (dorsen; zie notebooksectie B.1), die wordt gebruikt om kandidaat-plekken te markeren door middel van afbeeldings binarisatie. Het effect van verschillende drempelparameters op de detectiegevoeligheid ter plaatse kan worden onderzocht in een apart notitieboek (Movie visualization.ipynb). De resultaten van deeltjesdetectie worden automatisch opgeslagen in CSV-bestanden in een submap van het filmbestand.
         OPMERKING: Het willekeurig laag instellen van de drempelwaarde (bijvoorbeeld voor films die met de gebruikte massafotometer zijn gemaakt, wordt een drempelparameter onder 0,0005) niet aanbevolen omdat kandidaat-spots worden gedomineerd door valse ruis en dus de verwerkingstijd verlengen.
2. Koppel deeltjes in opeenvolgende frames aan trajecten met behulp van het Python-pakket trackpy (v.0.5.0)²⁹.
   OPMERKING: De trajectkoppeling wordt on the fly uitgevoerd na spotdetectie. Als gevolg hiervan wordt een extra CSV-bestand met de trajectinformatie opgeslagen in een submap van het CSV-bestand voor deeltjesdetectie.
   1. Verwijder trajecten met te weinig punten met behulp van de parameter minimum_trajectory_length (zie notitiebloksectie B.1) om een robuuste bepaling van diffusiecoëfficiënten mogelijk te maken. Voor gedetailleerde uitleg over de andere parameters van trackpy-functies , raadpleegt u de documentatie van trackpy .
3. Trajectanalyse
   1. Geef in notebooksectie C.1 de framesnelheid (frame_rate) en pixelgrootte in nm (pixel_size) op, die werden gebruikt voor filmacquisitie. Maak een lijst met CSV-bestanden met de trajectinformatie die door trackpy wordt geretourneerd (zie stap 9.2) met de functie trajectory_analysis.get_csv_files (notebooksectie C.2).
   2. Geef bovendien een uitvoerbestandsnaam op voor de HDF5-container, die wordt gebruikt om de aanpassingsresultaten op schijf op te slaan (notebooksectie C.3). Analyseer alle trajecten met de functie trajectory_analysis.fit_trajectories in notebooksectie C.4, die door de lijst met CSV-bestanden wordt herhaald. Deze functie maakt gebruik van sprongafstandsverdeling (JDD)³⁰ en gemiddelde kwadraatverplaatsing (MSD)^31-analyse om de diffusiecoëfficiënt van elk traject te schatten.
   3. Zet het mediane contrast van elk traject om in de overeenkomstige massa met behulp van de contrast-massarelatie verkregen uit de MSPT-kalibratie (zie rubriek 7). Geef de helling (helling) en y-intercept (offset) van de kalibratielijn op, die het iSCAT-contrast relateert aan de molecuulmassa (functie trajectory_analysis.apply_calibration; zie notitiebloksectie C.5). Deze functie voegt een kolom met de mediane massa van het traject toe aan elk gegevensframe.
   4. Evalueer de schijnbare deeltjesdichtheid op het membraan met de functie trajectory_analysis.membrane_density, die de mediane dichtheidswaarde retourneert in termen van gedetecteerde deeltjes en aanwezige trajecten tijdens elk frame (zie notebooksectie C.6) als extra kolommen in het gegevensframe.
      OPMERKING: Omdat een deel van de deeltjes verloren gaat tijdens zowel het detectie- als het trajectkoppelingsproces, kunnen de werkelijke deeltjesdichtheden hoger zijn. Voor betrouwbare resultaten met betrekking tot deeltjesdichtheden en massahistogrammen, inspecteer visueel representatieve filmmomentopnamen om te controleren of de meetomstandigheden plausibel zijn voor het volgen van één deeltje (zie stap 9.1.1).

10. Datavisualisatie

1. Illustreer de correlatie van massa en diffusiecoëfficiënt met tweedimensionale kerneldichtheidsschatting (KDE), die is gebaseerd op het Python-pakket fastkde (v.1.0.19; https://pypi.org/project/fastkde/).
2. Als u de plot wilt genereren, geeft u het HDF5-bestand op met de MSPT-resultaten (zie stap 9.3.2 en notebooksectie D.1) en selecteert u één (notebooksectie D.2) of een aaneengeschakeld gegevensframe (notebooksectie D.3) als invoergegevens voor de plotting.generate_2D_KDE functie (notebooksectie D.4).
   OPMERKING: Elke uitgezette dataset moet idealiter meer dan 1.000 trajecten bevatten voor een betrouwbare 2D-KDE.

Resultaten

Volgens het gedetailleerde protocol hierin voor de bereiding van ondersteunde lipide bilayers (SLB's) in stroomkamers (figuur 1), kan men duidelijk een spikkelachtig patroon herkennen in de oorspronkelijke weergave van alle weergegeven omstandigheden (figuur 2). Dit effect wordt veroorzaakt door de oppervlakteruwheid van het glas, die over het algemeen het verstrooiingssignaal domineert en leidt tot visueel niet van elkaar te onderscheiden omstandigheden (glas, glas met SLB of glas met SLB en aangehechte eiwitten). De aanwezigheid van blaasjes is echter duidelijk te onderscheiden door de grote verstrooiingsdoorsnede van de blaasjes en maakt de waarneming van blaasjesruptuur en fusie tot homogene membranen mogelijk (figuur 2B en aanvullende film 1). Bij het verwijderen van het statische verstrooiingssignaal van het glasoppervlak met een ratiometrische benadering die de dynamische elementen binnen het gezichtsveld^{benadrukt 24,25}, kan men ongelabelde eiwitten ontdekken die zich op het membraan verspreiden (figuur 2D) terwijl een lege SLB (figuur 2C) of glas zelf (figuur 2A) verschijnt als een luidruchtig beeld.

De inherente achtergrond van MSPT-metingen kan lokaal worden geschat door elke pixelwaarde te delen door de mediaan van n voorafgaande en volgende pixels van de film op dezelfde beeldpositie (figuur 3). Als gevolg hiervan verschijnen macromoleculen als isotrope puntspreidingsfuncties (PSF's) waarvan de beweging op het membraan kan worden waargenomen, gevolgd en gekwantificeerd. In feite maakt de beschikbaarheid van zowel contrast als dynamisch gedrag de directe relatie van de moleculaire grootte van een deeltje met zijn respectieve diffusieve gedrag mogelijk, allemaal zonder de noodzaak om het deeltje te labelen. Om het iSCAT-contrast te interpreteren dat tijdens MSPT-experimenten is bepaald, is het echter essentieel om een kalibratie uit te voeren die de signaalamplitude vertaalt in moleculaire massa. Dit kan worden bereikt door biomoleculen van bekende massa aan een SLB te hechten via een biotine-streptavidin-biotinecomplex (figuur 4A). Als voorbeeldige strategie kan men gebiotinyleerde varianten van runderserumalbumine (BSA), eiwit A (prA), alkalische fosfatase (AP) en fibronectine (FN) gebruiken, die binden aan streptavidin (STP) dat zelf gebonden is aan biotinebevattende lipiden (Biotinyl Cap PE) in het membraan. Zoals weergegeven in figuur 4A, weerspiegelt het steeds duidelijker wordende contrast van deze voorbeeldige macromoleculen het toenemende molecuulgewicht van de respectieve gebiotinyleerde normen. Door elke piek van de contrasthistogrammen (figuur 4B) toe te wijzen aan de overeenkomstige massa van de oligomeertoestand van het standaardeiwit, wordt een lineair verband tussen contrast en massa^{onthuld 21,22} en kan vervolgens worden gebruikt voor de analyse van onbekende macromolecuulsystemen (figuur 4C).

Een goed voorbeeld dat de toepasbaarheid en mogelijkheden van MSPT aantoont om molecuulgewichten te analyseren en dus oligomeertoestanden en oligomerisatiegebeurtenissen te bestuderen, is de overweging van gebiotinyleerd aldolase en gebiotinyleerd IgG (figuur 5). Aldolase wordt vaak gemeld als een homotetrameer³². De massaverdeling die door MSPT wordt opgelost, heeft echter vier verschillende pieken, wat de aanwezigheid van meerdere populaties benadrukt (figuur 5A). Terwijl de eerste kleine piek overeenkomt met onbezette streptavidin en kan worden verwacht vanwege de configuratie in dit soort experimenten, kunnen aldolasecomplexen met slechts twee subeenheden (2SU) of zes subeenheden (6SU) ook worden gedetecteerd (figuur 5B). Interessant is dat tetra- en hexamere aldolase-streptavidin-complexen een verminderde diffusiecoëfficiënt vertonen in vergelijking met dimerische aldolase en streptavidin alleen, wat wijst op een verhoogde viskeuze weerstand, bijvoorbeeld via de aanhechting van een tweede gebiotinyleerd lipide aan de streptavidin. Evenzo vertoont gebiotinyleerd IgG drie pieken in de massaverdeling, waarbij de eerste piek weer overeenkomt met de massa van een enkele streptavidin. De massa van de meest voorkomende piek komt overeen met de massa van één lichte en één zware keten (1SU), d.w.z. de helft van een IgG-antilichaam. Het volledige antilichaam met twee identieke helften (2SU) wordt in ongeveer 11% van de gevallen gedetecteerd. De afname van de diffusiecoëfficiënt met toenemende complexe afmetingen duidt op interacties van de streptavidin met meer dan één gebiotinyleerd lipide of extra weerstand veroorzaakt door het bijgevoegde IgG, of beide.

Naast de enige analyse van membraanafhankelijke oligomeertoestanden, verleent MSPT ook het bijzondere voordeel van het correleren van het diffusieve gedrag van een macromolecuul van belang met zijn oligomeertoestand. Representatieve resultaten voor dit type analyse worden getoond voor annexine V (AnV) en choleratoxine subeenheid B (CTxB), die binden aan respectievelijk dioleoylfosfatidylserine (DOPS) of glycosphingolipiden (GM1), opgenomen in het membraan (figuur 6A). Beide kerneldichtheidsschattingen (KDE's) hebben unimodale verdelingen van massa en diffusie, wat wijst op een enkele overvloedige soort met vergelijkbaar diffusief gedrag. De piekpositie van moleculaire massa en diffusiecoëfficiënt bleek respectievelijk 49,8 ± 2,2 kDa en 1,4 ± 0,1 μm²/s te zijn voor AnV en 62,7 ± respectievelijk 3,1 kDa en 0,4 ± 0,1 μm²/s voor CTxB. De gemeten diffusiecoëfficiënten zijn vergelijkbaar met eerder gerapporteerde waarden verkregen uit high-speed AFM en FRAP ^33,34. De licht gereduceerde massa in vergelijking met de massa van het verwachte macromolecuul (52 kDa voor een AnV-trimer, 65 kDa voor een CTxB pentameer) kan wijzen op de aanwezigheid van kleinere complexen met minder subeenheden in het ensemble. Hoewel het massaverschil tussen de eiwitten klein is en dicht bij de gespecificeerde detectiegrens van de microscoop ligt (≈50 kDa), verschillen hun diffusiecoëfficiënten aanzienlijk. In een equimolair mengsel, bijvoorbeeld door de diffusie van het mengsel te vergelijken met de verdeling van AnV en CTxB alleen, kan men concluderen dat AnV overvloediger aanwezig is op het membraan dan CTxB (figuur 6B). Als de concentratie van CTxB echter wordt verdubbeld in vergelijking met de concentratie van AnV, wordt het evenwicht verschoven naar CTxB als het overheersende eiwit op het membraan. Zoals geïllustreerd voor mengsels van AnV en CTxB, maakt MSPT het niet alleen mogelijk om membraangeassocieerde macromoleculen te onderscheiden op basis van hun molecuulgewicht, maar maakt het ook de discriminatie van verschillende macromolecuulpopulaties mogelijk op basis van hun diffusiegedrag.

Zoals bij alle microscopietechnieken zijn enkele experimentele vereisten cruciaal om de gewenste kwaliteit van gegevens te bereiken. Een belangrijk voorbeeld in dit verband zijn grondig gereinigde coverslips. Over het algemeen wordt dit beschouwd als een voorwaarde voor microscopie-gerelateerde experimenten met één molecuul, maar MSPT is bijzonder gevoelig voor onzuiverheden in het monster. De verhoogde verstrooiing afkomstig van het glasoppervlak van ongereinigde coverslips verhindert elke kwantitatieve iSCAT-meting. Met name kan zelfs achtergebleven vuil of stofdeeltjes op onvoldoende gereinigd glas opmerkelijke beeldvervormingen veroorzaken, herkenbaar als heldere vlekken in de oorspronkelijke beeldvormingsmodus (figuur 7A). Hoewel deze defecten worden verwijderd door de achtergrondschatting vanwege hun statische aard, kan een nauwkeurige bepaling van het contrast van een deeltje worden aangetast en dus de kwantitatieve analyse negatief beïnvloeden. Een ander veel voorkomend probleem in MSPT-experimenten zijn de resterende blaasjes die ofwel zweven (omringd in oranje) door het gezichtsveld of niet-toegediende blaasjes die vastzitten (omcirkeld in blauw) op een specifieke positie op het membraan en verschijnen als grote pulserende verstrooiers (figuur 7B). Om hun voorkomen en interferentie met filmacquisitie te minimaliseren, wordt aanbevolen om de SLB grondig te wassen voordat het eiwit wordt toegevoegd en om vers bereide mengsels van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) en tweewaardige kationen te gebruiken.

Een factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van massagevoelige deeltjesvolgexperimenten is de dichtheid van macromoleculen die verband houden met de membraaninterface. Hoge deeltjesdichtheden op het membraan kunnen in feite om twee redenen problemen veroorzaken: i) Het koppelen van deeltjesdetecties van opeenvolgende frames in trajecten wordt dubbelzinnig en verhoogt daarom de kans op fouten en verkeerd ingeschat diffusiecoëfficiënten. ii) De massa deeltjes, die wordt geëxtraheerd uit de amplitude van hun overeenkomstige PSF-fit, wordt systematisch onderschat en massapieken worden groter omdat de scheiding van het statische achtergrondsignaal van het dynamische deeltjessignaal steeds moeilijker wordt (figuur 7C). Momenteel is visuele beoordeling van de gegevenskwaliteit in het proces van het verwerven van MSPT-video's moeilijk op de beschikbare commerciële microscopen omdat de geïmplementeerde ratiometrische weergave in de acquisitiesoftware de achtergrondverwijdering gebruikt die is vastgesteld voor massafotometrie²¹ in plaats van het op medianen gebaseerde algoritme dat hier en in referenties^24,25 wordt beschreven (figuur 7D ). De op gemiddelde gebaseerde continue achtergrondverwijdering die wordt gebruikt om landingsmoleculen in massafotometrie te visualiseren, zorgt ervoor dat diffuserende deeltjes verschijnen als donkere fronten met heldere staarten, waardoor de vlekken zeer anisotroop lijken en de PSF-aanpassing tijdens de detectieprocedure verstoort. Het gebruik van de geïmplementeerde mean-based beeldverwerking in de acquisitiesoftware is dus ongeschikt voor de analyse van diffuserende biomoleculen op membranen.

Figuur 1: Processtroomdiagram van de afzonderlijke stappen die nodig zijn om eiwit-membraaninteracties te analyseren met massagevoelige deeltjestracering (MSPT). Om monsters voor te bereiden op MSPT-metingen, moeten glasdekplaten grondig worden gereinigd en geactiveerd met een zuurstofplasma. Na hun assemblage in monsterstroomkamers worden kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) voorbereid op ondersteunde lipide bilayer (SLB) vorming en worden alle reactiebuffers gefilterd om achtergrondverstrooiing te verminderen. SUV's worden toegevoegd om lipide bilayers te vormen in de stroomkamers. Optioneel kunnen tweewaardige kationen zoals Ca²⁺ ionen aan de SUV's worden toegevoegd om vesikelruptuur te bevorderen. Ten slotte worden lage concentraties van het eiwit van belang in de reactiekamer gespoeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Native en ratiometrische weergave van voorbeeldige oppervlakken die relevant zijn voor MSPT-metingen. Representatieve beelden van de oppervlakteruwheid van een glasdekplaat (A), tijdens de vorming van een ondersteunde lipide bilayer (B), met een intacte ondersteunde lipide bilayer (C) en van voorbeeldige eiwitten gereconstitueerd op een SLB (D). Alle vier de voorbeelden worden weergegeven in de native modus, die toegankelijk is tijdens de meting zelf, en als verwerkte ratiometrische afbeeldingen na mediane achtergrondverwijdering. Schaalbalken vertegenwoordigen 1 μm. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter-notitieboek; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Stapsgewijs diagram van de fasen die nodig zijn voor mspt-gegevensverzameling en -analyse. Na gegevensverzameling voor het interessante monster op de massafotometer worden films verwerkt om de statische achtergrond te verwijderen via een pixelgewijze glijdende mediane benadering. Daarna worden kandidaatdeeltjes geïdentificeerd en aangepast door een puntspreidingsfunctie (PSF) voordat ze worden gekoppeld aan deeltjestrajecten. Om de bepaling van de diffusiecoëfficiënt voor elk deeltje mogelijk te maken, wordt een gemiddelde kwadraatverplaatsingsanalyse (MSD) of sprongafstandsverdeling (JDD) gebruikt. In dit stadium kunnen contrastwaarden worden omgezet in moleculaire massa's volgens de contrast-massa-relatie bepaald door de kalibratiestrategie. Als laatste stap kunnen trajecten worden gefilterd op basis van hun lengte of membraandeeltjesdichtheid en worden gevisualiseerd door tweedimensionale kerneldichtheidsschatting (2D-KDE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kalibratie van de massa-contrastrelatie voor MSPT-metingen. (A) Representatieve ratiometrische frames verkregen voor voorbeeldige streptavidin-standaard eiwitcomplexen die diffunderen op een ondersteunde lipide bilaag die een klein percentage gebiotinyleerde lipiden bevat (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE ratio van 70:29,99:0,01 mol%). Als modelmoleculaire gewichtsnormen worden monovalent streptavidin²⁸ (alleen STP) of divalent streptavidin²⁸ in complex met gebiotinyleerd runderserumalbumine (BSA), gebiotinyleerd eiwit A (prA), gebiotinyleerd alkalisch fosfatase (AP) of gebiotinyleerd fibronectine (FN) getoond. Kandidaatvlekken worden oranje gemarkeerd (onderbroken cirkels) en succesvolle deeltjesdetecties worden rood gemarkeerd (effen cirkels). De maatstaven vertegenwoordigen 1 μm. (B) Waarschijnlijkheidsdichtheidsverdelingen van contrastwaarden verkregen voor de vijf modelstandaardeiwitten. Alle weergegeven gegevens vertegenwoordigen gepoolde verdelingen van drie onafhankelijke experimenten per voorwaarde: STP alleen n = 82.719; BSA n = 9.034; prA n = 22.204; AP n = 69.065 en FN n = 71.759 trajecten. In vergelijking met deeltjesaantallen bepaald voor membranen met eiwitten, is het aantal deeltjes dat op een lege dubbellaag wordt gedetecteerd verwaarloosbaar bij matige membraandichtheden (aanvullende figuur 1). Contrastpieken die in aanmerking worden genomen voor massakalibratie worden gemarkeerd door ononderbroken lijnen, terwijl onderbroken pieken oligomeertoestanden vertegenwoordigen die niet in aanmerking worden genomen. (C) Contrast-tot-massakalibratiecurve afgeleid van piekcontrasten in paneel D en de respectieve sequentiemassa's van de complexen. Foutbalken geven de standaardfout weer van de pieklocaties die worden geschat door bootstrapping (100 resamples met elk 1.000 trajecten). Voor data-analyse (zie Jupyter notebook; stap 9) zijn de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 7 frames (alleen STP), 9 frames (BSA/FN), 15 frames (prA), 10 frames (AP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Ontcijfering van oligomeertoestanden van membraangeassocieerde eiwitten. (A) Schattingen van de 2D-kerneldichtheid van zowel massa- als diffusiecoëfficiënt van tetravalent streptavidin in complex met gebiotinyleerd aldolase (linkerpaneel) of met een biotine-gemodificeerd geiten-anti-Konijn IgG-antilichaam (rechterpaneel). Reconstitutie van beide complexen is uitgevoerd op een ondersteunde lipide bilayer met DOPC, DOPG en Biotinyl Cap PE in een verhouding van respectievelijk 70:29,99:0,01 mol%. In totaal zijn 116.787 trajecten van drie onafhankelijke replicaties opgenomen voor het streptavidin-aldolasecomplex (deeltjesdichtheid van 0,1 ^μm-2) en 348.405 voor het streptavidin-IgG-composiet (deeltjesdichtheid van 0,1 ^μm-2). Alleen deeltjes met een spoorlengte van minstens vijf frames werden opgenomen. Marginale kansverdelingen van zowel molecuulmassa (boven) als diffusiecoëfficiënt (rechts) worden gepresenteerd. De zwarte x in beide panelen markeren de respectievelijke lokale maxima van de KDE. (B) Vergelijking van bepaalde oligomeermassa's voor het complex van tetravalent streptavidin met biotine-gemodificeerd aldolase (linkerpaneel) of gebiotinyleerd IgG (rechterpaneel) met, afhankelijk van de sequentiemassa's, verwachte molecuulgewichten. De afkorting SU wordt ingevoerd ten behoeve van de subeenheid protein of interests. Foutbalken geven de standaardfout weer van de pieklocaties die worden geschat door bootstrapping (100 resamples met elk 1.000 trajecten). Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Het oplossen van het diffusiegedrag van de inheemse membraaninteragerende eiwitten annexine V (AnV) en cholera toxine subeenheid B (CTxB). (A) 2D kerneldichtheidsschattingen van zowel massa- als diffusiecoëfficiënt van annexine V (linkerpaneel) en choleratoxine subeenheid B (rechterpaneel). Voor AnV- en CTxB-membraanreconstitutie zijn lipidesamenstellingen van respectievelijk 80:20 mol% DOPC tot DOPS en 99,99:0,01 mol% DOPC tot GM1 gebruikt. In totaal zijn 206.819 trajecten van drie onafhankelijke replicaties opgenomen voor AnV (deeltjesdichtheid van 0,1 ^μm-2) en 142.895 trajecten voor CTxB (deeltjesdichtheid van 0,2 ^μm-2). (B) schattingen van de 2D-kerneldichtheid van CTxB- en AnV-mengsels in een verhouding van respectievelijk 1:1 (linkerpaneel) of 2:1 (rechterpaneel). Reconstitutie van eiwitmengsels werd uitgevoerd op een ondersteunde lipide bilayer met DOPC, DOPS en GM1 lipiden in een verhouding van 80:19.99:0.01 mol%. In totaal zijn 42.696 trajecten van drie onafhankelijke replicaties opgenomen voor het 1:1 mengsel (deeltjesdichtheid van 0,1 ^μm-2) en 264.561 trajecten voor de 2:1 verhouding (deeltjesdichtheid van 0,3 ^μm-2). Voor zowel (A) als (B) werden alleen deeltjes met een spoorlengte van ten minste vijf frames opgenomen. Marginale kansverdelingen van zowel molecuulmassa (boven) als diffusiecoëfficiënt (rechts) worden gepresenteerd. De witte x in elk paneel markeert het respectievelijke globale maximum van de KDE. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Mogelijke complicaties bij MSPT-metingen of tijdens data-analyse. (A) Representatieve beelden van de oppervlakteruwheid weergegeven in zowel de oorspronkelijke als de verwerkte (op mediaan gebaseerde achtergrondverwijdering) ratiometrische weergave van een ongereinigde afdekglasplaat. In beide gevallen vormen heldere vlekken resterende oppervlakteverontreinigingen die artefactvrije metingen belemmeren. (B) Voorbeeldbeelden van restblaasjes in het gezichtsveld na onvoldoende membraanwassing. Zowel statische (gemarkeerd in blauw) als diffuserende (gemarkeerd in oranje) blaasjes zullen de meetkwaliteit aantasten, hetzij door pulseren en wiebelen, hetzij door hun directionele beweging, respectievelijk. (C) Als een techniek met één deeltje vereist MSPT lage deeltjesdichtheden (representatief beeld, bovenste paneel) om een goede koppeling en massabepaling van elk deeltje mogelijk te maken. In het geval van hoge membraan-deeltjesdichtheden (middelste paneel) is de deeltjesfitting verminderd, wat de massabepaling beïnvloedt (zie onderste paneel). (D) Representatieve ratiometrische beelden van deeltjes die diffunderen op een membraaninterface na ofwel op gemiddelde (bovenste paneel) ofwel mediane achtergrondverwijdering. Voor diffuuserende deeltjes produceert de op gemiddelde achtergrond gebaseerde achtergrondverwijderingsstrategie vervormde beelden van de PSF van het deeltje, zoals te zien is in de kleine inzetstukken tussen het bovenste en middelste paneel. Daarentegen kunnen niet-verstoorde deeltjes-PSF's worden verkregen via de mediaangebaseerde benadering. Onderste paneel: Vergelijking van lijnprofielen door het midden van de PSF verkregen na gemiddelde of mediane achtergrondverwijdering. Voor alle native en ratiometrische afbeeldingen die in deze figuur worden weergegeven, vertegenwoordigen de schaalbalken 1 μm. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (dorsen) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Vergelijking van eiwitvrije en bezette membranen. Representatieve beelden van een intacte ondersteunde lipide bilayer vóór (A) en na (B) de toevoeging van gezuiverde streptavidin (STP). Kandidaatspots die met succes op het model PSF zijn gemonteerd, zijn rood omcirkeld. (C) Contrasteer waarschijnlijkheidsverdelingen van deeltjes gedetecteerd op een leeg membraan (membraanachtergrond, grijs) en op een dubbellaags met diffuserende streptavidindeeltjes (blauw). Beide kansverdelingen vertegenwoordigen de gepoolde gegevens van drie onafhankelijke experimenten met identieke filmacquisitie- en analyseparameters. Voor data-analyse (zie bijgeleverd Jupyter notebook; stap 9) werden de volgende parameters gebruikt: mediane venstergrootte (window_length) = 1.001 frames, detectiedrempel (thresh) = 0,00055, zoekbereik (dmax) = 4 pixels, geheugen (max_frames_to_vanish) = 0 frames, minimale trajectlengte (minimum_trajectory_length) = 7 frames. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 1: Voorbeeldige film die de breuk en fusie van blaasjes tot een homogeen membraan toont, vastgelegd met de massafotometer. Beeldverwerkingsmediaan venstergrootte (window_length) = 1.001 frames. Schaalbalk: 1 μm. Camera telt bereik: zwart = 16.892; wit = 65.408. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullende film 2: Voorbeeldfilms die de diffusie van annexine V (boven) en gebiotinyleerde aldolase (onder) complexen op een dubbellaagse complexen tonen zoals verkregen uit MSPT-metingen. Beeldverwerkingsmediaan venstergrootte (window_length) = 1.001 frames. Schaalbalk: 1 μm. Interferometrisch verstrooiingscontrastbereik: zwart = -0,0075; wit = 0,0075. Klik hier om deze film te downloaden.

Discussie

Het gepresenteerde protocol breidt massafotometrie²¹, een techniek die de massa van enkele biomoleculen analyseert die adsorberen op glas, uit tot een nog veelzijdiger hulpmiddel dat in staat is om tegelijkertijd de massa en diffusie van niet-gelabelde membraaninteragerende biomoleculen te meten. Deze analyse-uitbreiding wordt bereikt door de implementatie van een aangepaste achtergrondverwijderingsstrategie aangepast aan de laterale beweging van moleculen^24,25. Over het algemeen is de achtergrondverwijdering van het grootste belang voor iSCAT-gebaseerde benaderingen, omdat de sterke verstrooiing van de ruwheid van het glasoppervlak de belangrijkste analysebelemmering vormt en de nauwkeurige bepaling van de lokale achtergrond van elke pixel essentieel is voor de kwantificering van deeltjesmassa en -locatie. Naast de beeldanalyse aangepast aan deeltjesbewegingen, completeren daaropvolgende deeltjesdetectie, trajectkoppeling en data-analyse de nieuwe uitbreiding van MP naar massagevoelige deeltjestracering (MSPT).

Over het algemeen zijn grondig gereinigde glazen afdekplaten en een schone werkomgeving kritieke vereisten voor de succesvolle uitvoering van MSPT-experimenten. Door de afwezigheid van macromolecuullabeling is het verworven signaal inherent niet-selectief. Schone monsters, evenals een goede monsterbehandeling, zijn daarom cruciaal om ervoor te zorgen dat waarnemingen niet verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd. Met name wanneer moleculen met een laag molecuulgewicht worden onderzocht, worden controlemetingen van eiwitvrije membranen goedgekeurd om achtergrondbijdragen te beoordelen (aanvullende figuur 1). Naast het opnemen van regelmetingen, wordt daarom aanbevolen om de bereidingsstappen in figuur 2 voor elke stroomkamer te volgen. In combinatie zullen deze veiligheidsmaatregelen ervoor zorgen dat het gedetecteerde signaal afkomstig is van het biomolecuul van belang en niet bijvoorbeeld een verontreinigde stroomkamer, buffer of membraan.

Naast de voorzorgsmaatregelen met betrekking tot het experimentele ontwerp, moet er ook zorg worden besteed aan MSPT-beeldverwerking. Tijdens de videoverwerking moet de waarde voor drie parameters zorgvuldig worden gekozen om correcte resultaten te garanderen: i) de lengte van het mediaanvenster voor achtergrondverwijdering, ii) de drempel voor deeltjesdetectie en iii) de maximale zoekradius tijdens de koppelingstoewijzing. Een groter mediaanvenster (i) vergemakkelijkt over het algemeen de scheiding van diffuserende deeltjes van de boven elkaar geplaatste quasi-constante achtergrond. Voor te grote venstergroottes zal de steekproefdrift echter uiteindelijk merkbaar worden en de nauwkeurigheid van de achtergrondschatting verminderen. Optimale instellingen zijn sterk afhankelijk van de eigenschappen van het monster en de meetomstandigheden. Toch kan een waarde van 1.001 als robuust uitgangspunt worden gebruikt. De drempelwaardeparameter ii) moet worden afgestemd op de laagste moleculaire massa die in het monster wordt verwacht. Een waarde lager dan 0,0005 wordt niet aanbevolen voor metingen met de massafotometer die in dit onderzoek wordt gebruikt. Om de analysetijden te versnellen, kunnen hogere waarden worden gekozen als een monster met een hoog molecuulgewicht wordt verwacht. De zoekradius in trajectkoppeling (iii) geeft de maximale radiale afstand in pixels aan waarin de verschoven locatie van het deeltje in opeenvolgende frames wordt gezocht. Het moet worden aangepast aan het snelste deeltje in het monster en, indien gewenst, kan een adaptief zoekbereik (zie documentatie van trackpy) in plaats daarvan worden gebruikt om de rekentijd te verkorten. Vooral tijdens de beginfase van een project wordt aanbevolen om de films met verschillende parameters opnieuw te analyseren om de verkregen resultaten te valideren.

In het licht van de single-molecule aard van MSPT moet worden vermeden om te meten bij hoge membraandeeltjesdichtheden, omdat deze kunnen interfereren met nauwkeurige contrast- en massabepaling. Het is aangetoond dat dichtheden onder één deeltje per vierkante micrometer gunstig zijn voor MSPT-metingen²⁴. Een bijkomende overweging zijn de verwachte diffusiecoëfficiënten in de steekproef. Hoewel MSPT van toepassing is op een breed scala aan diffusiecoëfficiënten, heeft het een ondergrens van toegankelijke diffusiecoëfficiënten. Lokale beperking tot een gebied van enkele pixels gedurende een aanzienlijk deel van de mediane vensterperiode versmelt het deeltje met de statische achtergrond. Voor de beeldvormingsomstandigheden die in dit protocol worden gebruikt, wordt het meten van diffusiecoëfficiënten onder 0,01 μm²/s niet aanbevolen. Bij deze diffusiesnelheid is bijvoorbeeld de gemiddelde kwadraatverplaatsing van een deeltje tijdens de halve grootte van het mediane venster ongeveer 4 pixels en dus van vergelijkbare grootte als de omvang van de PSF. Als gevolg hiervan zal de statische achtergrondschatting waarschijnlijk signaalbijdragen van het deeltje zelf bevatten, wat resulteert in een schijnbaar verminderd contrast van het deeltje totdat het uiteindelijk het geluidsniveau nadert. Macromolecuuldiffusiecoëfficiënten tussen 0,05 en 10 μm²/s kunnen echter duidelijk worden opgelost.

Om het bereik van MSPT-toepassingen verder uit te breiden, kan men zich een vooruitgang van het op mediaan gebaseerde achtergrondalgoritme voorstellen door de eliminatie van pixels die tijdelijk bezig zijn met een deeltje, of door monsterdriftcorrectie waardoor grotere mediane venstergroottes mogelijk worden. Beide benaderingen zouden de problemen met betrekking tot metingen bij hoge deeltjesdichtheden en langzame diffusie verlichten. Verbeteringen in termen van lagere massagevoeligheid zijn aan de horizon met een nieuwe generatie massafotometers, die toegang kunnen bieden tot biomoleculen kleiner dan 50 kDa. Daarom zullen toekomstige MSPT-experimenten in staat zijn om single-molecule dynamica en membraangerelateerde interacties te bestuderen voor een nog breder scala aan membraanmimicries zoals gedempte dubbellagen en macromoleculaire systemen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
annexin V	Sigma Aldrich	#SRP8026	voorbeeld van een membraan-interagerend eiwit
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad Laboratories Inc.	#5000006	Bradford-assays om de eiwitconcentraties in voorraad te bepalen
biotine gelabeld bovien albumine	Sigma Aldrich	#A8549	voorbeeld van een eiwit dat kan worden gebruikt als standaardeiwit voor MSPT
cholera toxine sub-eenheid B	Sigma Aldrich	#SAE0069	voorbeeld van een membraan-interagerend eiwit
dekglazen, #1.5, 24 x 24 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102062
dekglazen, #1.5, 24 x 60 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	#0102242
dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	#850375	lipide - in de vorm van geëxtrudeerde kleine unilamellaire vesicles vereist voor ondersteunde lipide bilayer vorming
dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	#870273	lipide - in de vorm van geëxtrudeerde kleine unilamellaire vesicles vereist voor ondersteunde lipide bilayer vorming
dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoglycerol (DOPG)	Avanti Polar Lipids	#840475	lipide - in de vorm van geëxtrudeerde kleine unilamellaire vesicles vereist voor ondersteunde lipide bilayer vorming
dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (DOPS)	Avanti Polar Lipids	#840035	lipide - in de vorm van geëxtrudeerde kleine unilamellaire vesicles vereist voor ondersteunde lipide bilayer vorming
dubbelzijdig plakband	tesa	#57912-00000-02	nodig voor de samenstelling van glazen monsterkamers
Extruder	Avanti Polar Lipids	#610023	Lipide extruder om monodisperse vesicle distributies mogelijk te maken
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#A39261	maleimide-gefuseerde biotin die kan worden gebruikt om standaard eiwitten voor MSPT te biotinyleren
Fibronectine (gebiotinyleerd)	Cytoskeleton Inc.	#FNR03-A	voorbeeld van een eiwit dat kan worden gebruikt als standaardeiwit voor MSPT
Gel Filtration HMW Calibration Kit	Cytiva	#28403842	standaardeiwitten, bijv. aldolase die kunnen worden gebiotinyleerd en gebruikt als moleculaire gewichtsstandaarden voor MSPT
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Natriumzout)	Avanti Polar Lipids	#860065	lipide - in de vorm van geëxtrudeerde kleine unilamellaire vesicles vereist voor ondersteunde lipide bilayer vorming
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Biotin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)	#31820	voorbeeld van een eiwit om het bestaan van verschillende eiwittoestanden te benadrukken
Isopropanol, 99,5%, voor spectroscopie	Thermo Fisher Scientific	#10003643
Low Autofluorescence Immersieolie	Olympus K.K.	#IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-Alive	Addgene	#20860	vereist om divalent streptavidin te expresseren en te zuiveren in combinatie met elkaar
pET21a-Streptavidin-Dead	Addgene	#20859	vereist om divalent streptavidin te expresseren en te zuiveren in combinatie met elkaar
Pierce Alkaline Fosfatase, gebiotinyleerd	Thermo Fisher Scientific	#29339	voorbeeld van een eiwit dat kan worden gebruikt als standaardeiwit voor MSPT
Pierce Protein A, Biotinyl	Thermo Fisher Scientific	#29989	voorbeeld van een eiwit dat kan worden gebruikt als standaardeiwit voor MSPT
Refeyn Acquire	Refeyn Ltd.		besturingssoftware voor Refeyn OneMP
Refeyn One	Refeyn Ltd.	-	massafotometer
steriele spuitfilters 0,45 µm celluloseacetaatmembraan	VWR International	#514-0063	nodig om deeltjes uit de buffer van belang te filteren
tetravalent streptavidin	Thermo Fisher Scientific	#SNN1001	tetravalent streptavidin om de aanwezigheid van meerdere biotin binding sites mogelijk te maken
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0,05 µm Pore Size, 25 mm Cirkel	Cytiva	#110603	een poriegrootte van 50 nm wordt aanbevolen voor ondersteunde lipide bilayer vorming in de context van MSPT
Zepto model 2 plasma cleaner	Diener electronic GmbH	-