Methodenartikel

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

DOI:

10.3791/63614

⸱

13 mei 2022

 ,  , 
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nano-sized lipide-membraan gebonden structuren die vrijkomen uit alle cellen, aanwezig zijn in alle biovloeistoffen en eiwitten, nucleïnezuren en lipiden bevatten die een weerspiegeling zijn van de moedercel waaruit ze zijn afgeleid. Een goede scheiding van EV's van andere componenten in een monster maakt karakterisering van hun bijbehorende lading mogelijk en geeft inzicht in hun potentieel als intercellulaire communicatoren en niet-invasieve biomarkers voor tal van ziekten. In de huidige studie werden van oligodendrocyten afgeleide EV's geïsoleerd uit celkweekmedia met behulp van een combinatie van state-of-the-art technieken, waaronder ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) om EV's te scheiden van andere extracellulaire eiwitten en eiwitcomplexen. Met behulp van in de handel verkrijgbare SEC-kolommen werden EV's gescheiden van extracellulaire eiwitten die vrijkwamen uit menselijke oligodendroglioomcellen onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden. De canonieke EV-markers CD9, CD63 en CD81 werden waargenomen in fracties 1-4, maar niet in fracties 5-8. GM130, een eiwit van het Golgi-apparaat, en calnexin, een integraal eiwit van de ER, werden gebruikt als negatieve EV-markers en werden in geen enkele fractie waargenomen. Verder werd bij het poolen en concentreren van fracties 1-4 als de EV-fractie en fracties 5-8 als de eiwitfractie expressie van CD63, CD81 en CD9 in de EV-fractie waargenomen. De expressie van GM130 of calnexin werd niet waargenomen in een van de fractietypen. De gepoolde fracties van zowel controle- als ER-stresscondities werden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie en blaasjes werden waargenomen in de EV-fracties, maar niet in de eiwitfracties. Deeltjes in de EV en eiwitfracties van beide omstandigheden werden ook gekwantificeerd met nanodeeltjes tracking analyse. Samen tonen deze gegevens aan dat SEC een effectieve methode is voor het scheiden van EV's van geconditioneerde celkweekmedia.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De explosie van interesse in het bestuderen van extracellulaire blaasjes (EV's) is gepaard gegaan met grote vooruitgang in de technologieën en technieken die worden gebruikt om deze nanogrote, heterogene deeltjes te scheiden en te bestuderen. In de tijd sinds hun ontdekking bijna vier decennia geleden 1,2, zijn deze kleine vliezige structuren gevonden om bioactieve lipiden, nucleïnezuren en eiwitten te bevatten en een belangrijke rol te spelen in intercellulaire communicatie 3,4. EV's komen vrij uit alle celtypen en zijn daarom aanwezig in alle biologische vloeistoffen, inclusief bloedplasma en serum, speeksel en urine. EV's in deze vloeistoffen houden een grote belofte in om te dienen als niet-invasieve biomarkers voor verschillende ziekten, waaronder neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten, kankers en auto-immuunziekten 5,6,7. Verder kunnen in vitro mechanistische studies worden uitgevoerd door middel van celkweektechnieken door EV's te scheiden die vrijkomen in het kweekmedium 3,8,9.

Om de rol van EV's in de pathofysiologie van ziekten te begrijpen, is een adequate scheiding van de vloeistof waarin ze worden aangetroffen van het grootste belang. De gouden standaard voor EV-scheiding is al lang differentiële ultracentrifugatie (dUC)10, maar er zijn meer geavanceerde technieken ontstaan om een betere scheiding van EV's van andere extracellulaire componenten te bereiken. Sommige van deze technieken omvatten dichtheidsgradiënten, asymmetrische-flow veldstroomfractie (A4F), flowcytometrie, immunocapture, polyethyleenglycolprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)11,12,13. Elke techniek heeft zijn eigen voor- en nadelen; van SEC in het bijzonder is echter aangetoond dat het EV's vrij effectief scheidt van zowel biologische vloeistoffen als supernatanten van celkweek 8,14,15. SEC heeft ook de toegevoegde bonus dat het relatief eenvoudig en gebruiksvriendelijk is.

SEC is een methode die componenten van een vloeistof scheidt op basis van grootte. Met deze techniek wordt een kolom hars (in eigen huis gemaakt of commercieel gekocht) gebruikt om een monster te fractioneren. Kleine deeltjes in het monster komen vast te zitten tussen de kralen in de hars, terwijl grotere deeltjes vrijer door de hars kunnen gaan en dus eerder in het proces kunnen elueren. Omdat EV's groter zijn dan veel extracellulaire eiwitten en eiwitaggregaten, passeren EV's sneller de kolom en elueren ze in eerdere fracties dan extracellulaire eiwitten14.

In dit methodepaper wordt het gebruik van SEC voor scheiding van EV's van celkweekmedia (CCM) van menselijke oligodendrocyten onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden geschetst. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat EV's gescheiden met deze techniek worden gevonden in specifieke fracties die kunnen worden samengevoegd en geconcentreerd voor downstream karakterisatie, en dat de gescheiden EV's zijn afgeleid van cellen en niet van een exogene bron zoals foetaal runderserum (FBS) dat wordt gebruikt om de CCM aan te vullen. De aanwezigheid van de canonieke EV-markers, CD63, CD81 en CD9 16,17,18,19 in de EV-fracties, en hun afwezigheid in de eiwitfracties wordt aangetoond met western blotting. Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden EV's gevisualiseerd en geven ze de verwachte morfologie weer en worden ze alleen waargenomen in de EV-fractie. Deeltjes worden ook geteld in de EV- en eiwitfracties van zowel controle- als ER-stressomstandigheden, en een groot aantal deeltjes binnen het verwachte groottebereik van 50-200 nm in diameter wordt waargenomen in de EV-monsters. Samen ondersteunen deze gegevens het idee dat SEC een efficiënte en effectieve methode is voor het scheiden van EV's van celkweekmedia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van buffers en reagentia

OPMERKING: Maak celkweekreagentia in celkweekkap om de steriliteit te behouden.

  1. Bereiding van celkweekreagentia
    1. Bereid normale dmem met een hoog glucosegehalte door 50 ml FBS en 5 ml penicilline-streptokokken (Pen-Strep) toe te voegen aan 500 ml dmem met een hoog glucosegehalte en bewaar bij 4 °C. Gebruik deze media voor het kweken en uitbreiden van cellen.
    2. Bereid exosoom-uitgeputte dmem met hoge glucose door 50 ml exosoom-uitgeputte FBS en 5 ml pen-strep toe te voegen aan 500 ml dmem met een hoog glucosegehalte en bewaar bij 4 °C. Gebruik deze media voor celbehandelingen voorafgaand aan EV-isolatie.
    3. Bereid tunicamycine door 10 mg tunicamycine toe te voegen aan 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Maak 50 μL aliquots in 0,2 ml buisjes en bewaar bij -20 °C.
  2. Bereiding van EV-scheidingsreagentia
    1. Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door 9,89 g PBS-poeder toe te voegen aan 1 L gedeïoniseerd (DI) water in een maatcilinder van 1 L. Roer de oplossing op een roerplaat totdat de PBS is opgelost.
    2. Gebruik de autoclaaf om het glaswerk te steriliseren voordat u PBS toevoegt. Doe het glaswerk in een bak, sluit de deur en steriliseer gedurende 30 minuten bij 121 °C.
    3. Sluit in een laminaire flowkast een vacuüm aan op het filter van 0,22 μm en plaats het filter bovenop de geautoclaveerde fles. Giet de PBS langzaam op het filter en verzamel de gefilterde PBS in de geautoclaveerde fles.
    4. Bereid 0,5 M natriumhydroxide door 9,99 g natriumhydroxide toe te voegen aan 500 ml 1x PBS in een cilinder met schaalverdeling van 500 ml. Roer de oplossing op een roerplaat totdat het natriumhydroxide oplost in de PBS en filtreer vervolgens met een filter van 0,22 μm in een geautoclaveerde fles van 500 ml.
    5. Bereid 0,05% natriumazide door 0,25 g natriumazide toe te voegen aan 500 ml 1x PBS in een cilinder van 500 ml. Roer de oplossing op een roerplaat totdat natriumazide oplost in de PBS en filtreer vervolgens met een filter van 0,22 μm in een geautoclaveerde fles van 500 ml.
  3. Bereiding van eiwitisolatie, kwantificering en identificatiereagentia
    1. Bereid 100 ml RIPA-lysisbuffer door 1 ml 1 M Tris (pH 7,4), 1 ml 10% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 g deoxycholaat, 1 ml NP-40 en 0,89 g natriumchloride (NaCl) te combineren. Breng het volume op 100 ml met gedestilleerd H2O en bewaar bij 4 °C. Om RIPA plus fosfatase en proteaseremmeroplossing te maken, voegt u 10 μL fosfatase en proteaseremmer toe voor elke 1 ml RIPA-buffer in een buis van 15 ml en bewaart u de oplossing bij 4 °C.
    2. Bereid onmiddellijk voor gebruik het BCA-testwerkreagens door 10 ml reagens A en 200 μL reagens B van de BCA-testkit toe te voegen aan een buis van 15 ml. Bereid onmiddellijk voor gebruik het microBCA-testwerkreagens door 25 delen reagens A, 24 delen reagens B en 1 deel reagens C toe te voegen aan een buis van 15 ml.
    3. Bereid 10x gel elektroforese lopende buffer door 30,3 g Tris base, 144 g glycine en 10 g SDS toe te voegen in 1 L DI-water. Bewaar de loopbuffer bij 4 °C. Bereid 1x transferbuffer voor door 3,03 g Tris-base, 14,4 g g glycine en 200 ml methanol toe te voegen en pas het volume aan op 1 l met DI-water. Bewaar de transferbuffer bij 4 °C.
    4. Bereid Tris gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBS-Tween) door 2,4 g Tris-base, 8 g NaCl en 1 ml Tween-20 toe te voegen aan 1 l DI-water. Bewaar de TBS-Tween bij 4 °C.
    5. Bereid 5% blokkerende oplossing door 5 g vette melkpoeder toe te voegen aan 100 ml TBS-Tween. Bewaar de blokkeerbuffer bij 4 °C.
    6. Bereid onmiddellijk voor gebruik chemiluminescent substraat door 4 ml peroxideoplossing en 4 ml luminol/enhancer-oplossing toe te voegen aan een buis van 15 ml en keer voorzichtig om om te mengen.

2. Kweken en behandelen van cellen

  1. Zaai twee T175 celkweekkolven met elk 2,3 x 106 humane oligodendroglioom (HOG) cellen. Breng het uiteindelijke volume van normale hoge glucose DMEM op 25 ml en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 in een celkweekincubator gedurende 48 uur.
  2. Aan het einde van de 48 uur, warme exosoom-uitgeputte hoge glucose DMEM in een 37 °C waterbad. Voeg voor de behandeling 25 μL van 10 mg/ml tunicamycine toe aan 25 ml exosoomarme media, eindconcentratie van 10 μg/ml tunicamycine om ER-stress te induceren. Voeg voor de controle 25 μL DMSO toe aan 25 ml exosoomarme media.
  3. Verwijder en gooi de normale hoge glucose DMEM uit de cellen en spoel de cellen voorzichtig af en kolf met 10 ml 1x PBS. Aspirateer en gooi PBS weg.
  4. Voeg 25 ml controlemedia toe aan de met de kolf gelabelde controle en 25 ml 10 μg/ml tunicamycine in media in de met de kolf geëtiketteerde behandeling. Breng kolven terug naar de celkweekincubator gedurende 24 uur.

3. Verzameling en concentratie van geconditioneerde CCM (figuur 1)

  1. Plaats PBS in een waterbad van 37 °C. Observeer kolven onder een samengestelde microscoop met een objectief van 10x en 100x objectief. Noteer eventuele verschillen tussen de kolven. Voer de volgende stappen uit voor zowel controle- als behandelde kolven.
  2. Verwijder de media uit de kolf en plaats deze in een buis van 50 ml. Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Breng het supernatant over op een nieuwe buis van 50 ml.
  3. Centrifugeer de buis bij 2.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 50 ml en plaats het op ijs.
  4. Verkrijg vier 15 ml 3 kDa cutoff ultrafiltratie-eenheden en voeg 5 ml PBS toe aan elke buis. Bereid het filter voor door de ultrafiltratie-eenheden gedurende 10 minuten bij 4°C op 4.000 x g te centrifugeren.
    OPMERKING: 3 kDa moleculaire gewicht cutoff ultrafiltratie-eenheden werden gebruikt in het huidige protocol om alle extracellulaire eiwitten die vrijkomen uit cellen te behouden. Grotere moleculaire afsnijdingseenheden (bijv. 30 kDa) zouden ook met dit protocol werken, maar extracellulaire eiwitten kleiner dan 30 kDa zouden worden uitgefilterd en uit de monstersworden verwijderd 20,21.
  5. Verwijder PBS uit de ultrafiltratie-eenheden. Verdeel het supernatant van elke aandoening (controle en behandeld met tunicamycine) in twee ultrafiltratie-eenheden elk, ongeveer 12,5 ml media in elk.
  6. Centrifugeer de buizen bij 4.000 x g gedurende 1 h en 45 min bij 4 °C, of totdat het geconcentreerde medium (het retentaat genoemd) in elke ultrafiltratie-eenheid is geconcentreerd tot 250 μL of minder.
  7. Breng het retentaat van beide controle-ultrafiltratie-eenheden over in één gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng het retentaat van beide behandelde ultrafiltratie-eenheden over in een andere gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
  8. Meet het totale volume van het retentaat in elke microcentrifugebuis op 500 μL. Als het monster minder dan 500 μL is, voeg dan 0,22 μm gefilterd 1x PBS toe tot het uiteindelijke volume 500 μL is. Plaats de buizen in een vriezer van -80 °C.

4. Celverzameling

  1. Plaats trypsine, PBS en exosoom-uitgeputte DMEM in een waterbad van 37 °C. Voeg 7 ml trypsine toe aan zowel de controle als de behandelde kolven en plaats deze gedurende 5 minuten in de couveuse.
  2. Bekijk onder de microscoop of de cellen zijn opgetild. Als de cellen niet worden opgetild, tikt u de kolf stevig tegen de palm van de hand om cellen los te maken.
  3. Was de kolf met 7 ml exosoom-uitgeput DMEM. Verzamel de celsuspensie uit de kolf en plaats deze in buizen van 15 ml.
  4. Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 5 ml 1x PBS toe aan de celpellet. Pipet voorzichtig mengen om de pellet te breken.
  5. Centrifugeer de buizen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 200 μL RIPA plus fosfatase en proteaseremmeroplossing toe aan celpellet, pipet om te mengen.
  6. Breng de cellen in de RIPA-oplossing over in buizen van 1,5 ml. Laat de buizen 5 min op ijs zitten. Centrifugeer de buizen bij 14.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
  7. Breng het supernatant over in nieuwe buizen van 1,5 ml. Label de buisjes met de behandelingsconditie en -datum. Plaats de tubes in een vriezer van -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

5. EV-scheiding met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 2)

OPMERKING: Voer de volgende stappen twee keer uit, één keer voor controleretentaat en één keer voor met tunicamycine behandeld retentaat.
OPMERKING: De PBS die in deze sectie wordt gebruikt, is 0,22 μm gefilterd 1x PBS.

  1. Schakel de automatische fraction collector (AFC) in en pas de instellingen aan om acht fracties, 0,5 ml per fractie en buffervolume (void) te verzamelen naar standaard.
    OPMERKING: De AFC-bedrijfsomstandigheden zijn als volgt: kolom/ bedvolume = 10 ml; leegte volume = 2,70 ml; spoelvolume = 15 ml; optimale fractiegrootte = 500 μL; vereiste buffer per run = 65 ml; debiet bij 20 °C = 1,0 ml/min; herbruikbaarheid van de kolom = vijf toepassingen.
  2. Verwijder de kolom (zie Tabel met materialen) van 4 °C en laat de kolom opwarmen tot kamertemperatuur voordat u begint (meestal ~ 30 min).
  3. Verwijder retentaatmonsters uit de vriezer -80 °C en leg op ijs om te ontdooien. Zet tijdens het wachten acht gelabelde 1,5 ml buizen in de AFC-carrousel met deksels naar binnen gericht.
  4. Plaats de kolom in de AFC met de streepjescode naar de lezer gericht. Start de inzameling door de instructies op het scherm te volgen om te controleren of er buizen in de carrousel zitten en of de afvalinzamelaar goed functioneert.
  5. Begin met het spoelen van de kolom door 15 ml 1x PBS aan de kolom toe te voegen nadat de opslagbuffer volledig is geabsorbeerd in het bovenste gedeelte van de kolommatrix. Voeg PBS niet te vroeg toe, omdat dit de opslagbuffer verdunt en voldoende spoeling voorkomt.
  6. Net voordat alle 15 ml PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, klikt u op OK om het blozen te stoppen en eventuele resterende PBS van de bovenkant van de kolommatrix te verwijderen met een micropipette. Raak de matrix niet aan.
  7. Voeg 500 μL monster toe aan het midden van de kolom. Klik op OK om de uitvoering te starten. Kijk hoe het monster in de matrix absorbeert en voeg snel 8 ml PBS toe aan de kolom onmiddellijk nadat het monster volledig is geabsorbeerd.
  8. AFC zal automatisch het leegtevolume in het midden van de carrousel verdrijven en vervolgens alle acht fracties van elk 500 μL verzamelen. Verwijder aan het einde van de run fracties uit de carrousel en plaats ze op ijs. Fracties 1-4 bevatten EV's, terwijl fracties 5-8 extracellulaire eiwitten bevatten. Verwijder het lege volume uit het midden van de carrousel.
  9. Voeg 10 ml PBS toe aan de kolom nadat de acht fracties zijn verzameld om het resterende monster uit de kolom te wassen. Nadat het retentaatmonster volledig door de kolom is gespoeld, voegt u 15 ml 1x PBS toe aan de kolom.
  10. Terwijl de uiteindelijke PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, voegt u 500 μL 0,5 M natriumhydroxide toe aan het midden van de matrix van de kolom. Terwijl het natriumhydroxide wordt geabsorbeerd, voegt u 30 ml 1x PBS toe aan de kolom en laat u deze doorspoelen.
  11. Als u een ander monster uitvoert, voegt u acht gelabelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml toe aan de carrousel en herhaalt u stap 5.7-5.10.
  12. Als u klaar bent met alle voorbeelden, voert u de volgende stappen uit om de kolom te behouden voor later gebruik. Nadat u 30 ml PBS door de kolom hebt gespoeld zoals beschreven in stap 5.10, voegt u 15 ml 0,05% natriumazide toe aan de kolom.
  13. Laat ongeveer 5 ml natriumazide achter op de bovenkant van de kolommatrix. Verwijder de kolom van de AFC en bevestig de boven- en onderkappen. Plaats de kolom terug bij 4 °C voor opslag (kolom kan tot vijf keer worden gebruikt).

6. Ultrafiltratie van EV- en eiwitfracties

  1. Verkrijg twee 2 ml, 3 kDa cutoff ultrafiltratie-eenheden per monster. Gebruik één eenheid om de EV-fracties te concentreren (fracties 1-4) en de andere om de eiwitfracties te concentreren (fracties 5-8). Elke eenheid bestaat uit drie delen: kegel, filter en doorstroomcilinder; label elk onderdeel goed.
  2. Bouw de ultrafiltratie-eenheid en voeg 1 ml van 0,22 μm gefilterd 1x PBS toe aan het filtergedeelte en dop met het conusstuk. Centrifugeer de ultrafiltratie-eenheid, kegelzijde omhoog bij 3.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  3. Verwijder de gefilterde PBS uit de doorstroomcilinder. Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven (kegelzijde naar beneden) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C. Verwijder eventuele resterende PBS uit de kegel.
  4. Voeg de juiste fracties (het volledige volume van 500 μL) toe aan elke ultrafiltratie-eenheid (het totale volume is 2 ml). Centrifugekolommen kegelzijde omhoog gedurende 1 h 45 min bij 3.500 x g bij 4 °C, of totdat het retentaatniveau op 100 μL is.
  5. Verwijder de doorstroomcilinder en gooi de doorstroom weg. Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven (kegelzijde naar beneden) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C.
  6. Breng het retentaat in de conus over in een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml en breng elk monstervolume op 150 μL met 0,22 μm gefilterd 1x PBS. Plaats de tubes in de vriezer van -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

7. Mediabediening

  1. Verkrijg twee T175 celkweekkolven. Label de ene kolf controle en de andere behandeling. Warme exosoom-uitgeputte hoge glucose DMEM in een waterbad van 37 °C.
  2. Voeg 25 μL tunicamycine stockoplossing (10 mg/ml) toe aan 25 ml media en doe in de met de erlenmeyer gelabelde behandeling. Voeg 25 μL DMSO toe aan 25 ml media en doe het met het opschrift in de kolf. Bewaar kolven in een celkweekincubator gedurende 24 uur.
  3. Verzamel media en verwerk om EV's te scheiden zoals beschreven in stappen 3.2-3.8. Voer vervolgens alle stappen uit die in secties 5 en 6 worden beschreven.

8. Western blotting

  1. Eiwitkwantificering van cellysaten en eiwitfracties met BCA-test
    OPMERKING: Eiwitkwantificering van zowel controle- als tunicamycinebemonsteringsmonsters wordt uitgevoerd met de volgende stappen.
    1. Ontdooi gelyseerde cellen en eiwitfracties op ijs. Maak drie verdunningsbuizen voor elk monster; 1:2, 1:10 en 1:100.
    2. Belasting in drievoud op een testplaat met heldere bodem van 96, 25 μL runderserumalbumine (BSA) eiwitstandaarden en 25 μL van elke monsterverdunning. Voeg 200 μL werkreagens toe aan elke put die standaard of monster bevat, met behulp van een meerkanaals pipet.
    3. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30 minuten en lees vervolgens de plaat af met een plaatlezer bij een absorptie van 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie in elk monster en bepaal het monstervolume dat nodig is om 20 μg eiwit voor cellysaten en 15 μg eiwit voor eiwitfracties te verkrijgen.
  2. Eiwitkwantificering van EV-fracties met microBCA-test
    1. Ontdooi EV-monsters op ijs. Maak twee verdunningen voor elk monster: 1:50 en 1:100.
    2. Laad in drievoud op een testplaat met heldere bodem, 100 μL BSA-eiwitstandaarden en 100 μL van elke monsterverdunning. Voeg 100 μL microBCA-werkreagens toe aan elke put die standaard of monster bevat, met behulp van een meerkanaals pipet.
    3. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 2 uur en lees vervolgens de plaat af met een plaatlezer bij een absorptie van 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie in elk monster en bepaal het volume van het monster dat nodig is om 15 μg eiwit voor EV-fracties te verkrijgen.
  3. Western blotting
    OPMERKING: Het Western blotting-protocol is uitgevoerd op dezelfde manier als beschreven in22 en gewijzigd zoals hieronder beschreven.
    1. Maak 10% polyacrylamide gels met een gel making kit, met behulp van de instructies van de fabrikant.
    2. Bereid voor gel-elektroforese cellysaatmonsters door in een buis van 1,5 ml het volume cellysaat te combineren dat nodig is voor 20 μg eiwit, 5 μL 4x Laemmli-buffer en het volume RIPA-buffer dat nodig is om het totale volume op 20 μL te brengen.
    3. Bereid EV- en eiwitfractiemonsters voor door in een buis van 1,5 ml het monstervolume te combineren dat nodig is voor 15 μg eiwit, 5 μL 4x Laemmli-buffer en RIPA-buffer tot een volume van 20 μL.
    4. Bereid mediacontrolemonsters door in een buis van 1,5 ml 15 μL monster en 5 μL 4x Laemmli-buffer te combineren.
      OPMERKING: Afhankelijk van de te gebruiken antilichamen kan de Laemmli-buffer al dan niet een reductiemiddel bevatten, zoals 50 mM dithiothreitol (DTT).
    5. Kook alle monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C, breng monsters over op ijs om af te koelen en centrifugeer kort gedurende 30 s bij 10.000 x g en breng de monsters terug naar ijs.
    6. Voeg gels toe aan de elektroforesetank en voeg 1x gel elektroforese lopende buffer toe. Laad 15 μL eiwitladder en 20 μL monster. Laat de gel 30-50 minuten op 200 V draaien, of totdat de monsters de bodem van de gel hebben bereikt, net voordat ze weglopen.
    7. Breng het eiwit over naar een PVDF-membraan met 1x overdrachtsbuffer bij 4 °C gedurende 30 minuten bij 100 V, of totdat de overdracht is voltooid. Aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3 tonen vlekvrije afbeeldingen van elke vlek nadat de overdracht is voltooid.
    8. Blokkeer het membraan in 5% melk/TBS-Tween gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Incubeer membraan in primaire antilichaamoplossing 's nachts op een shaker bij 4 °C. Zie tabel 1 voor informatie over de verdunning van antilichamen.
    9. Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en was het membraan 3x met TBS-Tween gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur op een shaker.
    10. Bereid geschikte secundaire antilichamen in 5% melk/TBS-Tween. Zie tabel 1 voor verdunningsinformatie. Voeg secundair antilichaam toe aan het membraan en incubeer op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en was vervolgens 3x met TBS-Tween gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur op een shaker.
    11. Voeg chemiluminescent substraat toe aan het membraan en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een shaker. Image blot door gebruik te maken van colorimetrische en chemiluminescente analyse. Aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5 en aanvullende figuur 6 tonen niet-bijgesneden afbeeldingen van elke vlek.

9. TEM beeldvorming

  1. Gloeiend ontlading23 400 mesh koolstof/ formvar gecoate roosters om koolwaterstoffen te verwijderen en de roosters hydrofiel te maken.
  2. Voeg 5 μL EV of eiwitfractiemonster toe aan roosters. Incubeer roosters bij kamertemperatuur gedurende 3-5 min.
  3. Verwijder overtollige oplossing door te voeren met filtreerpapier. Was de roosters met 5 μL nanopoerwater en verwijder het teveel door af te voeren.
  4. Breng 5 μL van 1% waterig uranylacetaat aan en spoel onmiddellijk af. Laat roosters drogen. Beeldrasters bij 120 kV op een transmissie-elektronenmicroscoop en leggen beelden vast met een camera van een opgeladen apparaat.

10. Nanodeeltjes tracking analyse (NTA)

  1. Verkrijg EV- en eiwitfractiemonsters van -80 °C en ontdooi op ijs.
  2. Schakel de computer en het NTA-instrument in. Open de NTA-software en deze begint automatisch te initialiseren.
  3. Selecteer de juiste pomp die deeltjesvrij water bevat en klik op Het instrument spoelen om de cel te spoelen. Injecteer tijdens het spoelen 10-20 ml deeltjesvrij water in de injectiepoort aan de voorkant van het instrument met behulp van een spuit en vermijd luchtbellen.
  4. Het scherm voor de controle van de celkwaliteit verschijnt; klik op OK en de celkwaliteitscontrole begint. Nadat de controle met succes is doorstaan, verschijnt het pop-upscherm voor automatische uitlijning met de tekst: Vul de cel met 100 nm uitlijningssuspensie (verdunning 1:250.000).
    1. Bereid verdunning 1 van de uitlijningssuspensie voor door 10 ml deeltjesvrij water en 10 μL 100 nm polystyreenparels aan een buis toe te voegen (1:1.000 verdunning). Keer voorzichtig om om te mengen. Verdunning 1 heeft een houdbaarheid van 2-3 dagen bij 4 °C.
    2. Maak verdunning 2 van uitlijningssuspensie door 20 ml deeltjesvrij water en 80 μL verdunning 1 (1:1.000) in een buis toe te voegen om de verdunning van 1:250.000 te creëren. Keer de buis voorzichtig om om te mengen. Verdunning 2 heeft een houdbaarheid van 30-60 min bij kamertemperatuur.
  5. Vul cel met 2 ml verdunning 2 (1:250.000). Klik op OK en het programma voltooit de automatische uitlijning (focus) en focusoptimalisatie. Het tabblad Analyse opent het maken van een profiel dat resultaten biedt van de reinheid en symmetrie van de meetcel in een parabool. Een pop-up scherm met de tekst: View Video Microscope is nu klaar voor experimenten, zal verschijnen; klik op OK en het programma keert terug naar het tabblad Celcontrole.
  6. Spoel de polystyreenparels uit de cel door deeltjesvrij water in de injectiepoort te injecteren om de cel te wassen. Blijf wassen totdat het aantal gedetecteerde deeltjes tussen 0-10 ligt (meestal tussen 5-10 ml). Voeg 1 ml gefilterd PBS van 0,22 μm toe om de cel voor te bereiden op het eerste monster.
  7. Verdun het eerste monster met 0,22 μm gefilterd PBS (begin met 1:1000 verdunning) en voer de verdunningsfactor in het programma in. Steek 1 ml monster in de cel en wacht 5 minuten tot de deeltjesbeweging vertraagt, omdat ze in eerste instantie heel snel over het scherm zullen bewegen. Stel de gevoeligheid en sluiter in op respectievelijk 75,0 en 100.
  8. Het aantal gedetecteerde deeltjes voor ideale monsterverdunning is 50-200 deeltjes. Als minder dan 50 of meer dan 200 deeltjes worden gemeld, past u de verdunning van het monster aan. Als een nieuwe verdunning nodig is, wast u de cel met deeltjesvrij water totdat er 0-10 gedetecteerde deeltjes zijn. Herhaal het toevoegen van verdund monster en wassen totdat de ideale verdunning is gevonden.
  9. Controleer alle 11 cameraposities om te visualiseren dat de deeltjesbeweging is vertraagd en zorg ervoor dat het aantal gedetecteerde deeltjes vergelijkbaar is tussen alle cameraposities. Als het aantal deeltjes sterk verschilt tussen de cameraposities, voegt u meer monster toe.
  10. Klik op het tabblad Meting en Voer video-acquisitie uit. Voer op het tabblad video-acquisitie de aangepaste naam voor voorbeeld in en identificeer een veilige locatie. Schakel de selectievakjes autosave.txt en autosave.pdf in om gegevens op te slaan.
  11. Stel de temperatuur in op 25 °C, klik op 488 nm om de laser in te stellen en klik op 11 voor de cameraposities. Klik op OK om gegevensverzameling uit te voeren. Het programma zal beginnen met het analyseren van het aantal deeltjes en de grootte in alle 11 posities. Onder het tabblad Analyse verschijnt een staafdiagram met diameter/nm op de x-as en deeltjes/ml op de y-as.
  12. Nadat gegevens zijn verzameld, verschijnt er een pop-upscherm met de titel Positiesoverzicht met gegevens voor elk van de 11 posities. Als er meer dan twee posities uit de analyse zijn verwijderd, herhaalt u de procedure met meer monster. Zo niet, klik dan op de knop Doorgaan . Er wordt een PDF- en txt-bestand geopend met de resultaten. Sla de bestanden op een veilige locatie op.
  13. Als u nog een voorbeeld wilt uitvoeren, gaat u naar het tabblad Celcontrole en herhaalt u stap 10.6 tot en met 10.12. Als dit gebeurt, wast u de cel met deeltjesvrij water totdat het aantal gedetecteerde deeltjes 0-10 is (ongeveer 5-10 ml). Spoel de cel met 1 ml gefilterde PBS van 0,22 μm, sluit het programma en schakel de computer uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blotting onthult adequate scheiding van EV's van CCM
Om de effectiviteit van SEC voor het scheiden van EV's van celkweekmedia te evalueren, werd een western blot uitgevoerd met behulp van elke afzonderlijke fractie uit de controlemonsters om de expressie van de drie canonieke EV-markers, CD9, CD63 en CD81, evenals GM130 en calnexin18, die werden gebruikt als negatieve controles te onderzoeken (figuur 3). Albumine-expressie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEC is een gebruiksvriendelijke methode om EV's adequaat te scheiden van geconditioneerde CCM. Om specifiek van cellen afgeleide EV's te isoleren, moet zorgvuldig rekening worden gehouden met het type CCM en de supplementen ervan. Veel celkweekmedia moeten worden aangevuld met FBS, dat EV's bevat die zijn afgeleid van het dier waarin het serum is geoogst. Deze serum-EV's kunnen elk signaal dat wordt geproduceerd door EV's afkomstig van cellen in cultuur verzadigen en maskeren26. Daarom moet bij he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Penn State Behrend en de Hamot Health Foundation bedanken voor financiering, evenals de Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit met Ultracel-3 membraanSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilutie
Anti-Calnexin antilichaamAbcam ab225951:500 Dilutie
Anti-CD9 Muis Monoklonaal AntilichaamBioLegend3121021:500 Dilutie
Anti-GM130 antilichaam [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilutie
Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld AntilichaamCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilutie
Automatische Fractie CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Muis anti HumaanBD5560191:1000 Dilutie
CD81 AntilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilutie
Cellstar Filter Cap Cell Cultuur FlaconsGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstraatBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/Hoge glucose met L-glutamine; zonder natriumCytivaSH300022.FS
Fetaal Rundserum Premium kwaliteitVWR97068-085
Fetaal Rundserum, exosome-vrijThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Vetvrij Droge MelkAmazonB076NRD2TZ
HOG Humane Oligodendroglioma CellijnSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glas platenBioRad1653310met 0.75mm ruimtes
Mini-PROTEAN Korte platenBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicilline-Streptomycine, OplossingSigma-AldrichP4458-100mL
Fosfaat Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits en ReagentiaThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PapierThermo Scientific84783
Polyoxyethyleen-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/fosfatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antilichaam [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 verdunning
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Natrium azideFisher ScientificBP922I-500
Natrium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Natrium dodecylsulfaat,≥99.0% (GC), stofvrije korrelsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethyleendiamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmissie ElektronenmicroscoopFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsine 0.25% protease met varkens trypsine, HBSS, EDTA; zonder calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycineTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

UltrafiltratieEV separatieoligodendrocyten EV sWestern blotnanoparticle trackingtransmissie elektronenmicroscopieEV markers

Gerelateerde artikelen