Methodenartikel

Isolatie, uitbreiding en differentiatie van mesenchymale stamcellen uit de infrapatellaire vetpad van de geitenstikkingsverbinding

DOI:

10.3791/63617

⸱

2 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infrapatellaire vetkussen mesenchymale stamcellen (IFP-MSC's) kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit de infrapatellaire vetschijf van het kniegewricht. Ze vermenigvuldigen zich goed in vitro, vormen CFU-F-kolonies en differentiëren in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen. Hierin wordt de methodologie gegeven voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC's van geitenstikselgewricht.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De IFP, aanwezig in het kniegewricht, dient als een veelbelovende bron van MSC's. De IFP is een gemakkelijk toegankelijk weefsel omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid tijdens artroscopische procedures en knievervangende operaties. Bovendien wordt de verwijdering ervan geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats. Recente studies hebben aangetoond dat IFP-MSC's hun proliferatiecapaciteit niet verliezen tijdens in vitro expansie en een leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentieel hebben. IFP-MSC's bezitten een superieur chondrogene differentiatiepotentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC's (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's). Hoewel deze cellen gemakkelijk te verkrijgen zijn bij oudere en zieke patiënten, is hun effectiviteit beperkt. Daarom is het gebruik van IFP-MSC's van gezonde donoren belangrijk om hun werkzaamheid in biomedische toepassingen te bepalen. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn om fundamenteel begrip mogelijk te maken. Grote dieren zoals honden, paarden, schapen en geiten spelen een cruciale rol in translationeel onderzoek. Onder deze zou de geit een voorkeursmodel kunnen zijn, omdat het verstikkingsgewricht van de geit de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht. Bovendien kan goat-IFP voldoen aan de hogere MSC-aantallen die nodig zijn voor weefselregeneratietoepassingen. Bovendien maken lage kosten, beschikbaarheid en naleving van de 3R-principes voor dieronderzoek ze een aantrekkelijk model. Deze studie toont een eenvoudig protocol voor het isoleren van IFP-MSC's van het verstikkingsgewricht van geiten en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie. De aseptisch geïsoleerde IFP van de geit werd gewassen, gehakt en enzymatisch verteerd. Na filtratie en centrifugatie werden de verzamelde cellen gekweekt. Deze cellen waren adherent, hadden MSC-achtige morfologie en vertoonden een opmerkelijk clonogene capaciteit. Verder onderscheidden ze in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoonde. Concluderend toont de studie de isolatie en uitbreiding van MSC's, die potentieel tonen in weefseltechnologie en regeneratieve geneeskundetoepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een aantrekkelijke kandidaat voor celgebaseerde therapieën in de regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze kunnen worden geoogst uit verschillende weefselbronnen zoals beenmerg, navelstreng, placenta, tandpulp en onderhuids vetweefsel3. Aangezien de beschikbaarheid van stamcellen bij volwassenen echter beperkt is en hun isolatieprocedure vaak invasief is (wat resulteert in morbiditeit op de donorplaats), is het wenselijk om een alternatieve stamcelbron te hebben die deze uitdagingen kan omzeilen.

Het kniegewricht is een depot van verschillende celtypen, zoals infrapatellaire vetkussen-afgeleide MSC's, synoviale membraan-afgeleide MSC's, synoviale vloeistof-afgeleide MSC's, ligament fibroblasten, gewrichts chondrocyten, enz. 4,5,6. Deze cellen hebben het potentieel om op grote schaal te worden onderzocht in musculoskeletale weefseltechnologie-gebaseerd onderzoek. Daarom zou het kniegewricht een mogelijke en betrouwbare bron kunnen zijn van meerdere soorten MSC's. Vetdepot in het kniegewricht, bekend als de infrapatellar fat pad (IFP) of Hoffa's fat pad, is een veelbelovende en alternatieve keuze van MSC depot. De IFP is een relatief gemakkelijk toegankelijke en klinisch haalbare bron van MSC's, omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid als chirurgisch afval tijdens knieartroscopie of open kniechirurgie. Verwijdering van de IFP wordt geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats, waardoor het ook een aantrekkelijke weefselbron is. Hoewel ze een vergelijkbaar fenotypisch profiel hebben, hebben MSC's van IFP (IFP-MSC's) een verbeterd clonogene potentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSC's)6 en een betere proliferatieve capaciteit in vergelijking met subcutane adipose-afgeleide stamcellen (ADSC's)7. Interessant is dat in vergelijking met synoviale vloeistof-afgeleide MSC's (SF-MSC's), IFP-MSC's hun proliferatieve capaciteit niet verliezen bij late passages, noch neemt de verdubbelingstijd toe bij late passages. Dit suggereert dat IFP-MSC's tijdens celexpansie een voldoende groot aantal cellen kunnen bereiken voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen zonder hun proliferatiesnelheid in gevaar te brengen8. Recente studies hebben ook gesuggereerd dat IFP-MSC's een superieur chondrogene differentiatiepotentieel bezitten in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC's (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide MSC's (ADSC's), waarschijnlijk vanwege hun anatomische nabijheid tot gewrichtskraakbeen, wat wijst op hun geschiktheid voor kraakbeenweefseltechnologie 6,7,9,10. Bovendien bezitten ze ook leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentiaal11. Intra-articulaire injectie van IFP-MSC's heeft aangetoond dat het pijn vermindert en de functies van het kniegewricht verbetert bij patiënten met artrose (OA)12,13. Verder zijn sterke immunosuppressieve reacties en verbeterde immunomodulerende eigenschappen van IFP-MSC's in aanwezigheid van inflammatoire cytokines tijdens pathologische aandoeningen ook gemeld6.

IFP-MSC's zijn een veelbelovende en alternatieve bron van MSC's; hun therapeutische voordeel in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde wordt echter relatief minder onderzocht. De bestaande studies over IFP-MSC's hebben voornamelijk gebruik gemaakt van cellen van menselijke donoren. Onder deze, een paar recente studies hebben IFP-MSC's van gezonde menselijke donoren (niet-artritis patiënten, leeftijd 17-60 jaar)6,14 onderzocht, terwijl de meeste studies IFP-MSC's hebben gebruikt van oudere patiënten die een totale knievervangende operatie ondergaan (zieke patiënten, leeftijd 70-80 jaar). Aangezien bekend is dat zowel leeftijd als ziekte de normale werking van stamcellen veranderen (verminderd aantal en verlies van functioneel potentieel), kan dit mogelijk leiden tot inconsistenties in de uitkomst van de op MSC gebaseerde studies 7,15,16,17. Daarnaast vormt het gebruik van IFP-MSC's van patiënten met pathofysiologische aandoeningen (bijv. artritis en obesitas) ook problemen om de basiskenmerken van gezonde cellen in vitro te begrijpen, waardoor het een beperkende factor is bij de ontwikkeling van op MSC's gebaseerde therapieën. Om deze problemen op te lossen, is het gebruik van IFP-MSC's van gezonde donoren van vitaal belang. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn. In dit opzicht zijn er een paar studies waarbij IFP is geïsoleerd uit muizen18. Vanwege de kleine omvang van het vetkussen bij normale muizen, zijn vetweefsels van meerdere dieren echter gecombineerd om voldoende weefsel te krijgen om uitgebreide experimentele procedures uit te voeren19. Daarom is er behoefte aan een groot diermodel, dat zou kunnen voldoen aan de eis voor het hogere aantal cellen en tegelijkertijd zou kunnen voldoen aan de 3R-principes (verfijnen, vervangen en verminderen) in dieronderzoek20. Het gebruik van grote dieren heeft belangrijke implicaties in translationeel onderzoek. Specifiek, in musculoskeletale weefseltechnologie, is een reeks grote dieren zoals honden, varkens, schapen, geiten en paarden onderzocht21. Geit (Capra aegagrus hircus) is een uitstekende keuze van grote dieren omdat het verstikkingsgewricht de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht 22,23,24. De subchondrale bottrabeculaire structuur en subchondrale botdikte van geiten zijn vergelijkbaar met mensen, en het aandeel van het kraakbeen tot bot is ook gemeld dat het dicht bij de mensligt 21. Bovendien zijn geiten over de hele wereld op grote schaal gedomesticeerd, waardoor ze gemakkelijk beschikbaar zijn als ze skeletachtig volwassen zijn. Verder hebben lage onderhoudskosten en eenvoudige bediening ze tot een aantrekkelijk diermodel voor onderzoek gemaakt22.

In deze studie wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van IFP-MSC's uit het verstikkingsgewricht van Capra aegagrus hircus (geit) en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie aangetoond. De geïsoleerde cellen zijn adherent, hebben MSC-achtige morfologie, vormen CFU-F (kolonievormende eenheid-fibroblast) kolonies en bezitten adipogene, chondrogene en osteogene differentiatiepotentialen. Daarom tonen IFP-MSC's potentieel als een alternatieve bron van MSC's voor biomedische toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol is gebaseerd op de isolatie van IFP-MSC's van geiten. Geiten-IFP en bloed werden verzameld in een lokaal slachthuis. Aangezien dergelijke weefselcollecties buiten het bereik van een institutionele commissie voor dierethiek vallen, was ethische goedkeuring niet vereist.

1. Isolatie van IFP-MSC's uit het femorotibiale gewricht van geitenknie

  1. Verzamel het femorotibiale gewricht (monster) van de geit dat ~ 15 cm elk van de femur- en tibiale gebieden van de achterpoten omvat. Plaats het monster onmiddellijk in een gesteriliseerde monsterverzamelingsdoos en bewaar het bij 4 °C voor transport naar het laboratorium voor verdere verwerking. Verwerk de monsters aseptisch in een bioveiligheidskast, met behulp van gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen gedurende de hele procedure (figuur 1, stap 1).
  2. Plaats het monster op een petrischaaltje van 150 mm en spoel het grondig af met geautoclaveerde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met antibiotica (5 μg/ml amfotericine B, 200 U/ml penicilline-streptomycine en 50 μg/ml ciprofloxacine) om besmetting te voorkomen. Zorg er altijd voor dat het monster gehydrateerd wordt gehouden met PBS.
  3. Onderzoek zorgvuldig de anatomische gebieden van het monster. Voor gemakkelijke toegang tot het gewrichtskapsel, moet u ervoor zorgen dat de extra weefsels van beide lange botten volledig worden verwijderd (figuur 1, stap 2).
  4. Om dit te bereiken, houdt u eerst het eindoppervlak van het dijbeen met één hand vast en snijdt u met een scherpe schaar in de lengterichting naar het gewricht. Verwijder de omliggende spieren en vetweefsel uit het bot tijdens het proces. Zorg ervoor dat het weefsel rond het directe gewrichtskapsel in eerste instantie ongestoord blijft.
  5. Maak op dezelfde manier nog een incisie aan het tibiale uiteinde van het monster en verwijder de spieren en het vetweefsel uit het tibiale bot. Zorg ervoor dat zowel de lange botten volledig bloot liggen als het gewrichtskapsel duidelijk zichtbaar is na deze stap (figuur 1, stap 3).
  6. Maak vervolgens een incisie aan weerszijden van het synoviummembraan om het scharnierende gewricht open te snijden (figuur 1, stap 4). Knip de patella los van zowel het synoviummembraan als de patellabanden met behulp van een verse partij gesteriliseerde scharen en tangen. Bewaar de gescheiden patella onmiddellijk in een petrischaal met PBS (figuur 1, stap 5).
  7. Verwijder het volledige vetkussen dat aanwezig is op het binnenoppervlak van de patella met een schaar en een tang en verzamel het vetkussen in een andere verse petrischaal (figuur 1, stap 6). Gehakt het verzamelde vetkussen met behulp van een scalpel. Neem andere chirurgische hulpmiddelen op (bijv. Scharen of chirurgische messen) zoals vereist om de kleinst mogelijke vetstukjes / segmenten van ~ 2-3 mm te verkrijgen.
    OPMERKING: Goed hakken is van cruciaal belang om te resulteren in een goede opbrengst van cellen. Houd het weefsel altijd gehydrateerd en laat het in geen enkel stadium van de isolatieprocedure drogen.
  8. Breng het gehakte weefsel met behulp van een spatel over naar een centrifugebuis van 50 ml en was het met PBS aangevuld met antibiotica bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten in een reageerbuismenger. Herhaal de wasstap 3x, elk 15 min.
  9. Voor enzymatische spijsvertering incubeer je het gehakte weefsel (~ 5 g) in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM lage glucose) met 1,5 mg / ml type II collagenase (20 ml) en aangevuld met 2% FBS bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
    OPMERKING: Voer de spijsvertering uit in een reageerbuismenger met ~ 15 rotaties per minuut (RPM).
  10. Zuig het verteerde weefsel zorgvuldig op en filter het door een celzeef (70 μm) om onverteerde weefsels te verwijderen. Centrifugeer het filtraat in een centrifugebuis van 15 ml bij 150 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en was de pellet minstens 2x met DMEM lage glucose.
    OPMERKING: Giet het verteerde weefsel langzaam in de zeef om morsen te voorkomen. Gebruik een centrifugebuis met een laag volume (15 ml) om een goede pellet te krijgen.
  11. Resuspendatie van de verkregen celpellet in volledige DMEM-media (DMEM lage glucose aangevuld met 10% FBS en antibiotica [2,5 μg/ml amfotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine]), in de volgende stappen uitbreidingsmedia genoemd in het protocol.
  12. Zaai de cellen op petrischalen van 150 mm en kweek ze in de expansiemedia aangevuld met 5 ng /ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF) en 50 μg / ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator om de cellen te laten hechten en vermenigvuldigen. Controleer dagelijks de aanhechting en groei van de cellen.

2. Onderhoud en uitbreiding van geïsoleerde cellen

  1. Verander de media om de 3 dagen totdat de cellen confluent worden. Voeg verse 5 ng/ml bFGF en 50 μg/ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout rechtstreeks toe aan de petrischaal telkens wanneer de media worden vervangen. Nadat de cellen 80% -90% confluent zijn geworden, subcultureer je de cellen.
    OPMERKING: Verwijder de niet-adherente entiteiten tijdens elke mediawijziging. In het geval dat oliedruppels worden gezien na 3 dagen incubatie, was de cellen met PBS 1x en voeg vervolgens verse media toe aan de petrischaal. Ga door met PBS wassen voordat elke mediawissel plaatsvindt totdat de oliedruppels volledig zijn verwijderd.
  2. Sub-kweken van cellen: Verwijder de expansiemedia uit de petrischaal en was de cellen 1x met PBS. Voeg 4 ml 0,25% trypsine/EDTA toe aan het gerecht en incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende 4 minuten.
    OPMERKING: Confluency (80% -90%) wordt binnen 7 dagen bereikt. Verdeel de trypsine/EDTA-oplossing gelijkmatig over het gehele oppervlak van de petrischaal tijdens trypsinisatie.
  3. Maak de cellen los door op de plaat aan de zijkant te tikken en onder een microscoop te observeren om te bevestigen dat alle cellen zijn losgemaakt. Neutraliseer de trypsine na toevoeging van een gelijk volume (4 ml) expansiemedia.
  4. Verzamel de gedissocieerde cellen met behulp van een pipet in een verse polypropyleenbuis van 15 ml en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in het gewenste volume expansiemedia.
  5. Tel de cellen met behulp van de standaard celtelmethode en subcultuur in petrischalen van 150 mm met een zaaidichtheid van 1 x 104 cellen /cm2 voor verdere uitbreiding. Gebruik voor alle testen een confluente monolaag van cellen met passagenummer P2-P5.
    OPMERKING: Cryopreserveer de overtollige cellen.

3. Evaluatie van het clonogene vermogen van IFP-MSC's met behulp van kolonievormende assay (CFU-F)

  1. Voor CFU-F-assay, zaai de cellen in expansiemedia in een 6-well weefselkweekplaat met een zaaidichtheid van 50-100 cellen / cm2. Voeg media toe om een eindvolume van 3 ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Optimaliseer de celconcentratie voor assays en behandeling.
  2. Kweek de cellen gedurende 12 dagen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator onder standaard kweekomstandigheden om de cellen kolonies te laten vormen. Verander de media elke 3 dagen. Wees zachtaardig tijdens het veranderen van de media.
  3. Spoel na 12 dagen de kolonies 1x met PBS en fixeer ze met 20% methanol gedurende 20 minuten op RT. Kleur de kolonies met kristalvioletkleurstof (0,5% [w / v] in 20% methanol) gedurende 20 minuten bij RT. Tel de afzonderlijke kolonies met behulp van een omgekeerde microscoop.
    OPMERKING: Een kolonie wordt gedefinieerd als een cluster van meer dan 50 cellen.

4. Differentiatiepotentieel van IFP-MSC's

  1. Induceren van adipogene differentiatie van IFP-MSC's
    1. Om adipogenese te induceren, zaait u de cellen met een dichtheid van 25 x 103 cellen / cm2 in een weefselkweekplaat met 24 putten. Voeg media toe om een eindvolume van 500 μL te verkrijgen. Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator .
    2. Vervang op een dag na de confluentie het expansiemedium door 500 μL adipogene differentiatiemedia. Het duurt ongeveer 2 dagen voordat de cellen confluency bereiken.
    3. Bereid de adipogene differentiatiemedia voor door expansiemedia (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg / ml amfotericine, 100 U / ml penicilline-streptomycine en 25 μg / ml ciprofloxacine) aan te vullen met 25 mM D (+) -glucose, 10 μg / ml insuline, 1 μM dexamethason en 100 μM indomethacine.
      OPMERKING: Differentiatiemedia zijn onstabiel bij 4 °C na 1 maand; bereid daarom de media voor wanneer en wanneer dat nodig is.
    4. Beschouw de cellen gekweekt in de expansiemedia aangevuld met 25 mM D (+) glucose als niet-geïnduceerde controles. Verander de media elke 3 dagen gedurende 14 dagen. Was aan het einde van de 14 dagen de cellen 1x met PBS. Fixeer de cellen met neutraal gebufferd formaline (NBF; 4 % formaldehyde in PBS) gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    5. Was na fixatie de putjes 1x met gedestilleerd water en incubeer de cellen vervolgens met 60% isopropanol gedurende 5 minuten op RT. Na het verwijderen van isopropanol, kleur de lipidedruppels door de cellen te incuberen met 500 μL van de werkoplossing van Oil Red O kleurstof gedurende 5 minuten bij RT. Was de putjes 1x met gedestilleerd water om de ongebonden kleurstof te verwijderen en beeld de cellen af met behulp van een omgekeerde microscoop.
      OPMERKING: Bereid de stamoplossing van Oil Red O (ORO) door 300 mg ORO op te lossen in 100 ml 99% isopropanol. Om de werkoplossing te bereiden, mengt u drie delen voorraad ORO en twee delen gedestilleerd water en laat u het gedurende 10 minuten op RT mengen. Filtreer het mengsel met 0,2 μm filtreerpapier. De werkoplossing is klaar voor gebruik. De stamoplossing kan 1 maand in het donker bij RT worden bereid en bewaard, terwijl de werkoplossing vóór elk gebruik /kleuring vers moet worden bereid.
  2. Chondrogene differentiatie van IFP MSC's induceren
    1. Isolatie van geitenplasma:
      1. Bereid 3,4% (g/v) natriumcitraat in gedestilleerd water. Voeg 5 ml van de bereide natriumcitraatoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 ml.
      2. Verzamel 45 ml vers geïsoleerd geitenbloed in dezelfde buis. Kantel de buis onmiddellijk om het bloed grondig met natriumcitraat te mengen om stolling te voorkomen en transporteer het naar het laboratorium bij 4 °C.
      3. Centrifugeer het verzamelde geitenbloed bij 1000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Breng het supernatant (plasma) over in een verse buis in een bioveiligheidskast. Filtreer het plasma door 0,2 μm filters, aliquot, en bewaar bij -20 °C voor verder gebruik.
        OPMERKING: Houd de temperatuur van 2-8 °C aan tijdens het hanteren van de monsters. Het is belangrijk om de vries-dooicycli van plasma te minimaliseren.
    2. Kweek de geëxpandeerde cellen tot 80% -90% confluency, dissocieer de cellen met behulp van trypsine / EDTA-oplossing en pelleteer de cellen op 150 x g gedurende 5 minuten in een centrifugebuis van 15 ml. Resuspensie de pellet in geitenplasma met een dichtheid van 2 x 106 cellen per 50 μL plasmaoplossing.
    3. Voeg een druppel plasmabevattende cellen (50 μL) toe aan een gesteriliseerde petrischaal van 90 mm en voeg vervolgens calciumchloride toe in een eindconcentratie van 0,3% (g/v). Meng goed om cross-linked plasma hydrogel te fabriceren.
    4. Incubeer de gefabriceerde hydrogel bij 37 °C gedurende 40 min. Breng na incubatie de hydrogels over naar 24-well weefselkweekplaten met chondrogene media.
    5. Bereid chondrogene media door DMEM lage glucose aan te vullen met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonzuur (HEPES), 1,25 mg/ml runderserumalbumine (BSA), 1 mM proline, 50 μg/ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout, 100 nM dexamethason, 1x insuline, transferrine, natriumseleniet + linolzuur-BSA (ITS+1), antibiotica (2,5 μg/ml amhotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine), en 10 ng/ml transformerende groeifactor- β1 (TGF-β1).
    6. De hydrogels gekweekt in volledige DMEM-media (DMEM lage glucose met 10% FBS en antibiotica [2,5 μg/ml amfotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine]) zonder TGF-β1 worden beschouwd als niet-geïnduceerde controles. Verander de media elke 3 dagen gedurende 14 dagen.
    7. Na 14 dagen chondrogene differentiatie van cellen in plasmahydrogels, wast u de hydrogels met PBS 3x gedurende 5 minuten elk en fixeert u de monsters vervolgens gedurende 3 uur in NBF.
      LET OP: Formaldehyde is een potentieel carcinogeen en kan irritatie van de neus, keel en longen veroorzaken bij inademing. Voer alle procedures met betrekking tot formaldehyde uit in een zuurkast.
    8. Verwijder NBF, was de hydrogels met PBS 3x gedurende 5 minuten elk en incubeer vervolgens in 35% (w / v) sucrose op RT een nacht om de oplossing volledig in de monsters te laten opnemen. Acclimatiseer de hydrogels in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding gedurende 3 uur. Integreer de monsters in OCT-verbinding met behulp van siliconenmalen onder vloeibare stikstof.
    9. Snijd de monsters op een dikte van 10-12 μm op met gelatine beklede glasglaasjes met behulp van een cryotoom en bewaar ze bij -20 °C voor toekomstig gebruik. Om de aanwezigheid of afzetting van de extracellulaire matrix na chondrogene differentiatie te onderzoeken, kleurt u de secties met Alcian Blue en Safranin-O-kleurstof, die binden aan gesulfateerde glycosaminoglycanen.
      OPMERKING: Om Alcian Blue kleurstof te bereiden, lost u 1 g Alcian Blue-kleurstof op in 100 ml 0,1 N HCl en mengt u grondig in een reageerbuismenger een nacht. De oplossing kan 1 maand in het donker bij RT worden bewaard. Om Safranin-O-kleurstof te bereiden, lost u 0,1 g Safranin-O-kleurstof op in 100 ml gedestilleerd water en mengt u grondig in een reageerbuismenger een nacht.
    10. Voor Alcian Blue kleuring, was de hydrogel secties 1x met gedestilleerd water gedurende 5 min. Om de secties te repareren, voegt u 4% NBF toe aan de dia's en incubeert u gedurende 30 minuten.
    11. Was de secties 1x met gedestilleerd water gedurende 5 min en vervolgens 2x met 0,1 N HCl gedurende 30 s elk. Verwijder de HCl en droog de dia's voorzichtig af met tissuepapier. Voeg de bereide Alcian Blue-vlek toe aan de secties en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer.
    12. Was de ongebonden kleurstof met 0,1 N HCl en destilleer vervolgens 3 min. Droog de secties uit in absolute ethanol, verwijder ze in xyleen en monteer ten slotte de gekleurde secties in een harsachtig medium voor beeldvorming.
    13. Voor Safranin-O-kleuring wast u de hydrogelsecties 1x gedurende 5 minuten met gedestilleerd water. Om de secties te repareren, voegt u 4% NBF toe aan de dia's en incubeert u gedurende 30 minuten. Was de secties 1x met gedestilleerd water gedurende 5 minuten en dompel de dia's vervolgens 10-15 s in 1% azijnzuur. Droog de dia's voorzichtig af met tissuepapier.
    14. Voeg bereide Safranin-O kleurstof toe aan de secties en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Was de ongebonden kleurstof met 100% ethanol. Dompel de dia's gedurende 5 minuten in 100% ethanol. Droog de dia's aan de lucht, maak ze vrij in xyleen en monteer ten slotte de gekleurde secties in een harsachtig medium voor beeldvorming.
  3. Induceren van osteogene differentiatie van IFP MSC's
    1. Om osteogene differentiatie te induceren, trypsiniseert u de cellen, zoals eerder vermeld (stap 2.2.). Zaai de cellen met een dichtheid van 3 x 103 cellen/cm2 in een 24-well weefselkweekplaat. Voeg media toe om een eindvolume van 500 μL te verkrijgen. Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Vervang 1 dag na het zaaien de expansiemedia door 500 μL osteogene differentiatiemedia.
    2. Bereid de osteogene media voor door expansiemedia (DMEM + 10% FBS +2,5 μg/ml amfotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine) aan te vullen met 25 mM D (+)-glucose, 10 nM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat, 50 μg/ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout en 10 nM vitamine D3.
      OPMERKING: De cellen gekweekt in expansiemedia aangevuld met 25 mM D (+) glucose worden beschouwd als niet-geïnduceerde controles.
    3. Verander de osteogene media elke 3 dagen gedurende 14 dagen of 28 dagen. Meet aan het einde van 14 dagen de mate van osteogenese door alkalische fosfatase (ALP) kleuring.
      OPMERKING: Om het substraat voor te bereiden op ALP-kleuring, lost u één 5-broom-4- chloor-3-indolylfosfaat (BCIP) / nitroblauw tetrazolium (NBT) tablet op in 10 ml gedestilleerd water in een centrifugebuis van 15 ml. Laat de tablet volledig oplossen. De substraatoplossing is klaar voor gebruik. Omdat de substraatoplossing niet langer kan worden bewaard, op basis van behoefte, breekt u de tablet doormidden en lost u deze op in 5 ml gedestilleerd water. Om de permeabilisatiebuffer voor te bereiden, voegt u trisbuffer (100 mM) en magnesiumchloride (5 mM) toe aan gedestilleerd water. Voeg Triton X100 (0,1%) toe aan de oplossing en laat deze oplossen. Stel de pH van de oplossing in op 9,25-9,75.
    4. Voor ALP-kleuring, na 14 dagen inductie, verwijder de media en was de cellen met PBS. Fixeer de cellen met NBF (4%) gedurende 1 minuut. Was de cellen met PBS en permeate met behulp van de voorbereide lysisbuffer gedurende 2-3 minuten.
    5. Voeg 500 μL van de bereide substraatoplossing toe aan de cellen en laat deze gedurende 15 minuten tot 1 uur incuberen, afhankelijk van het expressieniveau. Controleer de ontwikkeling van paars/blauwe kleur tussendoor.
    6. Verwijder de substraatoplossing en was met gedestilleerd water. Beeld de gekleurde cellen af met een omgekeerde microscoop.
    7. Meet aan het einde van 28 dagen de mate van verkalking na osteogene inductie door Alizarin Red-S-kleuring.
      OPMERKING: Om de Alizarin Red-S kleuringsoplossing (40 mM) te bereiden, lost u 2 g Alizarin Red-S op in 100 ml gedestilleerd water en past u de pH aan op 4,1-4,3 met HCl of NH4OH. Filtreer de oplossing door een membraan van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C in het donker. De pH van de oplossing is belangrijk; daarom wordt aanbevolen om een nieuwe oplossing te maken of om de pH van de oplossing opnieuw te meten als deze meer dan 1 maand oud is.
    8. Voor Alizarin Red-S-kleuring, na 28 dagen inductie, verwijder de media en was de cellen 1x met koude PBS. Bevestig de cellen met 70% ethanol gedurende 1 uur bij 4 °C.
    9. Verwijder het fixeermiddel en was de cellen 2x met gedestilleerd water. Verwijder het water volledig en voeg 1 ml Alizarin Red-S-oplossing toe aan elke put.
    10. Incubeer de cellen met de oplossing gedurende 1 uur bij RT en breng de cellen in beeld met behulp van een omgekeerde microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatie van IFP-MSC's uit het femorotibiale gewricht van de geit
De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van IFP-MSC's van het verstikkingsgewricht van een geit zijn weergegeven in figuur 1. Het vetkussen dat aanwezig was in het binnenste niet-articulerende oppervlak van de patella werd verwijderd, gehakt en enzymatisch verteerd. De IFP-MSC's werden met succes geïsoleerd en in vitro gekweekt (figuur 2A).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode voor de isolatie van MSC's van geiten-IFP opgenomen. Cellen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt in onze eerdere studies voor in vitro weefselregeneratie. Er werd waargenomen dat de geïsoleerde cellen proliferatief waren, reageerden op verschillende groeifactoren en hun biologische activiteit behielden wanneer ze werden gezaaid op elektrospunvezels en steigers25,26

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SH erkent de steun van de Institute Post-Doctoral Fellowship van IIT Kanpur en SYST-subsidie van DST (SEED Division) (SP / YO / 618/ 2018). AM erkent het Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) voor een Instituut fellowship. DSK erkent Gireesh Jankinath Chair Professorship en Department of Biotechnology, India, voor financiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH en DSK bedanken het Mehta Family Centre for Engineering in Medicine bij IIT-Kanpur voor hun genereuze steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
β-glycerofosfaatSigma-AldrichG9422-10G10 mM
0,25% Trypsin- 0,02% EDTAHi-MediaTCL049
15-mL centrifuge tubeCorning
2-Fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzoutSigma49752-10G50 µg/mL
2-PropanolSigma-AldrichI9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 mM
50-mL centrifuge tubeCorning
Alcian BlauwHi-MediaRM471Voor sulfated glycosaminoglycans kleuring
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GVoor calcium afzetting
Amphotericin BHiMediaA0112,5 µg/mL
Basic fibroblast groeifactor (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 ng/mL
BCIP/NBT ALP SubstraatSigmaB5655-5TABVoor ALP kleuring
Biologische veiligheidskast
BSAHiMediaMB-083Lange naam: bovien serum albumine (1,25 mg/mL )
Cel zeefHiMediaTCP-18270 µm
CentrifugeREMI
CiprofloxacineRANBAXY LAB. LimitedB17407T12,5 µg/mL
Kristal VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-glucoseMerck1.94925.052125 mM
DexamethasonSigma-AldrichD29151 µM
DMEM LGSIGMAD5523Lange naam: Dulbecco’s Gemodificeerd Arendsmedia Laag Glucose
EthanolMerck100983
FBSGibco10270Lange naam: foetaal bovien serum
Formaldehyde oplossing 37%-41%Merck61780805001730
IndomethacineSigma-AldrichI7378100 µM
InsulinSigma-AldrichI927810 µg/mL
Omgekeerd microscoopNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLLange naam: insuline, transferrine, natriumseleniet + linoleic-BSA
L-ProlineHiMediaTO-109-25G1 mM
MagnesiumchlorideMerck61751605001730Voor lysis buffer
MethanolMeck1.07018.2521
Micropipetten en steriele tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)Thermoscientific
MUSE Cel analyzerMerck MilliporeVoor celtelling
OCT compoundTissue-Tek4583Lange naam: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O kleurstofS D Fine-Chem Limited54304Voor lipide vacuolen kleuring
Penicilline-StreptomycineHiMediaA007100 U/mL
Petri schotels (150 mm en 90 mm)NEST
Safranine OS D Fine-Chem Limited50240Voor sulfated glycosaminoglycans kleuring
NatriumcitraatSigma-AldrichC34343,4 % (w/v)
Steriele schaar, pincet en scalpelsVoor isolatie van IFP-MSC
SucroseMerck1.94953.052135 % (w/v)
TGF-β1Sino BiologicalsLange naam: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Weefselkweek incubator 37 °C, 5% CO2Thermoscientific
Tris bufferMerck61771405001730Voor lysis buffer
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632Voor lysis buffer
Type II collagenaseGibco171010151,5 mg/mL
Vitamine D3SigmaC9756-1G10 nM
Putjes (6 -WP en 24-WP)NEST

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  2. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22(2019).
  3. Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349(2020).
  4. Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
  5. Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
  6. Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864(2019).
  7. Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
  8. Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295(2016).
  9. Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873(2016).
  10. Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
  11. Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
  12. Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
  13. Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
  14. Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44(2021).
  15. Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323(2019).
  16. Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
  17. Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
  18. Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
  19. Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
  20. Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
  21. Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
  22. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19(2016).
  23. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  24. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  25. Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256(2021).
  26. Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
  27. Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
  28. Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
  29. Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
  30. Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
  31. Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
  32. Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
  33. Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
  34. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  35. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  36. Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
  37. Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  38. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  39. Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
  40. Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
  41. Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van stamcellencel expansiechondrogene differentiatieosteogene differentiatieadipogene differentiatieregeneratieve geneeskundetissue engineering

Gerelateerde artikelen