Methodenartikel

Formuleren en karakteriseren van een op exosomen gebaseerd dopamine-dragersysteem

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wilden we een formulering verkrijgen door dopamine te laden van de geïsoleerde exosomen van stamcellen uit Wharton's gelei mesenchymale stamcellen. Exosoomisolatie en karakterisering, het laden van geneesmiddelen in de resulterende exosomen en de cytotoxische activiteit van de ontwikkelde formulering worden in dit protocol beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen tussen 40 en 200 nm groot vormen de kleinste subgroep van extracellulaire blaasjes. Deze bioactieve blaasjes die door cellen worden uitgescheiden, spelen een actieve rol bij intercellulaire lading en communicatie. Exosomen worden meestal aangetroffen in lichaamsvloeistoffen zoals plasma, hersenvocht, urine, speeksel, vruchtwater, colostrum, moedermelk, gewrichtsvloeistof, sperma en pleurazuur. Gezien de grootte van exosomen, wordt gedacht dat ze een belangrijke rol kunnen spelen bij ziekten van het centrale zenuwstelsel, omdat ze de bloed-hersenbarrière (BBB) kunnen passeren. Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een op exosomen gebaseerd nanodragersysteem door dopamine in te kapselen in exosomen geïsoleerd uit Wharton's gelei mesenchymale stamcellen (WJ-MSC's). Exosomen die het karakteriseringsproces doorstonden, werden geïncubeerd met dopamine. De met dopamine beladen exosomen werden aan het einde van de incubatie opnieuw gekarakteriseerd. Met dopamine beladen exosomen werden onderzocht in tests voor de afgifte van geneesmiddelen en cytotoxiciteit. De resultaten toonden aan dat dopamine met succes kon worden ingekapseld in de exosomen en dat de met dopamine beladen exosomen de levensvatbaarheid van fibroblasten niet beïnvloedden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen, bioactieve blaasjes met belangrijke kenmerken, variëren in grootte van 40 nm tot 200 nm. Exosomen zijn afkomstig van het celmembraan en worden gevormd door het vrijkomen van de endosomen1. Deze structuren dienen als cel-tot-cel communicatoren en interageren met naburige cellen om de overdracht van actieve moleculen te vergemakkelijken. Exosomen kunnen uit veel verschillende bronnen worden geïsoleerd. Deze omvatten lichaamsvloeistoffen zoals plasma, urine, hersenvocht, speeksel, evenals cellijnen die onder in vitro omstandigheden zijn gekweekt. Exosomen spelen een belangrijke rol bij de eliminatie van zenuwbeschadiging, dankzij de biomacromoleculen die ze bevatten, zoals lipiden, eiwitten en nucleïnezuren. Glia, de ondersteunende cellen van het zenuwstelsel3, brengen eiwitten en micro-RNA's over naar de axonen van neuronen via exosomen4.

Lipiden die de myelineschede vormen, die een kenmerkend kenmerk zijn van zenuwgeleiding, worden ook vrijgegeven uit oligodendrocyten via exosomen 4,5. Exosomen zijn ook betrokken bij processen zoals synaptische plasticiteit, neuronale stressrespons, cel-celcommunicatie en neurogenese in de hersenen 6,7. Het feit dat exosomen nano-dimensies hebben, stelt ze in staat om door de BBB te gaan. Er is een speciale overgangsroute van de interstitiële vloeistof naar de cerebrospinale vloeistof na penetratie van dit membraan8. Dankzij hun oppervlakte-eigenschappen kunnen exosomen efficiënt interageren met doelcellen als een medicijnafgiftesysteem en de geladen medicijnen actief afleveren.

Door de expressie van verschillende adhesieve eiwitten (tetraspanines en integrinen) op het oppervlak van exosomen, kunnen deze extracellulaire blaasjes gemakkelijk interageren en versmelten met gastheercelmembranen9. Er wordt gedacht dat exosomen kunnen worden gebruikt als een medicijnafgiftesysteem, vooral bij de behandeling van ziekten van het centrale zenuwstelsel vanwege hun vermogen om de BBB binnen te dringen en hun oppervlakte-eigenschappen. Van mesenchymale stamcellen (MSC) afgeleide exosomen hebben een lager risico op immuunafstoting in vergelijking met allogene cellulaire therapieën, en in dit opzicht kunnen ze een belangrijk onderdeel zijn van celvrije behandelingstoepassingen10.

Dopamine is een molecuul waarvan het tekort in de hersenen het kenmerkende kenmerk is van de ziekte van Parkinson (PD), dat met de dag verergert11,12,13. Het is bekend dat PD geassocieerd is met degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra van het mesencephalon en verlies van motorneuronfuncties14,15. De dood van dopaminerge neuronen verhindert de toevoer van de neurotransmitter dopamine naar het hersenstriatum. Dit resulteert op zijn beurt in het ontstaan van PD-specifieke symptomen16. Deze symptomen van PD zijn bradykinesie, houdingsinstabiliteit, stijfheid en vooral rusttremor12,13. Hoewel PD meer dan twee eeuwen geleden voor het eerst werd beschreven, zijn er nog steeds studies gaande om de pathologie en etiologie van de ziekte te begrijpen en wordt momenteel aangenomen dat PD een complexe systemische ziekte is17. Er wordt voorspeld dat dopamine-deficiëntie optreedt en klinische PD-symptomen worden waargenomen wanneer meer dan 80% van de neuronen degenereert18. Bij de behandeling van de ziekte wordt de voorkeur gegeven aan onvolledige dopaminesuppletie om motorische symptomen te verminderen. In vivo studies hebben aangetoond dat directe infusie van dopamine in de hersenen de symptomen bij dieren aanzienlijk vermindert19. Dopamine-precursoren zoals L-DOPA (L-3,4-dihydroxyfenylalanine) en dopaminereceptorgeneesmiddelen worden in de kliniek gebruikt omdat de directe infusie van dopamine in de hersenen bij mensen niet mogelijk is en dopamine die het systeem binnenkomt de BBB20 niet kan passeren. Dit soort medicijnen verliezen na verloop van tijd hun effectiviteit. Er is echter nog steeds geen curatieve behandelingsaanpak voor PD. Daarom is er een enorme noodzaak om nieuwe therapeutische strategieën en behandelingsmodaliteiten te ontwikkelen om de pathofysiologie van de ziekte te onthullen en de impact van PD op patiënten te verminderen.

Op exosomen gebaseerde studies hebben onlangs de aandacht getrokken voor het verzamelen van informatie over zowel therapeutische benaderingen als pathologieën van ziekten van het zenuwstelsel. Van MSC-afgeleide exosomen is aangetoond dat ze ontstekingen bij zenuwbeschadiging verminderen en bijdragen aan neuronale regeneratie21,22,23. Bovendien is gemeld dat MSC-afgeleide exosoomsecretomen apoptose verminderen door neurotrofe en neuroprotectieve effecten te vertonen, vooral op dopaminerge neuronen24,25. Onderzoek naar platforms waarin exosomen worden gebruikt als therapeutische medicijnafgiftesystemen is de afgelopen jaren intensief versneld. In talrijke onderzoeken is waargenomen dat relevante geneesmiddelen gemakkelijk kunnen worden ingekapseld in exosomen en veilig kunnen worden afgeleverd in doelcellen, weefsels en organen26,27. Verschillende methoden, zoals incubatie, vries-/dooicycli, sonicatie en extrusie, kunnen worden gebruikt voor het laden van geneesmiddelen in exosomen28.

Coincubatie met exosomen of exosoomachtige blaasjes maakt het mogelijk om lipofiele kleine moleculen passief in te kapselen in deze afgiftesystemen28,29,30. In het bijzonder werden verschillende moleculen zoals curcumine 31, catalase 30, doxorubicine32 en paclitaxel33 effectief in exosomen geladen. Er is waargenomen dat catalase-bevattende exosomen, die een antioxiderende werking hebben, zich efficiënt ophoopten in de neuronen en microgliacellen in de hersenen en sterke neuroprotectieve activiteiten vertoonden30. In dezelfde studie bleek saponine, dat aan het complex werd toegevoegd om de laadefficiëntie te verhogen, het laadpercentage van het geneesmiddel tijdens de incubatie te verhogen30,34. Er zijn echter verdere studies nodig om de normen vast te stellen voor het laden van geneesmiddelen in exosomen.

Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een nanodragersysteem door dopamine in te kapselen in exosomen die werden geïsoleerd uit WJ-MSC's. Alle stappen, waaronder het kweken van WJ-MSC's, isolatie en karakterisering van exosomen, experimenten met het laden van geneesmiddelen, karakterisering van dopamine-geladen exosomen met verschillende technieken en in vitro cytotoxiciteitsanalyse worden in detail uitgelegd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.

1. Kweken en cryopreservatie van mesenchymale stamcellen van Wharton's jelly

  1. Haal de WJ-MSC's (van ATCC) uit de vriezer van -80 °C. Zaai de cellen in een kolf met DMEM-F12-medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Incubeer ze bij 37 °C in een incubator met 5% CO2 .
  2. Verander het kweekmedium om de 2 dagen. Passage de cellen wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken. Was de cellen die moeten worden gepasseerd met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: Wassen met PBS voordat trypsine wordt toegevoegd, zorgt voor een gemakkelijke scheiding van de cellen van het oppervlak van de kolf.
  3. Verwijder de PBS en voeg 5 ml trypsine-EDTA-oplossing toe aan de kolf. Incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C in een broedmachine met 5% CO2 .
  4. Vang het supernatans op in de buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.500 x g . Verwijder na het centrifugeren het supernatans en voeg 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS toe aan de buis door te pipetteren.
  5. Breng de cellen over naar een grotere kolf en zet de kweek voort door DMEM-F12 + 10% FBS toe te voegen totdat er voldoende exosomen zijn verkregen35.
    OPMERKING: Gekweekte cellen worden ingevroren met een dichtheid van 1 miljoen/ml met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaard bij -80 °C.

2. Productie van exosomen uit mesenchymale stamcellen van Wharton's Jelly

OPMERKING: Exosomen worden geïsoleerd uit gekweekte WJ-MSC's. Exosoomisolatie wordt uitgevoerd wanneer cellen het oppervlak van de kolf bedekken en een dichtheid van ongeveer 80% bereiken.

  1. Verwijder het bovendrijvende medium met 10% FBS uit de kolf en was de cellen met 5 ml PBS. Voeg serumvrij DMEM-F12 medium toe aan de cellen na het spoelen met PBS. Incubeer kolven gedurende 48 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2 . Verzamel na incubatie het serumvrije medium in de tube en bewaar bij -20 °C.
    OPMERKING: In stap 2.1 wordt 180 ml serumvrij medium verzameld en bewaard bij -20 °C. Na het ontdooien wordt een batchcentrifugatieproces gestart, zoals hieronder beschreven.
  2. Isolatie van exosomen
    1. Centrifugeer het opgevangen serumvrije medium bij 300 x g gedurende 10 minuten bij +4 °C. Trek het supernatans voorzichtig op en breng het over in een ander buisje.
    2. Centrifugeer het opgevangen supernatans bij 2.000 × g gedurende 10 minuten bij +4 °C. Trek het supernatans voorzichtig op en breng het over in een ander buisje.
    3. Centrifugeer het opgevangen supernatans bij 10.000 × g gedurende 30 minuten bij +4 °C. Trek het supernatans voorzichtig op en breng het over in een ander buisje.
    4. Breng het opgevangen supernatans over in ultracentrifugebuizen en ultracentrifugeer bij 110.000 × g gedurende 130 minuten. Verwijder langzaam het supernatans en voeg 1 ml PBS toe aan de pellet.
    5. Draai de pellet en ultracentrifuge bij 110.000 × g gedurende 70 minuten bij +4 °C36 (figuur 1). Verwijder langzaam het supernatans en voeg 1 ml PBS toe aan de pellet.
      OPMERKING: Nadat de ultracentrifugatiestappen zijn voltooid, kunnen de verkregen exosomen worden opgeslagen bij -80 °C. De verkregen pellet is nu klaar voor karakterisering.

figure-protocol-1
Figuur 1: Exosoomisolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Karakterisering van exosomen

  1. Analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)
    OPMERKING: Nanoparticle tracking-analyse wordt uitgevoerd om de grootte en concentratie van de geïsoleerde exosomen te bepalen. Tabletten die worden gebruikt voor 1x PBS-oplossing moeten een pH van 7,3-7,5 hebben. 1x PBS-oplossing bevat 10 mM fosfaatbuffer, 137 mM natriumchloride en 2.7 mM kaliumchloride. De oplossing wordt bereid door 1 PBS-tablet toe te voegen aan 100 ml gedestilleerd water. Deze bereide oplossing wordt gesteriliseerd door middel van autoclaveren.
    1. Verdun de exosomen 100-voudig door 990 μL PBS toe te voegen aan 10 μL exosomen. Neem de verdunde suspensie in een wegwerpspuit.
    2. Schakel het NTA-apparaat in en sluit de computer aan. Open de software.
    3. Injecteer het monster in de spuit in de slang in het cassettegedeelte van het apparaat. Sluit het cassettedeksel van het apparaat.
    4. Klik in de software die wordt geopend op de knop Analyse starten . Sla de verkregen resultaten op door op de opnameknop te drukken.
  2. Dynamische lichtverstrooiingsanalyse
    OPMERKING: Exosomen die zijn geïsoleerd voor zetapotentiaal- en groottemeting worden ook op dezelfde manier verdund als voor NTA-analyse.
    1. Voeg 980 μL PBS toe aan 20 μL van de exosomen.
    2. Open het zeta-formaatapparaat en de aangesloten computer. Open de software.
    3. Voeg de suspensie van stap 3.2.1 toe aan de wegwerpcuvet. Open het deksel van het apparaat, plaats de cuvet in de cassette en sluit het deksel.
    4. Selecteer het type cuvet in de software van het apparaat. Klik op de knop Analyse starten voor zetapotentiaal- en dimensionale analyse.
      OPMERKING: Analyses worden afzonderlijk uitgevoerd voor dimensionale analyse en zetapotentiaal.

4. Dopamine laden in exosomen

OPMERKING: Nadat de karakterisering van WJ-MSC-exosomen is voltooid, werden met dopamine beladen exosomen verkregen als een medicijnafgiftesysteem. Het laden van geneesmiddelen in exosomen wordt uitgevoerd met behulp van de incubatiemethode.

  1. Voeg 3 ml PBS toe aan de exosoomsuspensie uit stap 2.2.5. Steriliseer de verdunde suspensie door filtratie met behulp van filters van 0,22 μm. Breng 500 μL van de gesteriliseerde exosoomsuspensie over in een ander buisje.
  2. Bereid dopamine-oplossing (0,5 mg/ml) met gedestilleerd water. Voeg 500 μL dopamine-oplossing toe aan de buisjes met de exosomen.
  3. Voeg saponine toe aan de suspensie in stap 4.2. Incubeer de bereide exosoom-dopaminesuspensie gedurende 24 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: De saponineconcentratie mag niet hoger zijn dan 0,002% van de totale oplossing.
  4. Ultracentrifugeer de suspensie bij 90.000 × g gedurende 70 minuten om vrije dopamine en saponine uit het medium te verwijderen. Bewaar de geïsoleerde exosomen bij -20 °C tot gebruik voor verdere analyse37.
    OPMERKING: Voeg 0,02% ascorbinezuur toe voor de stabiliteit van de bereide dopamine-oplossing.

5. Karakterisering van dopamine geladen exosomen

  1. Analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)
    OPMERKING: Nanoparticle tracking analyse wordt uitgevoerd om de grootte en concentratie van geïsoleerde exosomen te bepalen.
    1. Volg de stappen 3.1.1-3.1.4 om de exosomen te verdunnen en NTA uit te voeren.
  2. Dynamische lichtverstrooiingsanalyse
    OPMERKING: Exosomen die zijn geïsoleerd voor zetapotentiaal- en groottemeting worden ook verdund op dezelfde manier als NTA-analyse.
    1. Volg de stappen 3.2.1-3.2.4 om de exosomen te verdunnen en een dynamische lichtverstrooiingsanalyse uit te voeren.
      OPMERKING: Grootte en zeta-potentialen voor elke oplossing (saponine, dopamine, exosoom-dopamine) worden afzonderlijk geanalyseerd.

6. Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC)

OPMERKING: De hoeveelheden dopamine die in exosomen zijn geladen, worden gemeten met de high-performance liquid chromatography (HPLC)-methode. Om de aanwezigheid van dopamine in de verkregen formulering te detecteren, worden exosomen tot ontploffing gebracht door een speciaal proces.

  1. Doe de formulering in een verwarming van 75 °C om te verdampen. Voeg acetonitril (50:50 verhouding) toe aan de suspensie en vortex. Sonificeer de oplossing gedurende 10 minuten.
  2. Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 10.000 × g. Filtreer het supernatans door een filter van 0,22 μm.
  3. Analyseer alle analyten met behulp van een C18-kolom bij 30 °C bij een debiet van 1 ml/min (de mobiele fase H2O/acetonitril). Meet de extinctie bij 230 nm38.

7. Meting van de laadcapaciteit van geneesmiddelen (DL) en kinetiek van de in-vitroafgifte van geneesmiddelen

  1. Laadcapaciteit voor geneesmiddelen (DL)
    OPMERKING: De hoeveelheid dopamine die in exosomen wordt geladen, wordt gekwantificeerd met behulp van UV-VIS-spectroscopie. De extinctie wordt afgelezen bij 280 nm. De verzamelde supernatanten tijdens de synthese worden gebruikt om de hoeveelheid ongeladen medicijn te meten. De dopamineconcentratie in het supernatans wordt bepaald via een standaard kalibratiecurve voor dopamine.
    1. Bereid een bouillonoplossing van 1 mg/ml dopamine. Bereid concentraties van 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 en 0,5 mg/ml uit de stockoplossing met gedestilleerd water.
      OPMERKING: Voeg 0,02% ascorbinezuur toe voor de stabiliteit van de bereide dopamine-oplossing.
    2. Genereer een standaard kalibratiecurve door de absorptie van elke verdunning van dopamine bij 280 nm te meten in een UV-spectrofotometer.
    3. Meet de extinctie van het supernatans bij 280 nm.
    4. Bereken de laadcapaciteit van dopamine met behulp van Eq (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-2 100 (1)
      OPMERKING: De analyse wordt in drievoud uitgevoerd.
  2. In-vitrokinetiek voor de afgifte van geneesmiddelen
    OPMERKING: De kinetiek van de afgifte van dopamine geladen exosomen wordt uitgevoerd met behulp van een dialysemembraan. PBS, pH 7,4, wordt gebruikt als afgiftemedium om een fysiologische micro-omgeving te simuleren.
    1. Voeg 1 ml dopamine-geladen exosomen toe aan het dialysemembraan. Plaats het membraan in een bekerglas. Voeg 15 ml PBS toe aan het bekerglas.
    2. Doseer 1 ml afgiftemedium in een bekerglas na 0,5, 1, 2, 4, 6 en 8 uur. Vervang op elk tijdstip het volume van het monster door verse PBS. Analyseer de monsters die met gespecificeerde intervallen bij 280 nm zijn genomen met behulp van een UV-VIS-spectrometer.
    3. Bereken de resultaten met behulp van Eq (2)40.
      Vrijgave (%) = figure-protocol-3 100 (2)
      OPMERKING: Er wordt een kalibratiecurve opgesteld voor de bepaling van de kinetiek van de in vitro afgifte van geneesmiddelen. Dopamine-oplossing wordt bereid in concentraties van 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 en 5,0 mg/ml. De UV-extinctiewaarde van elke concentratie wordt bepaald bij 280 nm met een UV-VIS spectrofotometer.

8. In-vitrocytotoxiciteitstest

  1. Revitalisatie en kweek van fibroblasten
    1. Haal de fibroblasten uit de vriezer van -80 °C. Zaai de cellen in een kolf met DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een incubator met 5% CO2 . Verander het kweekmedium om de 2 dagen.
    3. Passeer de cellen totdat ze 80% samenvloeiing bereiken. Volg de stappen 1.3-1.5. Na centrifugeren bij 1.500 × g gedurende 5 minuten, verwijder je het supernatant, voeg je 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS toe en zaai je 10.000 cellen per putje in een plaat met 96 putjes.
      1. Voeg DMEM-F12 medium + 10% FBS toe en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 18 uur in een incubator met 5% CO2 . Verander het medium van de putjes aan het einde van de incubatie.
    4. Bereid de voorraad dopamine-geladen exosoomsuspensie voor. Verdun de met dopamine beladen exosoomformulering met medium om concentraties van 100 μL/ml, 250 μL/ml, 500 μL/ml en 1.000 μL/ml te verkrijgen.
    5. Voeg de bereide concentraties toe aan de cellen in elk putje van de plaat met 96 putjes. Incubeer de platen gedurende 18 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO241.
  2. MTT-cel levensvatbaarheidstest
    OPMERKING: Aan het einde van de incubatie worden de levensvatbaarheidsratio's van cellen bepaald door de MTT-test.
    1. Bereid de MTT-oplossing (5 mg/ml) met PBS. Voeg 10 μL MTT-oplossing toe aan elk putje. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
    2. Voeg aan het einde van de incubatie 100 μL DMSO toe aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Meet de extinctiewaarden in de ELISA-lezer bij 570 nm42,43.
      OPMERKING: De MTT-levensvatbaarheidstest wordt in drievoud uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosoomisolatie en karakterisering
Wharton jelly-stamcellen worden gekweekt en geïncubeerd in een serumvrij medium gedurende 48 uur wanneer de cultuur voldoende dichtheid bereikt. Na het einde van de incubatie wordt het supernatans opgeslagen bij -20 °C. De verzamelde supernatanten worden verdund met PBS en onderworpen aan ultracentrifugatie (figuur 1). De verkregen oplossing wordt geanalyseerd door middel van NTA- en DLS-analyses. De exosomen worden gesteriliseerd door ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen zijn kleine membraanblaasjes met afmetingen van 40-200 nm die worden uitgescheiden door de meeste celtypen, bijvoorbeeld MSC's1. Exosomen zijn in staat om communicatie tussen cellen mogelijk te maken en kunnen cellen op verschillende manieren binnendringen, zoals endocytose, fagocytose, micropinocytose, lipide-gemedieerde internalisatie en fusie33,44. In vergelijking met andere nanodragersystemen verlenen de lipiden en cholesterol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd voornamelijk ondersteund door onderzoeksfinanciering van de wetenschappelijke onderzoeksprojecten van de Technische Universiteit Yıldız (TSA-2021-4713).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,22 µm membraanfilterAisimoGebaat voor het sterilisatieproces
0,45 µm spuitfilterAisimoGebaat voor het sterilisatieproces
15 mL Falcon buisNestGebaat in celcultuur stap
25 cm2 celcultuurkolven (Falcon, TPP weefselkweekkolvenNestGebaat in celcultuur stap
50 mL Falcon buisNestGebaat in celcultuur stap
75 cm2 celcultuurkolven (Falcon, TPP weefselkweekkolvenNestGebaat in celcultuur stap
96 well platen (Falcon, TPP microplaten)Merck MilliporeGebaat in celcultuur stap
AcetonitrilSigma271004-1LGebaat voor HPLC-analyse
AutoclaafNUVE-OT 90LGebaat voor het sterilisatieproces
Cel Cultuur CabinHera Safe KSGebaat voor het celcultuur proces
CentrifugeHitachiCF16RNGebaat in de exosome isolatiestap
CO2 incubator met Safe Cell UVPanasonicGebaat voor het celcultuur proces
Dopamine hydrochloride H8502-10GSigmaH8502-10GGebaat in exosome dopamine lading
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Gebaat als celcultuur medium
Fetaal Rundserum-FBSCapricornFBS-16AHet werd gebruikt door het toe te voegen aan het celcultuur medium.
Vriezer -80 °CPanasonicMDF-U5386S-PEVoor het opslaan van cellen en de resulterende exosomen
KoelkastPanasonicMPR-215-PEGebaat voor het opslaan van celcultuur en andere materialen
Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie-HPLCAgilent TechnologiesDe aanwezigheid van dopamine uit het gehalte van de verkregen formulering werd onderzocht.
Microscoop- PrimovertZeissGebaat om cellen in celcultuur te observeren.
MTT AssayBiomatikGebaat om cellevensvatbaarheid te meten
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalGebaat voor exosome karakterisering
Optima XPN-100 UltracentrifugeBeckman CoulterGebaat in de exosome isolatiestap
PBS tabletBiomatik43602In de bereiding van de PBS oplossing
Penicilline/Streptomycine OplossingCapricornPB-SHet werd toegevoegd aan het medium om besmetting in celcultuur te voorkomen.
Pipet AidIsolab
Precisiebalans-KernKern-ABJ220-4NMGebaat bij de bereiding van oplossingen
Q500 SonicatorQsonica, LLCGebaat om exosomen te verteren in HPLC-analyse
SaponineSigma47036-50G-FHet werd gebruikt door het toe te voegen aan de totale oplossing in het exosome dopamine ladingsproces.
Spectrostar-Nano-SpectrofotometrieBMG LABTECHGebaat voor MTT en medicijnafgifte analyses
SPSS 22statistisch pakket programma
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexGebaat om oplossingen homogeen te mengen
Water Bath 37 °C-SenovaSenovaGebaat in celcultuur stap
Wharton’s jelly mesenchymale stamcellenATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSGebaat voor exosome karakterisering

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Exosoom carriersysteemdopamine inkapselingextracellulaire blaasjesbloed hersenbarri reWharton gelei exosomennanopartikel trackingseri le centrifugatiedrug release assaycytotoxiciteitsassayMTT assay

Gerelateerde artikelen