Kwantitatieve analyse van visco-elastische eigenschappen van rode bloedcellen met behulp van een optisch pincet en onscherpe microscopie

Samenvatting

Hier wordt een geïntegreerd protocol op basis van een optisch pincet en defocusmicroscopie beschreven om de reologische eigenschappen van cellen te meten. Dit protocol is breed toepasbaar bij het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen van erytrocyten onder variabele fysio-pathologische omstandigheden.

Samenvatting

De visco-elastische eigenschappen van erytrocyten zijn onderzocht met behulp van een reeks technieken. De gerapporteerde experimentele gegevens variëren echter. Dit wordt niet alleen toegeschreven aan de normale variabiliteit van cellen, maar ook aan de verschillen in methoden en modellen van celrespons. Hier wordt een geïntegreerd protocol met behulp van optische pincetten en onscherpe microscopie gebruikt om de reologische kenmerken van rode bloedcellen in het frequentiebereik van 1 Hz tot 35 Hz te verkrijgen. Terwijl optische pincetten worden gebruikt om de erytrocyten-complexe elastische constante te meten, is defocusmicroscopie in staat om het celhoogteprofiel, volume en de vormfactor een parameter te verkrijgen die conversie van complexe elastische constante in complexe schuifmodulus mogelijk maakt. Bovendien kan door een zacht glasachtig reologiemodel toe te passen, de schaalexponent voor beide moduli worden verkregen. De ontwikkelde methodologie maakt het mogelijk om het mechanische gedrag van rode bloedcellen te onderzoeken, waarbij hun visco-elastische parameters worden gekarakteriseerd, verkregen onder goed gedefinieerde experimentele omstandigheden, voor verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden.

Inleiding

Rijpe rode bloedcellen (RBC's), ook bekend als erytrocyten, kunnen zich meer dan twee keer zo groot maken wanneer ze door de smalste haarvaten van het menselijk lichaam gaan¹. Een dergelijke capaciteit wordt toegeschreven aan hun unieke vermogen om te vervormen wanneer ze worden blootgesteld aan externe belastingen.

In de afgelopen jaren hebben verschillende studies deze functie gekarakteriseerd in RBC-oppervlakken ^2,3. Het gebied van de natuurkunde dat de elastische en viskeuze reacties van materialen als gevolg van externe belastingen beschrijft, wordt reologie genoemd. In het algemeen, wanneer een externe kracht wordt uitgeoefend, hangt de resulterende vervorming af van de eigenschappen van het materiaal en kan deze worden onderverdeeld in elastische vervormingen, die energie opslaan, of viskeuze vervormingen, die energie dissiperen⁴. Alle cellen, inclusief RBC's, vertonen een visco-elastisch gedrag; Met andere woorden, energie wordt zowel opgeslagen als afgevoerd. De visco-elastische respons van een cel kan dus worden gekenmerkt door zijn complexe schuifmodulus G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), waarbij G' (ω) de opslagmodulus is, gerelateerd aan het elastische gedrag, en G" (ω) de verliesmodulus is, gerelateerd aan zijn viscositeit⁴. Bovendien zijn fenomenologische modellen gebruikt om celresponsen te beschrijven, een van de meest gebruikte wordt het zachte glazige reologiemodel⁵ genoemd, gekenmerkt door een machtswetafhankelijkheid van de complexe schuifmodulus met de belastingsfrequentie.

Op één cel gebaseerde methoden zijn gebruikt om de visco-elastische eigenschappen van RBC's te karakteriseren, door kracht toe te passen en verplaatsing te meten als functie van de opgelegde belasting ^2,3. Voor de complexe schuifmodulus zijn echter weinig resultaten te vinden in de literatuur. Met behulp van dynamische lichtverstrooiing werden waarden voor RBC-opslag en verliesmoduli gerapporteerd, variërend van 0,01-1 Pa, in het frequentiebereik van 1-100 Hz⁶. Door gebruik te maken van optische magnetische twisting cytometrie werd een schijnbaar complexe elastische modulus verkregen⁷, en voor vergelijkingsdoeleinden werd beweerd dat een multiplicatieve factor mogelijk de discrepanties zou kunnen verduidelijken.

Meer recent werd een nieuwe methodologie op basis van optische pincetten (OT) samen met defocusmicroscopie (DM), als een geïntegreerd hulpmiddel om de opslag en het verlies van afschuifmoduli van menselijke erytrocyten over tijdsafhankelijke belastingen kwantitatief in kaart te brengen, vastgesteld ^8,9. Daarnaast werd een zacht glasachtig reologiemodel gebruikt om de resultaten te passen en een vermogenswetcoëfficiënt te verkrijgen die de RBC's ^8,9 karakteriseert.

Over het algemeen verduidelijkt de ontwikkelde methodologie^8,9, waarvan het protocol hieronder in detail wordt beschreven, eerdere discrepanties door gebruik te maken van de gemeten waarden voor de vormfactor, F_f^, die krachten en vervormingen relateert aan spanningen en spanningen in het RBC-oppervlak en kan worden gebruikt als een nieuwe diagnostische methode die in staat is om kwantitatief de visco-elastische parameters en zachte glasachtige kenmerken van RBC's verkregen van personen met verschillend bloed te bepalen Pathologieën. Een dergelijke karakterisering, met behulp van het hieronder beschreven protocol, kan nieuwe mogelijkheden openen om het gedrag van RBC's vanuit een mechanobiologisch perspectief te begrijpen.

Protocol

Menselijke bloedmonsters werden verstrekt door volwassen mannen en vrouwen vrijwilligers volgens protocollen goedgekeurd door de Commissie voor Onderzoeksethiek van de Federale Universiteit van Rio de Janeiro (Protocol 2.889.952) en geregistreerd in Brazilië Platform onder CAAE-nummer 88140418.5.0000.5699. Een schriftelijke vorm van toestemming werd afgegeven aan en verzameld van alle vrijwilligers. Degenen met hemoglobinopathie en / of het nemen van gecontroleerde medicatie werden uitgesloten. Het hele proces volgde de richtlijnen die waren goedgekeurd door de ethische commissie van het instituut.

1. Bereiding van de monsterhouders

1. Koop twee coverslips (24 mm x 60 mm en 24 mm x 32 mm; dikte = 0,13-0,17 mm) en één rubberen ring (diameter = 10 mm; dikte = 2 mm) voor elke monsterhouder.
2. Giet siliconenvet over het rubberen ringoppervlak op een manier die de hele omtrek bedekt.
3. Plaats de rubberen ring op de coverslip met de vetzijde naar de coverslip gericht. Wacht 5 minuten op de juiste bevestiging, de monsterhouders zijn dan klaar om de celcultuur te ontvangen.
   OPMERKING: Daarnaast kunnen ook commerciële of zelfgemaakte glazen bodemschotels worden gebruikt, zoals eerder beschreven¹⁰.

2. Celkweek

OPMERKING: De onderstaande stappen beschrijven hoe u gezonde RBC's uit menselijk bloed kunt verkrijgen. Het is belangrijk dat de monsters voor elk experiment vers worden bereid.

1. Verdun 20 μL bloed in 250 μL 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) oplossing met 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH₂PO₄, 10 mM glucose en aangevuld met 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA).
2. Na centrifugeren bij 200 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, zuig het supernatant op met behulp van een pipet en resuspensie de celpellet in 1 ml 1x PBS/BSA-oplossing. Was de cellen 2x in de buffer.
3. Bereken de celdichtheid met behulp van een hemocytometrer en zaai 50.000 tot 100.000 cellen in de monsterhouder die in stap 1 is voorbereid. Wacht 10-15 minuten op niet-specifieke celbevestiging aan de coverslip; De wachttijd heeft geen invloed op cellen.
4. Voeg aan het monster 0,2 μL van een 10% v/v polystyreen boloplossing (straal = 1,52 ± 0,02 μm) toe voor verdere OT-experimenten. Bevestig de juiste menging door de monsters onder de microscoop te bekijken.
5. Na het zaaien van de cellen plaatst u gewoon de tweede coverslip boven de rubberen ring (het is niet nodig om vet toe te voegen voor bevestiging), sluit u de installatie en voltooit u de monstervoorbereiding. Monsters zijn klaar voor microscopie-analyse en manipulatie.

3. Optische pincet microscoop setup

OPMERKING: OT zijn hulpmiddelen die een zeer gerichte laserstraal gebruiken om microscopische objecten te vangen en om krachten in het piconewton-bereik en verplaatsingen op de nanometerschaal te meten. De gebruikte OT-laser (1064 nm golflengte) moet goed zijn uitgelijnd, zoals eerder beschreven¹⁰.

1. Kortom, met behulp van ten minste twee spiegels gescheiden door een afstand van een paar centimeter (minstens 10-20 cm), richt een lineair gepolariseerde laserstraal naar de achteringang van een omgekeerde microscoop. Lijn de laserstraal nauwkeurig uit om de microscoop in een rechte lijn binnen te gaan (figuur 1).
2. Reflecteer vervolgens de laserstraal met behulp van een dichroïsche spiegel, geïnstalleerd in de microscoop, om parallel aan de as van de objectieflens te gaan en de lens in de buurt van het midden van de achteringang binnen te gaan. Hiermee wordt de laser scherpgesteld om de optische val te maken (figuur 1).
3. Om vervolgens krachten met OT te meten, kalibreert u het systeem om de stijfheid van de val (κ_OT) te verkrijgen. Zie¹⁰ voor een meer gedetailleerde beschrijving van de OT-kalibratieprocedure. Zodra κ OT is gevonden, is het _OT-systeem klaar voor de reologische experimenten.

4. DM instellen

OPMERKING: DM is een op brightfield gebaseerde optische microscopietechniek waarmee transparante objecten zichtbaar kunnen worden als de microscoop enigszins onscherp is^11,12. Een dergelijke techniek is toegepast om de RBC-vorm¹³ te verkrijgen. Dezelfde microscoop die voor het OT-systeem wordt gebruikt, kan worden gebruikt voor DM, om een hoogteprofiel te verkrijgen door middel van 3D-reconstructies.

1. Pas het microscoopverlichtingssysteem aan door de Köhler-verlichting¹⁴ uit te voeren en, voor een betere resolutie, het condensor-membraan volledig te openen om de experimenten uit te voeren.
2. Gebruik een piëzo-elektrisch positioneringssysteem om het monster in alle coördinaten te verplaatsen, met nanometrische precisie in de z-as. Voer de automatische kalibratie van het piëzo-elektrische systeem uit op alle assen. Zodra alle procedures zijn uitgevoerd, is het microscoopsysteem klaar voor DM-experimenten.

5. OT-gebaseerd reologie-experiment en -analyse

OPMERKING: Het reologie-experiment bestaat uit het observeren van de reacties van de cel op kleine oscillaties van verschillende frequenties.

1. Proefneming
   1. Gebruik het OT-systeem om de bol met de OT-laser te vangen en vervolgens aan een RBC te bevestigen door de bol tegen het celoppervlak te drukken in de buurt van het bovenoppervlak en dicht bij de celrand. Gebruik de microscoop voor deze stap. Vang vervolgens een andere bol op en herhaal dezelfde bevestigingsprocedure, maar bevestig deze nu aan de dekslip, dicht bij de cel. De bol die aan de dekplaat is bevestigd, is de referentiekraal (figuur 2), die nodig is om de piëzoverplaatsing te volgen en te vergelijken met de RBC-bol.
   2. Zorg ervoor dat de gekozen cel goed is bevestigd aan de coverslip en dat de RBC- en referentiebollen zich hebben vastgehecht aan respectievelijk het RBC-oppervlak en de coverslip voordat u met de meting begint. Identificeer visueel de niet-aangehechte cellen zoals ze in de loop van de tijd zullen bewegen, ondanks de hoge adhesiesnelheid (ongeveer 80% -90%).
   3. Voeg een sinusoïdale functie van amplitude, ξ 0 = 0,500 ± 0,001 μm en variërende frequenties van 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz en 35 Hz, met respectievelijke hoekfrequenties, ω, van 6,3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s en 220 rad/s, toe aan de piëzo-elektrische fasesoftware, met behulp van de piëzo-elektrische software, zoals eerder aangetoond ^8,9.
   4. Druk met behulp van de piëzo-elektrische trap op de startknop om de piëzo-elektrische verplaatsing toe te staan en de RBC-bol in de val te houden, onderwerp het monster aan een cyclus van bewegingen met behulp van de eerder ingestelde sinusoïdale functie. Gebruik een camera die beelden kan produceren met 790 frames/s of hoger om de monsterbeweging vast te leggen. Een schema van het experiment is weergegeven in figuur 2.
   5. Terwijl het monster wordt onderworpen aan sinusoïdale bewegingen, activeert u de OT om de bol te vangen die aan het RBC-oppervlak is bevestigd. Ongeacht de temperatuur die is gekozen om de experimenten uit te voeren, kamertemperatuur, 37 °C of een andere temperatuur, moet u de temperatuur zorgvuldig controleren om variaties tijdens de metingen te voorkomen. De infrarood (1064 nm) laser die wordt gebruikt om de OT te maken, veroorzaakt bijna geen schade of verwarming van de cellen.
2. Analyse
   1. Analyseer de beelden verkregen tijdens de sinusoïdale bewegingen met behulp van ImageJ om het middelpunt van de massapositie van elk van de bollen in de loop van de tijd te vinden.
      OPMERKING: Deze gegevens maken het mogelijk om plots te genereren die fase- en amplitudeverschillen tussen beide bollen kunnen laten zien. Dergelijke informatie is cruciaal voor het verkrijgen van de visco-elastische respons van RBC's.
   2. Om het massamiddelpunt voor elk van de bollen te verkrijgen, opent u de ImageJ-software. Importeer de volledige film die is verkregen tijdens de sinusoïdale bewegingen.
   3. Klik op het tabblad Afbeelding op Aanpassen en selecteer vervolgens Drempel. Het drempelvenster wordt geopend. Selecteer zwart-wit. Hierdoor wordt de achtergrond wit en de bollen zwart.
   4. Pas de drempel met beide schuifbalken onder het histogram aan, zodat beide bollen met het maximale aantal pixels worden weergegeven.
   5. Selecteer de referentiebol door op Bestand > rechthoek te klikken. Teken een rechthoek om de bol te selecteren. Nadat u de referentiebol in één afbeelding hebt geselecteerd, moet u ervoor zorgen dat de rechthoek dezelfde bol ook correct selecteert in alle andere afbeeldingen van de film.
   6. Klik vervolgens op het tabblad Analyseren op Metingen instellen en selecteer de optie Massamiddelpunt .
   7. Klik nogmaals op het tabblad Analyseren en selecteer Deeltjes analyseren. Er wordt een nieuw venster geopend. Definieer de grootte en circulariteit (afhankelijk van de straal van de bol). Schakel de volgende selectievakjes Resultaten weergeven en Resultaten wissen in. Klik ten slotte op OK om alle afbeeldingen te verwerken.
   8. Er verschijnt een nieuw venster met een tabel met xy-coördinaten voor het midden van de massa. Sla deze coördinaatwaarden op als een .txt bestand. Herhaal de procedure voor de andere bol, bevestigd aan het RBC-oppervlak.
   9. Om de amplitude en verschillen in fase voor beide bollen te verkrijgen, opent u de analysesoftware. Importeer de .txt eerder verkregen bestanden.
   10. Maak een nieuwe tabel met drie kolommen. Voeg in de eerste kolom (c0) het aantal frames toe, voeg in de tweede kolom (c1) de x-coördinaten voor de referentiebol toe en voeg in de derde kolom (c2) de x-coördinaten toe voor de bol die aan het RBC-oppervlak is bevestigd.
       OPMERKING: Aangezien in dit voorbeeld de sinusoïdale bewegingen alleen in de x-as werden uitgevoerd, is het alleen nodig om de x-coördinaten voor beide bollen te gebruiken.
   11. Correleer vervolgens de frames met de tijd. Klik op Windows > Formula Entry. Er wordt een nieuw venster geopend met de naam formule-invoer. In dit venster is het mogelijk om acht verschillende vergelijkingen in te stellen, elk in een specifieke sleutel (van F1 tot F8).
   12. Selecteer F1, typ de volgende formule:
       c 3 = c0 / (camera fps)
       Klik op Uitvoeren. Hiermee wordt een nieuwe kolom gemaakt voor een tijd in de tabel (kolom 4).
   13. Trek de x-coördinaatwaarde van elk frame af met de respectieve gemiddelde waarde. Hiertoe wijst u twee sleutels aan op de formulevermelding en typt u de volgende vergelijkingen voor elke sleutel:
       c 4 = (c 1 - gemiddelde(c 1)) en c 5 = (c 2 - gemiddelde(c2))
       Klik op de knop Uitvoeren . De resultaten worden weergegeven in de kolommen 5 en 6 voor respectievelijk referentie- en RBC-bollen.
   14. Converteer het middelpunt van massawaarden van pixels naar micrometers. Gebruik hiervoor een andere sleutel op de formulevermelding en typ de volgende vergelijking:
       c 4 = c 4 / conversienummer
       Herhaal hetzelfde proces voor kolom 5.
       OPMERKING: Conversie wordt verkregen met behulp van een micrometerschaal / liniaal en het verkrijgen van het beeld met dezelfde microscoopopstelling die wordt gebruikt voor de metingen (inclusief dezelfde objectieflens). Deze procedure kan worden uitgevoerd tijdens de kalibratie van de microscoop. Zo wordt een pixel/micrometer relatie verkregen.
   15. Genereer een plot met de massamiddelpunten van beide bollen op de y-as en de tijd op de x-as. Klik hiervoor op Galerij > Lineair en Scatter. Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer de tijdkolom voor de x-as en selecteer in de y-as de kolommen van het massamiddelpunt in micrometers voor zowel referentie- als RBC-bollen.
   16. Selecteer in de grafiek alleen de gegevens met betrekking tot de eerste hoekfrequentie (6,3 rad/s). Gebruik de in figuur 3 aangegeven hulpmiddelen.
   17. Definieer de vergelijking waarmee de gegevenscurve voor de referentiebol wordt aangepast. Klik hiervoor op Curve Fit > General en Fit1, selecteer het vakje met gegevens met betrekking tot de positie van de referentiebol en klik vervolgens op Define. Er wordt een nieuw venster geopend om de vergelijking te definiëren. De positie ξ(t) van de referentiebol wordt beschreven door:
       ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
       waarbij ξ de sinusoïdale beweging van het monster is, ω de hoekfrequentie en t de tijd in s. Als u deze vergelijking naar de analysesoftware vertaalt, ziet deze er als volgt uit:
       , waarbij m1 ξ is, m2 f, m0 de tijd t en m3 de fase van de cosinusfunctie voor t = 0.
   18. Schat de waarden voor m1, m2 en m3 op het perceel. Nadat u de vergelijking hebt gedefinieerd, klikt u op OK. De gegevens worden aangepast op basis van de vergelijking en een curve samen met een klein vierkant verschijnt in de grafiek met de waarden van m1, m2 en m3.
   19. Definieer de vergelijking waarmee de gegevenscurve voor de RBC-bol wordt aangepast. Klik hiervoor op Curve Fit > General en definieer de vergelijking waarmee de curve voor de gegevens wordt aangepast. De positie ρ(t) van de RBC-bol wordt gegeven door:
       
       waarbij ξ' de uitfase-amplitude is en φ de uitfasehoek. Als u deze formule vertaalt naar de analysesoftware, ziet deze er als volgt uit:
       , waarbij m1, m2 en m3 de waarden zijn die zijn verkregen in de curvefit van de referentiebol. M4 is ξ' en M5 is φ.
   20. Schat de waarden voor m4 en m5 op het perceel. Nadat u de formule hebt gedefinieerd, klikt u op OK. De gegevens worden aangepast op basis van de vergelijking en een curve samen met een klein vierkant verschijnt in de grafiek met de waarden van m4 en m5.
   21. Maak vervolgens een nieuwe tabel om de gegevens toe te voegen die zijn verkregen uit de curve die in hun respectieve kolommen past. Definieer vijf verschillende kolommen voor de volgende parameters: hoekfrequentie, amplitude (referentiebol), begintijd, amplitude (RBC-bol) en uitfasehoek. Voer dezelfde procedure uit voor alle andere frequenties.
   22. Gebruik de volgende vergelijkingen om de opslagconstanten (K') en verliesconstanten (K") te vinden:
       
       
       waarbij κ_OT de OT-elastische constante is en β de Stokes-luchtweerstandscoëfficiënt. Als u de vergelijkingen naar de analysesoftware vertaalt, ziet deze er als volgt uit:
       en
       
        , waarbij β en κ_OT moeten worden vervangen door de waarden in het systeem.
   23. Plot de resultaten in een grafiek met behulp van de x-as voor K " en de y-as voor K' (figuur 4).

6. DM-experiment en -analyse om de totale celvormfactor te verkrijgen

1. Video-acquisitie
   1. Verplaats het piëzo-elektrische stadium in de xy-richting met behulp van de software om te zoeken naar een geïsoleerde cel die aan de coverslip is bevestigd. Vang een polystyreenbol met een bekende diameter op en bevestig deze aan het RBC-oppervlak. Gebruik de piëzo-elektrische trap, beweeg de gevangen kraal, ook bevestigd aan het RBC-oppervlak, lichtjes om de cel te vervormen en bevestig de kraal vervolgens aan de dekplaat.
      OPMERKING: Het is ook mogelijk om dezelfde cel uit de OT-metingen te gebruiken.
   2. Wijzig de positie van de z-as om de scherpgestelde afbeelding te vinden, waarbij het scherpstelvlak zich in het midden van de gekozen cel bevindt. Deze afbeelding toont het kleinere contrast met het grijsniveau in het midden van de cel dat gelijk is aan het grijsniveau buiten de cel (achtergrond).
   3. Wanneer de positie is vastgesteld, gebruikt u de camerasoftware om een film van de hele cel te maken met ongeveer 5.000 afbeeldingen op 8-bits en 256 pixels x 256 pixels, met een framesnelheid van 25 fps. Verplaats vervolgens de positie van de z-as 2 μm naar beneden of omhoog om een onscherpe afbeelding voor de gekozen cel te verkrijgen. Herhaal de parameters om een film voor deze situatie te maken.
   4. Zoek ten slotte, zonder de positie van de z-as te wijzigen, naar een gebied zonder cellen om dezelfde procedure te herhalen en een film van de achtergrond van de afbeelding te maken.
2. Acquisitie van contrastbeelden
   1. Converteer elk van de drie films naar drie gemiddelde afbeeldingen. Selecteer met ImageJ een van de films, klik op Image > Stacks > Z Project en kies de optie Gemiddelde intensiteit . Herhaal deze procedure voor de andere films om hun respectievelijke afbeeldingen te verkrijgen.
   2. Wijzig alle verkregen afbeeldingen van 8-bits naar drijvende-komma 32-bits. Klik met ImageJ op Afbeelding > Typ > 32-bits. Klik vervolgens op Analyseren > Metingen instellen en kies de optie Gemiddelde grijswaarde . Klik ten slotte nogmaals op Analyseren > meten.
   3. Klik vervolgens op Process > Image Calculator en deel de gefocuste afbeelding door de achtergrondafbeelding. Vermenigvuldig hiervoor de gemiddelde waarde van het grijsniveau van de scherpgestelde afbeelding. Verkrijg de gemiddelde waarde door te klikken op Process > Math > Multiply.
   4. Om de gemiddelde waarde te verkrijgen, kiest u de scherpgestelde afbeelding en klikt u vervolgens op Analyseren > meten. Voor de representatieve afbeelding is de gemiddelde waarde van het grijsniveau 69.199. Herhaal de bovenstaande procedures voor de onscherpe afbeelding. In dit geval is de gemiddelde waarde van het grijsniveau 69.231. Figuur 5 toont de scherpgestelde en onscherpe beelden voor en na de ingreep.
   5. Afbeeldingen kunnen tijdens bewerkingen het visuele contrast verliezen. Om de afbeeldingen beter te visualiseren, klikt u op Afbeelding > > helderheid / contrast aanpassen en selecteert u de optie Automatisch .
   6. Gebruik vervolgens de volgende relatie om het beeldcontrast te vinden:
      , waarbij N _Img het grijsniveau van de cel is, N₀ het grijsniveau buiten de cel en een constante parameter is die overeenkomt met het grijsniveau voor nul lichtintensiteit dat afhankelijk is van de camera.
   7. Om de waarde B te vinden, gebruikt u een vermogensmeter om de lichtintensiteit te meten. Voor elke waarde van de lichtintensiteit moet een video worden opgenomen; Verschillende intensiteitswaarden kunnen dus worden gerelateerd aan verschillende grijsniveaus. Zorg ten slotte voor een lineaire pasvorm en relateer B aan de nul lichtintensiteit¹⁵.
   8. Zoek de waarde van N₀, klik op het pictogram Polygoonselectie en teken een veelhoek zoals die in figuur 6. Klik vervolgens op het tabblad Analyseren en selecteer Meten om het gemiddelde grijsniveau voor het geselecteerde gebied te vinden. Elke afbeelding wordt gevormd door een reeks pixels en elke pixel heeft een bepaald grijsniveau. De set van alle grijsniveaus als gevolg van alle pixels waaruit de afbeelding bestaat, komt overeen met N_Img.
   9. Gebruik de contrastvergelijking om N _Img - N_o te bepalen en voer dit uit door Proces > Wiskunde > Aftrekken te selecteren. Deel het resultaat door N₀ - B. Zoek ten slotte het contrast voor de scherpgestelde (C 0) en onscherpe afbeelding (C1).
3. Het hoogteprofiel verkrijgen
   1. Om het hoogteprofiel te verkrijgen, gebruikt u de reeds beschreven methode¹³. Kortom, gebruik de Hartley-transformatie (FHT) om de RBC-dikte te verkrijgen. Klik in ImageJ op Process > FFT > FFT Options en kies vervolgens FHT.
   2. Trek de afbeeldingen C0 en C1 in ImageJ af met behulp > Proces > Wiskunde aftrekken om de afbeelding voor de volgende procedure te verkrijgen, C = C0 - C1.
   3. Klik voor afbeelding C op Proces-> FFT-> FFT-opties en kies vervolgens FHT om de Hartley-transformatie van de afbeelding uit te voeren. Deel vervolgens door de ruimtelijke frequentie q² met behulp van de op maat gemaakte plug-in DivideQ2. Klik op plugin > DivideQ2.
      OPMERKING: Het bestand DivideQ2.class moet worden gekopieerd naar de map plug-ins waar de ImageJ is geïnstalleerd. De plug-in wordt geleverd als een .class bestand (Aanvullend bestand 1) dat moet worden opgenomen in de plug-inmap van ImageJ.
   4. Voer vervolgens de inverse transformatie FHT uit met behulp van Process > FFT > FFT om een afbeelding te verkrijgen met een grijsniveau dat evenredig is met de hoogte van de cel.
   5. Klik ten slotte op Process > Math > Multiply om de resulterende afbeelding te vermenigvuldigen met de volgende constante:
      
      die wordt gedefinieerd op basis van de kenmerken van de afbeeldingen, het monster en de experimentele opstelling¹³. Hier is n = 1,51 de oliebrekingsindex, p = 0,0721 μm is de relatie tussen micrometers en pixels van de afbeeldingen, Δ n = 0,058 is het verschil tussen de RBC en de waterige medium brekingsindices, de afstand tussen de scherpstellende en onscherpe beelden (Z _f1 - Z _f2) = 2μm, en de grootte van de beelden, N 2 = 256 pxl².
   6. Gebruik de resulterende afbeelding om het hoogteprofiel te verkrijgen (figuur 7). De resulterende afbeelding wordt in ImageJ gebruikt om verschillende hoogteprofielen te observeren. Het hangt af van waar in de cel de gele verticale lijn is geplaatst, bijvoorbeeld in figuur 7 wordt een hoogteprofiel verkregen dat wordt beperkt door de verticale lijn, observeer dit door op Ctrl + K te drukken.
4. Vormfactor
   1. Nadat u de afbeelding hebt gevonden die het RBC-hoogteprofiel bevat, gebruikt u het onscherpe contrast van 2 μm om een set van twee afbeeldingen in ImageJ te maken. Klik op Afbeelding > Stapels en selecteer vervolgens de optie Afbeeldingen om te stapelen. Als u de vormfactor wilt vinden, gebruikt u een aangepaste ImageJ-macro om de stapel te analyseren. De aangepaste ImageJ-macro kan worden gedownload als aanvullend bestand 2.
      OPMERKING: Het programma gebruikt de onscherpe afbeelding om de celranden te bepalen. Vervolgens wordt de omtrek bepaald met behulp van de afbeelding die het hoogteprofiel bevat, voor elke horizontale positie. Naast de randen bepaalt het de omtrek, evenals de inverse van de omtrek. De som van de inverse perimeterwaarden, vermenigvuldigd met de pixeldikte, komt overeen met de inverse van de vormfactor.
   2. Voeg de pixel/micrometer relatie in het programma in. Verkrijg deze waarde uit het microscoopobjectieve kalibratie-experiment. In het gebruikte voorbeeld is de waarde 13,87 pixel/μm.
   3. Kies de horizontale beginpositie om de gele lijn in de eerste afbeelding van de stapel te plaatsen. Begin de lijn vóór het begin van de cel en teken deze voorbij de verticale grenzen van de cel. In het voorbeeld heeft de gele lijn een lengte van 153 pixels en ligt de beginpositie tussen i = 70, y1 = 80 en i = 70 en y2 = 195. Verplaats vervolgens de gele lijn horizontaal totdat de uiteindelijke positie f = 245, y1 = 80 en f = 245 en y2 = 195 is.
   4. Om ten slotte de celranden, de omtrek en de inverse van de omtrek te vinden, selecteert u het tabblad Macro en klikt u op Macro uitvoeren. De macro levert een tabel met de randpositie, de omtrek en de inverse van de omtrek en een afbeelding van de geanalyseerde cel. Controleer of de randen van deze afbeelding vergelijkbaar zijn met de randen van figuur 7, anders herhaalt u de procedure.
   5. Gebruik de som van de inverse van de omtrek om de vormfactor⁸ te vinden.

7. Zacht glasachtig reologiemodel en experimentele analyse

1. De experimentele gegevens in een tabel ordenen
   1. Maak een nieuwe tabel in de analysesoftware door op het tabblad Bestand te klikken. Bepaal 10 verschillende kolommen (van c0 tot c9) voor de volgende parameters: gebruikte hoekfrequenties (rad/s): c0; K' (pN/μm) waarden verkregen voor elke hoekfrequentie: c1; ErrK': c2; K" (pN/μm) waarden verkregen voor elke hoekfrequentie: c3; ErrK": c4; G'(Pa)-waarden verkregen voor elke hoekfrequentie: c5; ErrG': c6; G" (Pa)-waarden verkregen voor elke hoekfrequentie: c7; ErrG": c8 en F_f met de respectievelijke fout: c9 (figuur 8). Gebruik de volgende formule om de volgende kolommen te vullen:
      C5 = (3 x C1) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C6 = (3 / (8 x 0,087 x 1,28)) x sqrt (C2^2 + (C1 x 0,01 / 1,28)^2 + (C1 x 0,008 / 0,087) ^ 2)
      C7 = (3 x C3) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C8 = (3 / (8 x 0,087 x C4)) x sqrt (C4^2 + (C3 x 0,01 / 1,28)^2 + (C3 x 0,008 / 0,087)^2)
2. Plotting curve G' (ω) versus G" (ω)
   1. Om de curve G' (ω) versus G" (ω) in de analysesoftware te genereren, gebruikt u de gegevens uit de vorige tabel. Klik op Gallery > Linear en kies het Scatter Plot formaat.
   2. Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer de kolom G" als de x-as en de G' -kolom als de y-as. Klik ten slotte op de knop Plot om de grafiek te verkrijgen.
   3. Om de foutbalken in de plot toe te voegen, klikt u op het plotvenster en klikt u vervolgens op Plot > Error Bars. Er wordt een nieuw venster geopend. Markeer eerst de optie Y Err . Er wordt een ander venster geopend, genaamd Error Bar Settings .
   4. Klik op % van de waarde, selecteer Gegevenskolom en klik vervolgens op de kolom ErrG'. Klik ten slotte op OK > Plot, de foutbalken voor de y-waarden verschijnen. Herhaal dezelfde procedure voor x-aswaarden door nu het vierkant X Err en de juiste kolom voor de ErrG" te selecteren. De uiteindelijke plot zal vergelijkbaar zijn met die in figuur 9.
3. De parameters aanpassen aan het zachte glasachtige reologiemodel
   OPMERKING: De gegevensanalyse is verdeeld in twee delen: 1) curve die past bij de grafiek G' (ω) versus G" (ω) om de parameters Γ en G_m te verkrijgen; 2) kromme passend bij G' (ω) en G" (ω) als functie van de frequentie ω, om de machtswet exponent α te verkrijgen.
   1. Curve die past bij de grafiek G' (ω) versus G" (ω) om de parameters Γ en G_m te verkrijgen.
      1. Klik op het tabblad Curve Fit en selecteer Fit1. Er wordt een nieuw venster geopend. Selecteer het vierkant en klik op de knop Definiëren . Er verschijnt een venster met de naam algemene curve fit definition. Typ de volgende vergelijking:
         m1 + m0/m2
         waarbij m1 = 61,576; m2 = 1, met een toegestane fout van 1 x ^10-5. Hier staat m0 voor G ", m1 voor G_m en m2 voor Γ.
         OPMERKING: Voor m1 en m2 is het noodzakelijk om hun respectieve waarden te schatten tijdens de definitie van de curve fit. Bovenstaande schattingen zijn gebaseerd op het getoonde voorbeeldexperiment. Schat in de experimenten de aantallen op basis van de waarden die in de grafiek zijn waargenomen.
      2. Klik op de knop OK in beide vensters en de fitting verschijnt, zoals weergegeven in Figuur 10 - een zwarte curve. Controleer de juiste waarden voor m1 en m2, vermeld in de curve fit tabel die bij de plot verscheen.
   2. Curve passend bij G ' en G" als functie van de hoekfrequentie ω
      1. Maak vervolgens twee andere plots, namelijk G' als functie van ω en G' als functie van ω. Plaats de foutbalken alleen op de y-as, zoals eerder is aangetoond.
      2. Herhaal de procedure voor het aanpassen van curven, maar selecteer nu in de selecties voor het aanpassen van curven de optie G" en schrijf vervolgens in Algemene aanpassing > curvedefinitie de volgende vergelijking:
         
         In dit geval werd m1 geschat op de waarde van G" (ω) = 23,683 Pa, wanneer ω = 6,3 rad/s; M2 werd geschat op 0,5 (onthoud dat M2 de exponent α is en varieert tussen 0 en 1). Voer de waarde in voor Γ = 2,0293, volgens het resultaat van m2 in figuur 10.
      3. Markeer de optie Gewichtsgegevens. Klik na al deze procedures op OK en er verschijnt een curve die lijkt op die in figuur 11 - er verschijnt een blauwe curve. De waarden voor α, α = 0,63 ± 0,02 en G 0, G 0 = (3,7 ± _0,3)Pa verschijnen. Gebruik deze waarden om in de volgende curve, G' (ω), te passen.
      4. Klik op de volgende curve, herhaal de curve-fitting procedure maar schrijf nu in de General Fit Curve Definition de volgende vergelijking:
         
         In dit geval is m3 slechts een geschatte waarde van α om de eerder verkregen waarde te bevestigen. Gebruik de waarden voor G ₀ = 3,703 en G' (ω) = 23,683 Pa wanneer ω = 6,3 rad/s.
      5. Nogmaals, voeg 1 x ^10-5 toe als toegestane fout en markeer de optie Gewichtsgegevens. Klik na al deze procedures op OK en er verschijnt een curve die lijkt op die in figuur 11 - er verschijnt een groene curve.

Resultaten

Figuur 1 geeft de schema's weer van het OT-systeem dat wordt gebruikt voor de reologische metingen. Figuur 2 toont de schema's van het microrheologie-experiment met beide bollen en er wordt ook een representatieve RBC getoond. Figuur 3 toont een typische kromme voor de amplitudes van beide bollen als functie van de tijd wanneer de sinusoïdale bewegingen worden geproduceerd door het piëzo-elektrische stadium. Terwijl de referentiebol...

Discussie

In dit protocol wordt een geïntegreerde methode op basis van een optisch pincet en onscherpe microscopie gepresenteerd om de visco-elastische eigenschappen van RBC's kwantitatief in kaart te brengen. Resultaten voor de opslag- en verliesschuifmoduli, samen met de schaalexponent die de zachte glasachtige reologie van RBC kenmerkt, worden bepaald. Toepassing van dit protocol voor verschillende experimentele omstandigheden, zoals in fysiologische situatie⁸ of langs elke fase van P. falciparum

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35mm kweekschalen	Corning	430165
Rundereiwit albumine	Sigma-Aldrich	A9418
Dekglasjes	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 en VD12432Y1A.01
Schalen met glazen bodem	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Dompelolie	Nikon	MXA22165
Inverteer microscoop	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscoopcamera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer kamer	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objectieflens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H en Plan APO 10x XXNA PH2
Optische tafel	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyreen microsferen	Polysciences	17134-15
Rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Siliconenvet	Dow Corning	Z273554
Trap positionering	PI	P-545.3R8S
Pipet	Gilson	P1000