Identificatie van hemolytische en fosfolipase-activiteit in ruwe extracten van zeeanemonen door Eenvoudige Bioassays

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om ruw gifextract uit zeeanemoon te verkrijgen en de hemolytische en fosfolipase-activiteit ervan te detecteren.

Samenvatting

De samenstelling van zeeanemoongif omvat polypeptide- en niet-eiwitmoleculen. Cytolytische componenten hebben een hoog biotechnologisch en biomedisch potentieel voor het ontwerpen van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. Zeeanemoongif lokaliseert zich in glandulaire cellen van ectoderm en subcellulaire structuren die nematocysten worden genoemd, die beide verspreid zijn over het zeeanemoonlichaam. Deze eigenschap impliceert uitdagingen omdat de cellen en nematocysten moeten worden gelyseerd om de gifcomponenten vrij te geven met andere niet-toxische moleculen. Daarom is het gif eerst afgeleid van een ruw extract (mengsel van verschillende en diverse moleculen en weefselresten). De volgende stap is het detecteren van polypeptiden met specifieke bioactiviteiten. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen en bioassay om de aanwezigheid van cytolysinen te identificeren. De eerste stap omvat goedkope en eenvoudige technieken (geroerde en vries-dooicyclus) om cytolysines vrij te geven. We verkregen de hoogste cytolytische activiteit en eiwit (~ 500 mg eiwit uit 20 g droog gewicht). Vervolgens werd de polypeptidecomplexiteit van het extract geanalyseerd door SDS-PAGE-gel die eiwitten detecteerde met molecuulgewichten tussen 10 kDa en 250 kDa. In de hemolytische test gebruikten we schapenrode bloedcellen en bepaalden HU₅₀ (11,1 ± 0,3 μg / ml). Daarentegen werd de aanwezigheid van fosfolipase in het ruwe extract bepaald met behulp van eigeel als substraat in een vast medium met agarose. Over het algemeen gebruikt deze studie een efficiënt en goedkoop protocol om het ruwe extract te bereiden en past repliceerbare bioassays toe om cytolysinen, moleculen met biotechnologische en biomedische belangen te identificeren.

Inleiding

Zeedieren zijn een rijke bron van biologisch actieve verbindingen. In de afgelopen decennia heeft de samenstelling van zeeanemoongif wetenschappelijke aandacht getrokken, omdat het een diversiteit aan polypeptiden omvat met hemolytische, cytotoxische, enzymatische (fosfolipase, protease, chitinase) en neurotoxische activiteit en remmende effecten op proteolytische activiteit¹. Bovendien zijn deze polypeptiden potentiële bronnen voor de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen in biotechnologisch en therapeutisch gebruik ^2,3.

Er zijn weinig rapporten over zeeanemoongif en zijn moleculaire componenten vanwege de complexiteit van het verkrijgen van het gif, zelfs isolatie en karakterisering van toxines. De extractiemethoden die in de rapporten werden gebruikt, betroffen lysis en het legen van de inhoud van cellen die gerelateerd en niet gerelateerd zijn aan de gifproductie¹.

Een bijzonder kenmerk in alle cnidarians is de afwezigheid van een systeem voor productie en afgifte van het gif gecentraliseerd in een enkel anatomisch gebied. In plaats daarvan zijn de nematocysten structuren die het gif ^{4,5 houden}. Andere soorten cellen, epidermale kliercellen genaamd, scheiden ook toxines af en zijn ook verdeeld over het lichaam van zeeanemonen⁶.

De eerste en meest cruciale uitdaging bij het verkrijgen van het gif is het genereren van een extract met voldoende manipulatie in daaropvolgende processen, zonder de inactivatie of afbraak van labiele eiwitten. Vervolgens moeten de cellen worden gelyseerd en moeten de componenten - in dit geval polypeptiden - efficiënt en snel worden geëxtraheerd, waarbij proteolyse en hydrolyse worden vermeden terwijl andere cellulaire componenten worden^{geëlimineerd 7}.

Verschillende methoden worden gebruikt om het ruwe extract van een zeeanemoon te verkrijgen; sommige omvatten het opofferen van het organisme, terwijl anderen toestaan dat het in leven wordt gehouden. Methoden die het gebruik van het hele lichaam van het organisme impliceren, zorgen voor de afgifte van de meeste toxines uit het gif⁸, vergeleken met methoden die organismen in leven houden, die slechts enkele componenten van het gif⁹ extraheren. De bereiding van een extract vereist een evaluatie van de aanwezigheid en potentie van een stof van belang door middel van een specifieke bioassay, die strategieën omvat om de farmacologische effecten te observeren met behulp van in vivo of in vitro methoden¹⁰.

Zeeanemoongif bevat cytolytische polypeptiden, porievormende toxines (PFT's)¹¹ en fosfolipase¹²; deze moleculen zijn modellen in de studie van eiwit-lipide interactie, moleculaire hulpmiddelen in kankertherapie en biosensoren op basis van nanopore³. De classificatie van zeeanemoon PFT's wordt uitgevoerd op basis van hun grootte of molecuulgewicht, van 5 kDa tot 80 kDa. De 20 kDa PFT, de meest bestudeerde en bekend als actinoporinen¹¹, is van bijzonder belang vanwege zijn biomedische potentieel bij de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen voor mogelijke toepassingen als antikanker, antimicrobiële en op nanoporiën gebaseerde biosensoren. Een ander cytolysine, waaronder fosfolipase, met name fosfolipase A2 (PLA2)¹³, geeft een vetzuur af en hydrolyseert fosfolipiden, waardoor het celmembraan wordt gedestabiliseerd. Door dit werkingsmechanisme belooft PLA2 een essentieel model te zijn voor de studie en toepassingen bij ontstekingsziekten. Het zou kunnen dienen als een model voor studies van lipidengedrag in het celmembraan¹⁴.

Hier beschrijven we een efficiënt protocol voor het verkrijgen van het ruwe extract van zeeanemoon Anthopleura dowii Verrill, 1869, en het detecteren van hemolysines en fosfolipases. Beide zijn relevante toxines die kunnen worden gebruikt als een sjabloon om nieuwe moleculaire hulpmiddelen te ontwerpen.

Protocol

De zeeanemonen werden verzameld volgens de richtlijnen van de Nationale Commissie voor Aquacultuur, Visserij en Voedsel van de Federale Overheid van Mexico (vergunningsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bio-ethische commissie van het Instituut voor Biotechnologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico keurde alle experimenten met zeeanemonen goed. Het schapenbloedmonster werd gekocht bij het Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Mexico).

1. Verzameling van organismen

1. Verzamel zeeanemoon A. dowii.
   OPMERKING: Hier werden de organismen verzameld tijdens ebperioden in de intergetijdenzone voor de kust van Ensenada Baja, Californië, Mexico (figuur 1A, B).
2. Vervoer de organismen naar het laboratorium in containers met zeewater (figuur 1C).
3. Reinig in het laboratorium de organismen met gedestilleerd water met de hand om de grote substraatdeeltjes te verwijderen die zich aan het lichaam hechten.
4. Vries de organismen onmiddellijk in bij -80 °C in een ultravriezer gedurende 72 uur.
5. Plaats de organismen in speciale glazen voor vriesdrogen, met lyofilisatieomstandigheden van -20 °C, 0,015 psi, gedurende 48 uur.
6. Bewaar de gelyofiliseerde organismen bij -20 °C tot gebruik.

2. Hydratatie van het weefsel

1. Reconstitueer 20 g drooggewicht van gelyofiliseerde organismen met 60 ml (1/3 w / v) van 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7,5 en 1 remmercocktailtablet (tabel met materialen).
2. Roer het monster in een magneetroerder gedurende 12 uur continu bij ~800 rpm, 4 °C.

3. Afgifte van toxines

1. Om cellysis en nematocystafscheiding te induceren, vriest u het monster gedurende 12 uur in bij -20 °C en plaatst u de container vervolgens in water bij kamertemperatuur (RT) totdat het tot 90% ontdooit. Herhaal deze procedure drie keer.
   OPMERKING: Het monster ontdooit niet 100%; het is van cruciaal belang om het monster op ~4 °C te houden om eiwitafbraak te voorkomen.
2. Observeer de nematocyst geloosd onder een confocale microscoop. Neem 10 μL van het monster op een dia en plaats er een coverslip overheen. Observeer onder een confocale microscoop bij 100x en 60x vergroting. Hier was een kleurstof niet nodig.
3. Verwerk de beelden die zijn vastgelegd in de confocale microscoop in ImageJ-software (versie 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, VS, https://imagej.nih.gov/ij).
4. Als de tubulus in de nematocyst loskomt en buiten is, worden de nematocysten geloosd; ga dan verder met de volgende stap. Voer anders nog maar één vries-dooicyclus uit.
5. Om het extract te verduidelijken, centrifugeert u het monster bij 25.400 x g gedurende 40 minuten, 4 °C, herstelt u het supernatant en centrifugeert u het opnieuw. Herhaal deze stap 3-4 keer.
6. Recupereer het supernatant en gooi de pellet weg. Het supernatant of ruwe extract bevat de gifcomponenten (toxines) en andere celmoleculen, zoals lipiden, koolhydraten en nucleïnezuren.

4. Kwantificering van het totale eiwit

1. Bepaal de eiwitconcentratie van het ruwe extract met behulp van een commerciële Bradford colorimetrische assay¹⁵ kit (Tabel met materialen).
2. Verdun het kleurstofreagens (een deel kleurstof met vier delen gedestilleerd water).
3. Bereid runderserumalbumine (BSA) Fractie V (Table of Materials)-oplossing bij een concentratie van 1 mg/ml in fosfaatbuffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,5).
4. Bereid de in tabel 1 vermelde oplossingen in drievoud voor.
5. Meng elke oplossing krachtig in een shaker gedurende 4 s.
6. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij RT, zonder te schudden.
7. Meet de absorptie (AU) bij 595 nm.
8. Plot de gemiddelden van de BSA-absorpties van het monster (AU versus eiwitconcentratie) en bepaal de vergelijking van de grafiek (vergelijking 1).
        Vergelijking 1
   waarbij y de absorptie is, m de helling van de lijn, x de eiwitconcentratie en b de y-intercept. Om de concentratie van ruw extract te berekenen, lost u de x als volgt op:
        Vergelijking 2

5. Bepaal de complexiteit van polypeptidegif

1. Monteer de glazen container voor verticale gel-elektroforese volgens de handleiding.
2. Bereid acrylamidemengsel (30%): 29,2 g acrylamide, 0,8 g bis-acrylamide, het uiteindelijke volume van 100 ml. Filtreer de oplossing met een membraan van 0,45 μm. Bewaar de oplossing in een donkere fles bij 4 °C. Bereid vervolgens het mengsel voor op de oplossende gel (tabel 2).
3. De SDS-PAGE gel bestaat uit een oplossende gel en een stapelgel. Bereid de gels volgens de in tabel 2 gedefinieerde oplossingsvolumes. Zorg er tijdens de bereiding voor dat elk mengsel op 4 °C wordt gehouden om de polymerisatietijd te verkorten.
   OPMERKING: Het volume van elk mengsel varieert afhankelijk van het merk van de gebruikte apparatuur; voor dit protocol komen de volumes overeen met de bereiding van 15% acrylamidegel, 0,75 mm dik, voor een verticale elektroforesekamer (tabel met materialen).
4. Nadat het acrylamide is gepolymeriseerd, voeg je ~ 10 minuten het mengsel van stapelgel toe.
5. Bereid het mengsel voor op de stapelgel, voeg het onmiddellijk toe aan de glasplaten en plaats een kam om de putten te vormen voor het laden van de monsters.
6. Zodra de stapelgel is gepolymeriseerd (~ 15 min), verwijdert u de kam en plaatst u de glazen container in een kamer voor verticale elektroforese.
7. Plaats 200 ml elektrodebuffer (0,25 M Tris, 0,192 M glycine, 0,1% SDS) in de elektroforesekamer.
8. Analyseer het ruwe extract: Meng 30 μg ruw extract met 5 μL eiwitbelastingsbuffer (25% glycerol, 15% natriumdodecylsulfaat, 25% 2-mercaptoethanol, 0,125 mM Tris pH 7, broomfenolblauw 0,1 mg / ml) om eiwitten te denatureren. Het uiteindelijke volume moet <50 μL bedragen.
9. Verwarm bij 90 °C gedurende 5 minuten, koel af en centrifugeer gedurende 3 s bij 1.400 x g.
10. Laad de monsters in de putjes van de stapelgel. Laad een standaard moleculaire gewichtsladder.
11. Voer elektroforese uit op 25 mA constant gedurende 1 h 30 min.
12. Verwijder de glazen containers uit de elektroforesekamer om door te gaan met het kleuren van de geleiwitten.

6. Eiwitkleuring

1. Spoel de gel in 50 ml gedestilleerd water om vuil van de bufferelektrode te verwijderen.
2. Gooi het water weg.
3. Om de diffusie van de geleiwitten te voorkomen, voegt u de fixatieoplossing toe (60 ml ethanol, 20 ml azijnzuur en 20 ml gedestilleerd water, eindvolume 100 ml). Incubeer bij RT gedurende 40 minuten met schudden bij 80 tpm. Decanteer de oplossing.
4. Voeg de eiwitvernetingsoplossing toe (15 ml ethanol, 0,25 ml glutaaraldehyde, 50 ml gedestilleerd water, eindvolume 65,25 ml) en incubeer gedurende 30 minuten bij RT met schudden bij 80 tpm. Verwijder de oplossing.
5. Was de gel met 100 ml gedestilleerd water gedurende 5 minuten en verwijder het water. Herhaal deze procedure vier keer.
6. Voer eiwitkleuring uit met 50 ml Coomassie briljantblauwe R-250 gefilterde oplossing (40% methanol, 10% azijnzuur, 50% gedestilleerd water, 0,1% kleurstof, eindvolume 100 ml), roerend bij 60 tpm in een laboratorium roterende oscillator bij RT gedurende 15 minuten.
7. Herstel de oplossing, die kan worden gebruikt om andere gels te bevlekken.
8. Om de overtollige kleurstof te elimineren, voegt u een ontsmettende oplossing toe (40 ml methanol, 10 ml azijnzuur, 50 ml gedestilleerd water). Blijf roeren (80 rpm) bij RT totdat de banden (gekleurde eiwitten) visualiseren.
9. Bewaar de gel in 50 ml gedestilleerd water en scan de afbeelding in een geldocumentatiesysteem.

7. Bereid rode bloedceloplossing

1. Extract 1 ml bloed uit de halsader van een schaap.
2. Verwijder de naald uit de spuit en laat het bloed onmiddellijk in een buis met 50 ml Alsever-oplossing (0,002 M citroenzuur, 0,07 M NaCl, 0,1 M dextrose en 0,027 M natriumcitraat als antistollingsmiddel, pH 7,4).
3. Keer de oplossing langzaam drie keer om.
4. Bewaren bij 4 °C voor overbrenging naar het laboratorium.
5. Centrifugeer bij 804 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
6. Resuspend de pellet in 30 ml Alsever-oplossing. Voeg de oplossing toe door deze langs de binnenwanden van de buis te schuiven en, met behulp van een pasteur plastic pipet, de cellen langzaam opnieuw op te suspenderen. Centrifugeer opnieuw bij 804 x g gedurende 5 min, 4 °C. Herhaal deze procedure totdat het supernatant is opgehelderd.
7. Voeg 15 ml Alsever-oplossing toe; resuspend de pellet langzaam met een pasteur plastic pipet.
8. Handhaaf het uiteindelijke volume van De Alsever-oplossing om een concentratie van ongeveer 2 x 10⁶ cellen/ml te bereiken. Gebruik vervolgens een Neubauer-kamer of hemocytometer om de cellen te tellen.
   OPMERKING: Tel de erytrocyten in de hemacytometerschuif (Verbeterde Neubauer). De glijbaan is een glijbaan van 30 mm x 70 mm x 4 mm. Het midden heeft twee zilveren voetplaten (figuur 2A) (een boven- en een onderraster), elk 3 mm x 3 mm, en twee kanalen aan de zijkanten van het raster. Het tellen van cellen bevindt zich in de hoek- en middenvierkanten (rode vierkanten in figuur 2B). De optimale concentratie van cellen voor het tellen moet in de orde van 10⁶ cellen liggen. De centrale doos heeft een oppervlakte van 0,1 cm², wat overeenkomt met 0,0001 ml.
9. Plaats een deklap over de dia.
10. Plaats 10 μL van het monster tussen de dia en de coverslip en wacht tot het monster is uitgedeeld.
11. Voer in een optische microscoop (vergroting 60x) de telling uit in het eerste vierkante vak. Tel alleen de cellen in het middelste raster en de cellen die de bovenste of de linkermarge van het vak raken.
12. Bepaal de celconcentratie met behulp van de volgende vergelijking:
    Vergelijking 3
    Als het monster zeer geconcentreerd is en verdunning vereist is, gebruik dan de volgende vergelijking:
    Vergelijking 4
    OPMERKING: Wanneer u de erytrocytenoplossing voor de hemolysetest inneemt, homogeniseert u de oplossing langzaam met een plastic Pasteur-pipet.
13. Voer de stappen in drievoud uit om fouten te verminderen.

8. Hemolyse-test

1. Bereid de in tabel 3 aangegeven oplossingsmengsels (in drievoud) in conische 96-well-platen.
   OPMERKING: Meng de erytrocyten langzaam om een homogene suspensie te behouden.
2. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C, zonder te schudden.
3. Centrifugeer de plaat bij 804 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
4. Recupereer het supernatant in een andere 96-putplaat met een vlakke bodem.
5. Als het ruwe extract cytolysinen bevat, zullen erytrocyten lyseren en hemoglobine afgeven. Lees de absorptie af bij 415 nm.
6. Bereken het hemolysepercentage met behulp van de volgende vergelijking:
   % Hemolyse = ((Acrude extract-AAlsever buffer) / (AH₂O-AAlsever)) x 100
   OPMERKING: Acrude-extract, AAlsever-buffer en AH₂O komen overeen met respectievelijk de absorptie van erytrocyten met het ruwe extract, de absorptie van De alsever-oplossing en de absorptie van gedestilleerd water.
7. Voer een hemolysetest uit voor en na elke vries- en ontdooicyclus met 50 μg totaal eiwit uit het ruwe extract.
8. Bepaal het aantal vries- en ontdooicycli dat nodig is om 100% hemolytische activiteit te bereiken.
9. Bereken de hoeveelheid extract die hemolyse produceert in 50% van de erytrocyten (HU₅₀); volg hetzelfde protocol als beschreven in tabel 3, verhoog de hoeveelheid ruwe zeeanemoonextract en ontwerp het perceel met sigmoïdale aanpassingen met behulp van geschikte software (bijv. Oorsprong, Materialentabel).

9. Fosfolipase-test

1. Was een kippenei met 1% SDS in gedestilleerd water.
2. Scheid het eigeel van het eiwit onder steriele omstandigheden.
3. Bereid 50 ml 0,86% NaCl-oplossing voor en filtreer door een filter van 0,22 μm. Bereid vervolgens oplossing A: Voeg 12 ml eigeel en 36 ml 0,86% NaCl-oplossing toe.
4. Bereidingsoplossing B: Meng 300 mg agarose in 50 ml buffer (50 mM Tris, pH 7,5), filtreer door een filter van 0,22 μm. Verwarm de oplossing in een magnetron tot het kookt. Koel af in warm water tot 43-45°C.
5. Bereiding oplossing C: Bereid 10 mM CaCl₂ en filtreer het met een filter van 0,22 μm.
6. Bereiding Oplossing D: 10 mg rhodamine 6G in 1 ml gedestilleerd water.
7. Voeg onder steriele omstandigheden (laminaire stromingskap) 500 μL oplossingen A en C toe aan oplossing B en 100 μL oplossing D, meng en giet 25 ml in elke petrischaal (90 x 15 mm).
8. Wacht tot de oplossing stolt onder steriele omstandigheden (30 min).
9. Maak putten (~ 2-3 mm diameter) met een dunne buis.
10. Voeg in totaal 20 μL fosfaatbuffer (negatieve controle) toe in de ene put en 20 μL van een bepaalde fosfolipase (positieve controle) in een andere put.
11. Plaats verschillende hoeveelheden van het ruw extract eiwit, 5, 15, 25, 35, 45 μg, in de resterende putten, elk in een eindvolume van 20 μL.
12. Wacht tot de agar alle monsters adsorbeert (30 min).
13. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 uur.
14. Als zich rond de put een halo vormt, duidt dit op fosfolipase-activiteit. Meet de halo gevormd met een vernier remklauw.
    OPMERKING: Voer het experiment in drievoud uit (stappen van 9.1-9.14).

Resultaten

De representatieve resultaten van het protocol dat werd gebruikt om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen, toonden aan dat het combineren van twee technieken (agitatie en cycli van invriezen en ontdooien) een efficiënte afvoer van nematocysten opleverde, en de totale hoeveelheid eiwit was 500 mg (8 mg / ml) (figuur 3).

De eiwitcomplexiteit van het ruwe extract kon worden waargenomen vanaf 10 kDa en meer dan 250 kDa via SDS-PAGE-elektroforese. Daarnaast we...

Discussie

De grote vraag naar nieuwe verbindingen met toepassingen op verschillende gebieden van wetenschap en industrie heeft geleid tot de studie van gif. Gif vertegenwoordigt een rijke bron van moleculen die dient als een sjabloon voor het genereren van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. De complexiteit van deze gifstoffen vereist echter de implementatie en combinatie van verschillende methoden om ze te verkrijgen en te bestuderen.

Hier tonen we een methode voor het verkrijgen en analyseren van het gif...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL conical centrifuge tube	Corning	430766
2-Bromofenolblauw	Sigma	B75808
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
50 mL conische centrifugeerbuizen	Corning	430828
Acetic Acid Glacial	J.T. Baker	9515-03
Acrylamide	Promega	V3115
Agarose	Promega	V3125
Bisacrylamide	Promega	V3143
Bovine Serum Albumine Fractie V	Sigma	A3059-100G
Bradford Eiwit Assays	Bio-Rad	5000006
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C3306
Celcultuur platen 96 well, V-bodem	Corning	3894
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Centrifugebuizen	Corning	CLS430829
ChemiDoc MP systeem	Bio-Rad	1708280
Citroenzuur	Sigma-Aldrich	251275
Duidelijke platte 96-Well Platen	Thermo Scientific	3855
Coomassie Brillant Blauw G-250	Bio-Rad	#1610406
Coomassie briljant blauw R-250	Bio-Rad	1610400
Dextrose	J.T. Baker	1916-01
Ductless Enclosure	Labconco	Vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Bio Rad.		Gel Documentatie Systeem
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-4L
Hemocytometer	Marienfeld	650030
ImageJ (Software)	NIH, USA	Versie 1.53c
Incubator 211	Labnet	I5211 DS
Methanol	J.T. Baker	9049-03
Mini-PROTEAN tetra cel	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Baker	3824-01
NaCl	J.T. Baker	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Baker	3818-05
Origin software		versie 9	Om de grafiek te ontwerpen met sigmoidale aanpassingen
Petridish	Falcon	351007
Pipetman kit	Gilson	F167380
Precast mini gel	BioRad	1658004
Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26620
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	252433
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
Sodium citraat dihydraat	JT Baker	3646-01
Spectrofotometer	THERMO SCIENTIFIC	G10S UV-VIS
Tris Base	Sigma-Aldrich	77-86-1
Volt Power Supply	Hoefer	PS300B