Evaluatie van vetzuuroxidatie in gekweekte botcellen

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een test om het vermogen tot vetzuuroxidatie in culturen van primaire botcellen of relevante cellijnen te beoordelen.

Samenvatting

Botvorming door het differentiëren van osteoblasten zal naar verwachting een aanzienlijke energetische input vereisen, aangezien deze gespecialiseerde cellen grote extracellulaire matrixeiwitten moeten synthetiseren die botweefsel vormen en vervolgens de ionen moeten concentreren die nodig zijn voor de mineralisatie ervan. Gegevens over de metabolische behoeften van botvorming komen snel naar voren. Hoewel er nog veel te leren valt, wordt verwacht dat verstoringen in het intermediaire metabolisme bijdragen aan skeletaandoeningen. Hier wordt een protocol geschetst om het vermogen van osteoblastische cellen te beoordelen om ¹⁴C-gelabelde vetzuren te oxideren tot ¹⁴CO₂ en in zuur oplosbare metabolieten. Vetzuren vertegenwoordigen een rijke energiereserve die na het voeden of na hun bevrijding uit de vetweefselvoorraden uit de bloedsomloop kan worden opgenomen. De test, uitgevoerd in T-25 weefselkweekkolven, is nuttig voor de studie van genwinst of functieverlies op het gebruik van vetzuren en het effect van anabole signalen in de vorm van groeifactoren of morfogenen die nodig zijn voor het behoud van botmassa. Er worden ook details gegeven over het vermogen om het protocol aan te passen om de oxidatie van glucose of aminozuren zoals glutamine te beoordelen.

Inleiding

De osteoblast, afgeleid van voorlopercellen die aanwezig zijn in het beenmerg en het periosteum, is verantwoordelijk voor de synthese en afscheiding van de gemineraliseerde, collageenrijke matrix waaruit botweefsel bestaat. Om deze energetisch dure onderneming te vervullen en bij te dragen aan het levenslange behoud van de integriteit van het skelet, behouden deze gespecialiseerde cellen een overvloedig ruw endoplasmatisch reticulum dat essentieel is voor het synthetiseren van extracellulaire matrixeiwitten ^1,2 en talrijke mitochondriën met een hoog membraanpotentieel om de vereiste chemische energie uit brandstofsubstraten te oogsten ^3,4. Het belang van deze laatste functie wordt geïllustreerd door het stoppen van de botgroei en de ontwikkeling van osteopenie ^5,6 geassocieerd met energietekorten zoals bij caloriebeperking. De identiteit van de voorkeursbrandstofbron van de osteoblast en de gegevens over de metabolische behoeften van de osteoblast tijdens differentiatie of als reactie op anabole signalering komen naar voren ^7,8.

Vetzuren met lange ketens vertegenwoordigen een rijke toevoer van chemische energie die aanwezig is in serum en vrijkomt uit vetweefsel als reactie op een verminderde calorie-inname of een verhoogd energieverbruik. Na het celmembraan te hebben doorlopen en af te ligen naar co-enzym A om de oplosbaarheid te vergroten, worden vetacyl-CoA's in de mitochondriale matrix getransporteerd door de dubbele carnitinepalmitoyltransferase-enzymen op de buitenste en binnenste mitochondriale membranen en carnitine-acylcarnitine translocase⁷. Binnen de mitochondriale matrix verkort de β-oxidatiemachineketen acyl-CoA in een 4-stappenproces dat acetyl-CoA genereert dat de TCA-cyclus (tricarbonzuurcyclus) ingaat en equivalenten reduceert. Katabolisme van palmitaat (C₁₆), de meest voorkomende vetzuren bij dieren, levert via deze route ~131 ATP op, aanzienlijk meer dan de ~38 ATP die wordt gegenereerd door glucose-oxidatie⁷.

Traceringsstudies met behulp van radioactief gelabelde lipiden gaven aan dat bot een aanzienlijk deel van de circulerende lipiden opneemt ^9,10, terwijl genetische ablatie van enzymen die cruciaal zijn voor lipidenkatabolisme leidt tot een vermindering van de osteoblastactiviteit en botverlies ^9,11. Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een ¹⁴C-gelabeld vetzuur om het vermogen van gekweekte osteoblasten te evalueren om vetzuren volledig te metaboliseren tot CO₂ of zuuroplosbare metabolieten, die tussenstappen in het oxidatieproces vertegenwoordigen. Hoewel het gebruik van radioactiviteit vereist is, is de methode eenvoudig, vereist het beperkte investeringen en kan het worden aangepast ten voordele van andere radioactief gelabelde metabolieten en celtypen.

Protocol

Dit protocol gebruikt de omzetting van [^1-14C]-oliezuur in ¹⁴CO₂ als indicator van de oxidatiecapaciteit van vetzuren. Het lokale bureau voor stralingsveiligheid keurde het protocol voor het gebruik van radioactieve materialen goed voordat de experimenten werden gestart. Alle bestralingsprocedures werden uitgevoerd achter een plexiglas schild met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Het lokale Comité voor Dierenverzorging en -gebruik keurde het protocol goed voordat primaire cellen werden gebruikt.

1. Vetzuuroxidatie in gekweekte osteoblasten

1. Subcultuur de primaire calvariale osteoblasten¹² of een osteoblastische cellijn zoals Mc3t3-E1, en plaat in T-25-kolven (5 x 10⁵ cellen/kolf) in α-MEM met 10% foetaal runderserum, 100 E/ml penicilline en 0,1 μg/ml streptomycine.
   1. Zaad 3-4 kolven voor elke behandelingsgroep (d.w.z. controle en genknock-out of vehiculum en farmacologische behandeling) voor gebruik in het experiment. Zaai extra 1-2 kolven voor elke behandelingsgroep om te normaliseren tot celaantal of eiwitconcentraties. Incubeer de kweekkolven in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO₂.
2. Kweek de cellen gedurende 2-3 dagen totdat de kolven samenvloeien. Induceer de confluente culturen om te differentiëren door 50 μg/ml ascorbinezuur en 10 mM β-glycerolfosfaat (zie materiaaltabel) aan de kweekmedia toe te voegen en ga door met kweken gedurende maximaal 14 extra dagen.
   OPMERKING: Serumuithongering (toevoeging van 0,5%-1% FBS) 's nachts is noodzakelijk als groeifactorbehandelingen zijn gepland. Het verlagen van het percentage FBS beperkt de hoeveelheid niet-radioactief gelabelde lipiden in de cultuur en maakt het maximale effect van exogene groeifactoren mogelijk. Als de effecten van hormonen moeten worden getest, wordt houtskoolgestript FBS gebruikt.
3. Bereid het filtreerpapier, de rubberen hulsstoppers van 15 mm x 30 mm en de polypropyleen middenputjes (zie Materiaaltabel) de dag voor het experiment voor.
   1. Vouw een strook filterpapier van 1 cm x 10 cm in de vorm van een ventilator en plaats deze in de emmer van de polypropyleen middenput. Druk de arm van het polypropyleen middengat door het midden van de rubberen hulsstopper en laat het polypropyleen middengat goed in de T-25-kolf zakken. Sluit vervolgens de kolf af met de sleeve-stop (figuur 1).
      OPMERKING: Het kan nodig zijn om de plaatsing van het polypropyleen midden goed aan te passen om ervoor te zorgen dat het niet in contact komt met het kweekmedium. Tijdens het experiment voorkomt het polypropyleen midden dat het filterpapier het etiketteermedium raakt en maakt het mogelijk om ¹⁴CO₂ op te vangen.
4. Vervoeg op de dag van het experiment [^1-14C]-oliezuur aan runderserumalbumine (BSA) door 20% runderserumalbumine te mengen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (5 μl per kolf) met 0,1 μCi/ml [^1-14C]-oliezuur (0,6 μl/kolf) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   1. Plaats de buis vervolgens in een conische buis van 50 ml en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C onder voorzichtig schudden. Bereid 1-2 extra kolven voor oliezuur-BSA-conjugaten voor om rekening te houden met pipetteerfouten.
5. Verwijder het kweekmedium uit de weefselkweekkolf en vervang het door 1,5 ml verse serum uithongeringsmedia (stap 1.2).
6. Combineer voor elke kolf 5,6 μl oliezuur-BSA-oplossing (stap 1.4) met 2 μl 100 mM carnitineoplossing en 1 ml kweekmedia om een etiketteringsoplossing te verkrijgen. Voeg de etiketteeroplossing toe aan de kweekkolven. Bewaar de overtollige oplossing om het totale aantal activiteiten te lezen dat aan de test is toegevoegd.
   OPMERKING: De etiketteringsoplossing wordt niet toegevoegd aan de extra kolven die bedoeld zijn om het aantal cellen of de eiwitconcentratie te kwantificeren.
7. Laat de polypropyleen middenputjes met het filtreerpapier in de kolf zakken en sluit deze vervolgens af met de rubberen stop.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het polypropyleen centrum niet in contact komt met het kweekmedium. Dit leidt tot kruisbesmetting van het filterpapier met radioactief gelabeld vetzuur in plaats van CO₂.
8. Incubeer de celculturen gedurende 3 uur bij 37 °C met 5% CO₂.
9. Om ¹⁴CO₂ op te vangen, injecteert u 150 μL 1 N NaOH in de polypropyleen middenput om het filterpapier nat te maken en 200 μL 1 M perchloorzuur in het kweekmedium. Injecteer het NaOH en perchloorzuur door een naald door de rubberen stop te duwen.
   OPMERKING: De rubberen stop mag niet uit de kolf worden verwijderd. Hierdoor kan ¹⁴CO₂ ontsnappen. Voor het gemak van de injectie dient u de kolf rechtop te houden en na afloop van de injecties terug te keren naar de kweekpositie.
10. Incubeer de kolven gedurende 1 uur bij 55 °C.
11. Open de kolven nadat u ze in de celkweekkap hebt afgekoeld. Verwijder het filterpapier met een pincet uit de middelste putjes van polypropyleen en plaats ze in 3-4 ml scintillatievloeistof (zie Materiaaltabel) in een scintillatieflesje.
    OPMERKING: 100 μL overtollige etiketteringsoplossing wordt toegevoegd aan 3-4 ml van de scintillatievloeistof om het totale aantal activiteiten te meten. 100 μL basale cultuurmedia (zonder [^1-14C]-oliezuur) wordt toegevoegd aan 3-4 ml scintillatievloeistof om de achtergrondactiviteit te meten.
12. Na 1 uur of een nacht bij kamertemperatuur te hebben geïncubeerd, meet u de radioactiviteit in tellingen per minuut (cpm) met behulp van een scintillatieteller (zie Materiaaltabel).
13. Om de ppm-resultaten te normaliseren, isoleert u de eiwitextracten uit de niet-geëtiketteerde T-25-kolven voor elke kweektoestand. Spoel met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing, voeg 1 ml RIPA cellysebuffer toe aan elke kolf en schraap het celoppervlak met een celschraper.
    1. Breng de RIPA-buffer met een pipet over in een microcentrifugebuisje en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 19.000 x g bij 4 °C. Breng het bovenstaande met een pipet over naar een verse microcentrifugebuis en bepaal de eiwitconcentratie volgens het BCA-testprotocol (zie materiaaltabel).
    2. Deel de ruwe cpm-lezingen van de scintillatieteller door de eiwitconcentratie om de genormaliseerde cpm van ¹⁴geproduceerde CO₂ te verkrijgen (tabel 1).
14. Volg de lokale vereisten om de scintillatieflesjes, celkweekmaterialen, medium, spuiten, enz. weg te gooien. Ontsmet de werkoppervlakken en voer tests uit met het wissen van radioactiviteit volgens de lokale vereisten.

2. Verzameling van zuuroplosbare metabolieten

OPMERKING: De incubatietijd van 3 uur die in stap 1.8 hierboven is gebruikt, is mogelijk niet voldoende tijd om al het volledig oliezuur [^1-14C] dat door cellen wordt opgenomen, te oxideren tot CO₂. De flux in de vetzuuroxidatieroute kan ook worden beoordeeld door de radioactiviteit in de in zuur oplosbare fractie te meten.

1. Verzamel 1 ml van de aangezuurde media van elke behandelde T-25-kolf en breng deze over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
2. Voeg 60 μL 20% BSA en 100 μL 16 M perchloorzuur toe.
3. Draaikolken en broeden een nacht bij 4 °C.
4. Vervolgens vortex en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
5. Voeg 200 μl van het bovenstaande toe aan de scintillatievloeistof en meet de activiteit (stap 1.12).
6. Normaliseer de metingen naar eiwitconcentratie of DNA-metingen (stap 1.13.1).

3. Meting van glucose-oxidatie of aminozuuroxidatie

1. Vervang ¹⁴C-gelabeld oliezuur door ¹⁴C-gelabelde glucose of ¹⁴C-gelabelde aminozuren om de oxidatie van deze brandstofmoleculen te meten.
2. Bereid osteoblastculturen voor volgens de stappen 1.1-1.2.
3. Om het experiment te starten, verwijdert u het kweekmedium uit de weefselkweekkolf en vervangt u het door 1,5 ml verse serumhongermedia.
4. Bereid een etiketteerbare oplossing van 0,6 μCi van ¹⁴C-gelabelde glucose of ¹⁴C-gelabelde aminozuren in 1 ml hongermedia en voeg toe aan kolven.
5. Voer de stappen 1.6-1.13 uit.

Resultaten

Enzymatische activiteit van zowel carnitine palmitoyltransferase-1 (Cpt1) als carnitine palmitoyltransferase-2 (Cpt2) is vereist voor mitochondriale vetzuuroxidatie met lange ketens. Cpt1 is het snelheidsbeperkende enzym in de metabole route, maar drie isovormen (Cpt-1a, Cpt-1b en Cpt-1c) zijn gecodeerd in het genoom van zoogdieren, en de genetische verstoring van de ene isovorm kan leiden tot compensatie-opregulatie van een andere isovorm¹³. Cpt2 daarentegen word...

Discussie

De hierboven beschreven procedure maakt een directe beoordeling van de vetzuuroxidatie mogelijk, aangezien de gemeten output ¹⁴CO₂ is die wordt verzameld op het met NaOH doordrenkte filterpapier en in zuur oplosbare metabolieten die worden verzameld na de verzuring van de cultuur met perchloorzuur. In de handel verkrijgbare testkits die fluorescerend gelabelde lipidemoleculen of lipide-analogen gebruiken, kunnen de opname van lipiden meten, maar ze bepalen geen kata...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
[1-14C]-Oleinezuur	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm rubberen hulsdoppen	VWR	89097-542
1 mL spuit	BD precision	309628
25 G naald (25 G x 1 1/2 in)	BD precision	305127
Ascorbinezuur	Sigma Aldrich	A4403
BCA-eiwitassaykit	Thermo Fisher	23225	Andere kits zijn ook geschikt
Beckman Scintillatieteller, of gelijkwaardig	Beckman Coulter	LS6000SC
Beta-glycerolfosfaat	Sigma Aldrich	G6626
Rundserumalbumine	Sigma Aldrich	126609
Carnitine	Sigma Aldrich	C0283
Cellulaire lysbufer			Het protocol is geschikt voor typische lysbufers (bijv. RIPA)
Dissectiepincet			Verkrijgbaar bij meerdere bronnen
DNA-kwantificeringskit			Verkrijgbaar bij meerdere bronnen
Dulbecco’s fosfaatbuffer oplossing met zout	Corning	20-030-CV
Foetaal runderserum			Verkrijgbaar bij meerdere bronnen
Microcentrifugebuisjes, 1,5 mL			Verkrijgbaar bij meerdere bronnen
Minimum essentieel medium, Alpha-modificatie	Corning	10-022-CV
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140122
Perchloorzuur	Sigma Aldrich	50439
Polypropyleen centrumputjes	VWR	72760-048
Natriumhydroxide	Sigma Aldrich	S5881
T-25 weefselkweekkolf met afgeschuinde hals	Corning	430639
Weefselkweekincubator
Trypsine (0,25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (scintillatieoplossing)	PerkinElmer	6013329
Whatman chromatografiepapier	Sigma Aldrich	WHA3030917