Het protocol beschrijft hier de meting van de ruimtelijke organisatie van de visuele assen van huisvliegogen, in kaart gebracht door een automatisch apparaat, met behulp van het pseudopupil-fenomeen en het pupilmechanisme van de fotoreceptorcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde in kaart brengen van de visuele ruimte van housefly compound eyes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit artikel beschrijft de automatische meting van de ruimtelijke organisatie van de visuele assen van insecten samengestelde ogen, die bestaan uit enkele duizenden visuele eenheden genaamd ommatidia. Elk ommatidium bemonstert de optische informatie vanuit een kleine vaste hoek, met een geschatte Gaussisch verdeelde gevoeligheid (halve breedte in de orde van 1°) gecentreerd rond een visuele as. Samen verzamelen de ommatidia de visuele informatie uit een bijna panoramisch gezichtsveld. De ruimtelijke verdeling van de visuele assen bepaalt dus de ruimtelijke resolutie van het oog. Kennis van de optische organisatie van een samengesteld oog en zijn gezichtsscherpte is cruciaal voor kwantitatieve studies van neurale verwerking van de visuele informatie. Hier presenteren we een geautomatiseerde procedure voor het in kaart brengen van de visuele assen van een samengesteld oog, met behulp van een intrinsiek, in vivo optisch fenomeen, de pseudopupil en het pupilmechanisme van de fotoreceptorcellen. We schetsen de optomechanische opstelling voor het scannen van insectenogen en gebruiken experimentele resultaten verkregen van een huisvlieg, Musca domestica, om de stappen in de meetprocedure te illustreren.
Inleiding
De compactheid van visuele systemen van insecten en de behendigheid van hun eigenaren, die een sterk ontwikkelde visuele informatieverwerking demonstreren, hebben mensen met zowel wetenschappelijke als niet-wetenschappelijke achtergronden geïntrigeerd. Insectenogen zijn erkend als krachtige optische apparaten die acute en veelzijdige visuele capaciteiten mogelijk maken 1,2. Vliegen staan bijvoorbeeld bekend om hun snelle reacties op bewegende objecten, en bijen staan bekend om het bezitten van kleurzicht en polarisatievisie2.
De samengestelde ogen van geleedpotigen bestaan uit talrijke anatomisch vergelijkbare eenheden, de ommatidia, die elk worden afgedekt door een facetlens. Bij Diptera (vliegen) benadert de assemblage van facetlenzen, gezamenlijk bekend als het hoornvlies, vaak een halfrond. Elk ommatidiummonster valt licht in vanuit een kleine vaste hoek met halve breedte in de orde van 1°. De ommatidia van de twee ogen samen bemonsteren ongeveer de volledige vaste hoek, maar de visuele assen van de ommatidia zijn niet gelijkmatig verdeeld. Bepaalde ooggebieden hebben een hoge dichtheid van visuele assen, waardoor een gebied met een hoge ruimtelijke scherpte ontstaat, in de volksmond een fovea genoemd. Het resterende deel van het oog heeft dan een grovere ruimtelijke resolutie 3,4,5,6,7,8,9.
Een kwantitatieve analyse van de optische organisatie van de samengestelde ogen is cruciaal voor gedetailleerde studies van de neurale verwerking van visuele informatie. Studies van de neurale netwerken van de hersenen van een insect10 vereisen vaak kennis van de ruimtelijke verdeling van de ommatidiale assen. Bovendien hebben samengestelde ogen verschillende technische innovaties geïnspireerd. Veel initiatieven om bio-geïnspireerde kunstogen te produceren zijn gebaseerd op bestaande kwantitatieve studies van echte samengestelde ogen 11,12,13. Een op halfgeleiders gebaseerde sensor met een hoge ruimtelijke resolutie is bijvoorbeeld ontworpen op basis van het model van insecten samengestelde ogen 11,14,15,16,17. De tot nu toe ontwikkelde apparaten hebben echter niet de werkelijke kenmerken van bestaande insectenogen geïmplementeerd. Nauwkeurige representaties van insecten samengestelde ogen en hun ruimtelijke organisatie vereisen gedetailleerde en betrouwbare gegevens van natuurlijke ogen, die niet uitgebreid beschikbaar zijn.
De belangrijkste reden voor het gebrek aan gegevens is de extreme saaiheid van de beschikbare procedures voor het in kaart brengen van de ruimtelijke kenmerken van de ogen. Dit heeft geleid tot pogingen om een meer geautomatiseerde eye mapping-procedure op te zetten. In een eerste poging tot geautomatiseerde analyses van insecten samengestelde ogen, ontwikkelden Douglass en Wehling18 een scanprocedure voor het in kaart brengen van facetmaten in het hoornvlies en toonden de haalbaarheid ervan aan voor een paar vliegensoorten. Hier breiden we hun aanpak uit door methoden te ontwikkelen om niet alleen de facetten van het hoornvlies te scannen, maar ook de visuele assen van de ommatidia waartoe de facetten behoren te beoordelen. We presenteren het geval van huisvliegenogen om de betrokken procedures te illustreren.
De experimentele opstelling voor het scannen van insectenogen is: gedeeltelijk optisch, d.w.z. een microscoop met camera en verlichtingsoptiek; gedeeltelijk mechanisch, d.w.z. een goniometersysteem voor het roteren van het onderzochte insect; en gedeeltelijk computationeel, d.w.z. gebruik van softwarestuurprogramma's voor de instrumenten en programma's voor het uitvoeren van metingen en analyses. De ontwikkelde methoden omvatten een reeks computationele procedures, van het vastleggen van beelden, het kiezen van camerakanalen en het instellen van beeldverwerkingsdrempels tot het herkennen van individuele facetlocaties via heldere lichtvlekken die worden gereflecteerd door hun bolle oppervlakken. Fouriertransformatiemethoden waren cruciaal in de beeldanalyse, zowel voor het detecteren van individuele facetten als voor het analyseren van de facetpatronen.
Het artikel is als volgt opgebouwd. We introduceren eerst de experimentele opstelling en het pseudopupil-fenomeen - de optische marker die wordt gebruikt om de visuele assen van de fotoreceptoren in levende ogen te identificeren 19,20,21. Vervolgens worden de algoritmen beschreven die worden gebruikt in de scanprocedure en beeldanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol is in overeenstemming met de richtlijnen voor insectenverzorging van de universiteit.
1. Bereiding van een huisvlieg, Musca domestica
- Verzamel de vlieg van de in het laboratorium gekweekte populatie. Plaats de vlieg in de messing houder (figuur 1).
- Snijd 6 mm uit het bovenste deel van de fixatiebuis (zie Materiaaltabel). Het nieuwe bovenste deel van de buis heeft een uitwendige diameter van 4 mm en een inwendige diameter van 2,5 mm (figuur 1A). Plaats de levende vlieg in de buis, sluit de buis af met katoen om beschadiging van de vlieg te voorkomen en duw de vlieg zodanig dat de kop uit de buis steekt en het lichaam wordt vastgehouden (figuur 1B). Immobiliseer de kop met bijenwas zodat de ogen onbedekt blijven (figuur 1C-E).
- Knip de buis opnieuw zodanig dat de buislengte 10 mm is (figuur 1C). Plaats de plastic buis met de vlieg in de messing houder, zodat één oog van de vlieg naar boven wijst wanneer de houder op een tafelblad rust (figuur 1D, E).
- Pas de oriëntatie van de buis zodanig aan dat met de goniometerhoogte op 0 ° (d.w.z. de azimuttrap bevindt zich in een horizontale positie), de verticale verlichtingsstraal van de microscoop loodrecht staat op het oogoppervlak in een centraal gebied, tussen ventraal en dorsaal, en tussen voorste en achterste randen van het oog, zodat het hele oog kan worden gescand binnen het bereik van azimut en hoogte toegestaan door de opstelling.
2. Uitlijning van de roterende azimutas van de goniometer met de optische as van de microscoop
- Monteer een uitlijningspen op de azimutrotatietrap, zodat de x-y-positie van de tip kan worden aangepast om samen te vallen met de azimutas op het gemotoriseerde podium. Terwijl u met de microscoop kijkt, uitgerust met een 5x-objectief, stelt u scherp op de punt met behulp van de z-as joystick (figuur 2).
- Lijn de x-y-aanpassing van de azimut-as uit met de optische as van de microscoop en zorg ervoor dat de hoogte- en azimut-roterende assen vooraf zijn uitgelijnd met de gecentreerde pin, met behulp van de x- en y-as joysticks.
- Manipuleer de azimut- en hoogtejoysticks om te controleren of de pin gecentreerd is met betrekking tot beide vrijheidsgraden. Wanneer goed gecentreerd, blijft de penpunt ongeveer in dezelfde positie tijdens azimut- en elevatierotaties.
3. Uitlijning van het vliegenoog met de gemotoriseerde stadia
- Met het hoogtestadium op 0° monteer je de vlieg en zijn houder op de azimuttrap. Observeer het oog van de vlieg met de microscoop.
- Met de verlichtings-LED aan, past u de horizontale positie van de vlieg aan, zodat het midden van de pseudopupil wordt uitgelijnd met de microscoop. Pas de verticale positie van de vlieg aan met behulp van de roterende schroef van de houder (figuur 1D), zodat de diepe pseudopupil (DPP; Figuur 3) 19,20,21 wordt ter hoogte van de hoogteas in beeld gebracht.
- Lijn de DPP uit ten opzichte van de azimut- en hoogteassen door deze in het gezichtsveld te centreren (zie figuur 2). Gebruik de magneten die aan de onderkant van de vliegenhouder zijn gelijmd om deze stevig vast te maken op een ijzeren plaat die op de azimuttrap is gemonteerd, terwijl handmatige glijaanpassingen mogelijk zijn.
- Schakel de weergave over naar de digitale camera die op de microscoop is gemonteerd. Voer de software-initialisatie van het GRACE-systeem uit, waaronder het initialiseren van de motorcontrollers en de Arduino LED-controller (figuur 4). Open daarom MATLAB R2020a of hogere versie. Voer het MATLAB-script uit Initialize_All_Systems (aanvullend bestand 1).
- Controleer of de pseudopupil van de vlieg (figuur 3B,C) zich in het midden van het geprojecteerde beeld op het computerscherm bevindt.
4. Autofocus en autocentering
- Breng de focus naar het niveau van de cornea pseudopupil (CPP; Figuur 3B) 19,20,21 handmatig met behulp van de z-as joystick.
- Voer het autofocusalgoritme (Aanvullend bestand 1, script AF) uit om een scherp beeld op hoornvliesniveau te verkrijgen. Controleer dit door de focus terug te brengen naar het DPP-niveau door de gemotoriseerde z-astrap aan te passen. Bewaar de afstand tussen de DPP en CPP (in motorstappen).
- Verfijn de pseudopupil centering door het autocentering algoritme (Supplementary File 1, script AC) uit te voeren. Breng de focus terug naar het CPP-niveau.
- Voer het autofocusalgoritme opnieuw uit. Nul de gemotoriseerde stadia op hun huidige posities (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), waarbij E hoogte is en A azimut.
- Voer het scanalgoritme (aanvullend bestand 1, script Scan_Begin) uit, dat oogbeelden langs trajecten in stappen van 5° samplet, terwijl de algoritmen voor autocentering en autofocus worden uitgevoerd.
- Schakel aan het einde van de bemonstering de LED-controller en de motorcontrollers uit.
- Verwerk de afbeeldingen door de beeldverwerkingsalgoritmen toe te passen (aanvullend bestand 1, script ImProcFacets).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dieren en optische stimulatie
Experimenten worden uitgevoerd op huisvliegen (Musca domestica) verkregen uit een cultuur die wordt onderhouden door de afdeling Evolutionaire Genetica van de Rijksuniversiteit Groningen. Vóór de metingen wordt een vlieg geïmmobiliseerd door hem met een laagsmeltpuntwas in een goed passende buis te lijmen. De vlieg wordt vervolgens gemonteerd op het podium van een gemotoriseerde goniometer. Het midden van de twee roterende trappen valt samen met het brandpunt van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ruimtelijke verdeling van de visuele assen van huisvliegogen kan in kaart worden gebracht met behulp van het pseudopupil-fenomeen van samengestelde ogen en de reflectieveranderingen veroorzaakt door het lichtafhankelijke pupilmechanisme. Daarom wordt een onderzochte vlieg gemonteerd in een goniometrisch systeem, dat inspectie van het lokale facetpatroon mogelijk maakt met een microscoopopstelling uitgerust met een digitale camera, allemaal onder computerbesturing. Beeldanalyse levert oogkaarten op. Een essentieel prob...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd financieel ondersteund door het Air Force Office of Scientific Research/European Office of Aerospace Research and Development AFOSR/EOARD (subsidie FA9550-15-1-0068, aan D.G.S.). We danken Dr. Primož Pirih voor vele nuttige discussies en Kehan Satu, Hein Leertouwer en Oscar Rincón Cardeño voor hulp.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision van versterkte beelden en digitale communicatie met PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Lichtbron voor observatie en beeldvorming van het samengestelde oog |
| Holder voor de onderzochte vlieg | University of Groningen | Verschillende ontwerpen werden vervaardigd door de universiteitswerkplaats | |
| Lineaire motor | ELERO | ELERO Junior 1, versie C | Activeert de bovenste microscoop op en neer. (Belasting 300N, Slagsnelheid 15mm/s, nominaal stroom 1.2A) |
| Laagsmeltend was | diversen | De laagsmeltende was dient om de vlieg te immobiliseren en aan de houder te bevestigen | |
| Microscoop | Zeiss | Elke alternatieve microscoopmerk zal het doen; het voorkeursobjectief is een 5x | |
| Motor- en LED-controller | University of Groningen | Z-o1 | Ontworpen en gebouwd door de University of Groningen en gebaseerd op Arduino en Adafruit technologieën. |
| Gemotoriseerde stage | Standa (Vilnius, Litouwen) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | Een 6-assige gemotoriseerde stage gemodificeerd om 5 vrijheidsgraden te hebben. |
| Optische componenten | LINUS | Verschillende diagrammen en lenzen die een epi-verlichtingssysteem vormen (zie Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC met MATLAB | University of Groningen | De PC is in staat om de beelden van de PointGrey camera te verwerken, de LED-intensiteit te regelen en besturingscommando's naar de motorcontrollers van het systeem te sturen | |
| Voeding (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Litouwen) | PUP120-17 | Specifieke voeding voor de STANDA motorcontrollers |
| Loodbout | diversen | Gebruikt voor het smelten van de was | |
| Stepper- en DC-motorcontroller | Standa (Vilnius, Litouwen) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Specifieke controllers voor de STANDA gemotoriseerde stage, in staat om te communiceren met MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTIPUNTEN VOOR FINNPIPETTES, 400/DOOS. Het wordt gebruikt om de vlieg te beperken |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | De punt van de snijpen is ontworpen om was naar het hoofd van de vlieg over te brengen | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | hoofdprogramma plus Image Acquisition, Image Analysis en Instrument Control toolboxes. | Programmeertaal die wordt gebruikt om de algoritmen te implementeren |
Referenties
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M. Topography of vision and behaviour. The Journal of Experimental Biology. 212, Pt 21 3522-3532 (2009).
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002(2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168(2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782(2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613(2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
