Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
* These authors contributed equally
Dit protocol presenteert een stapsgewijze methodologische benadering van het blootstellen van botmetastascellijnen en primaire bottumoren aan 5-aminolevulinezuur-gemedieerde fotodynamische therapie (PDT). De effecten op celmigratiepotentieel/invasiviteit, levensvatbaarheid, apoptose en senescentiepotentieel worden ook geanalyseerd na blootstelling aan PDT.
Botmetastasen worden in verband gebracht met een slechte prognose en een lage kwaliteit van leven voor de getroffen patiënten. Fotodynamische therapie (PDT) komt naar voren als een niet-invasieve therapie die zich kan richten op lokale gemetastaseerde botlaesies. Dit artikel presenteert een in vitro methode om het PDT-effect in aanhangende cellijnen te bestuderen. Daartoe demonstreren we een stapsgewijze aanpak om zowel primaire (reuscelbottumor) als menselijke botmetastatische kankercellijnen (afgeleid van een primair invasief ductaal borstcarcinoom en niercarcinoom) te onderwerpen aan 5-aminolevulinezuur (5-ALA)-gemedieerde PDT.
Na 24 uur na 5-ALA-PDT-bestraling (blauw licht-golflengte 436 nm) werd het therapeutisch effect beoordeeld in termen van celmigratiepotentieel, levensvatbaarheid, apoptotische kenmerken en cellulaire groeistilstand (senescentie). Na 5-ALA-PDT-bestraling reageren van het bewegingsapparaat afgeleide cellijnen anders op dezelfde doses en blootstelling aan PDT. Afhankelijk van de mate van cellulaire schade veroorzaakt door blootstelling aan PDT, werden twee verschillende cellotsbestemmingen opgemerkt: apoptose en senescentie. Variabele gevoeligheid voor PDT-therapie tussen verschillende botkankercellijnen biedt nuttige informatie voor het selecteren van meer geschikte PDT-instellingen in klinische omgevingen. Dit protocol is ontworpen om het gebruik van PDT in de context van musculoskeletale neoplastische cellijnen te illustreren. Het kan worden aangepast om het therapeutische effect van PDT op verschillende kankercellijnen en verschillende fotosensibilisatoren en lichtbronnen te onderzoeken.
Therapeutische opties voor botmetastasen zijn nog steeds beperkt en uitdagend, ondanks voortdurende ontwikkelingen in de oncologische behandeling. De huidige standaardmethode is radiotherapie, die gepaard gaat met complicaties zoals lokaal erytheem, toxiciteit voor inwendige organen1 en onvoldoende fracturen2. Er is behoefte aan alternatieve antineoplastische therapieën, aangezien patiënten met botmetastasen vaak last hebben van pijn, hypercalciëmie en neurologische symptomen die resulteren in verminderde mobiliteit en verminderde kwaliteit van leven3. Recente bev....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Er werden drie verschillende soorten cellijnen gebruikt: "MAM" - een cellijn afkomstig van botmetastasen van niercelcarcinoom, "MAC" - botmetastasen van een invasief ductaal borstcarcinoom en "17-1012" - een reusachtige-celtumor van het bot. Merg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) werden gebruikt als controlegroep. Institutionele en ethische goedkeuring werd verkregen voor de start van de studie (projectnummer: 008/2014BO2 - voor de kankercellijnen en projectnummer: 401/2013 BO2 voor MSC's).
1. Celcultuur
LET OP: Cultuurmedia kunnen vooraf worden voorbereid.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Na blootstelling aan 5-ALA PDT vertoonde de MSC-controlegroep geen significant effect in termen van migratie na bestraling met 5-ALA PDT (Figuur 2A, i, v, ix). Daarentegen vertoonden MAC-cellen (Figuur 1B en Figuur 2A, iii, vii, xi) en 17-1012 (Figuur 1B en Figuur 2A, ii, vi, x) cellen een .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Ondanks de huidige behandelingsopties is de therapeutische respons bij kanker variabel en pleit voor nieuwe benaderingen of zelfs combinatietherapieën om botmetastasen te behandelen met behoud van de initiële weefselstructuur. In deze context is PDT een veelbelovend alternatief. Vanuit een simplistisch oogpunt bestaat PDT uit twee basiscomponenten: (1) een niet-toxische lichtgevoelige kleurstof die fotosensibilisator (PS) wordt genoemd en (2) een externe lichtbron met de juiste golflengt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
We danken onze co-auteurs van de oorspronkelijke publicaties voor hun hulp en steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 300 s metered card for PDT | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | http://www.illuminoss.com |
| 5-aminolevulinic acid (5-ALA) photosensitizer | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7793 | 10 mg |
| 6 Well plates | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| 8 Well Chamber Slides | SARSTEDT AG & Co. KG, Munich, Germany | 94.6140.802 | |
| 96 Well plates (F-buttom) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
| CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS-Assay) | Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA | G3580 | |
| Cellular Senescence Assay | Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Germany | CBA-231 | Kwantitatieve senescentie-geassocieerde ß-galactosidase assay |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 35055 | 0.5% (w/v) |
| Culture-Inserts 2Well | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 80209 | |
| DMEM (1x) + GlutaMax-I | Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA | 31966-021 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | F7524 | |
| Fluorescence microplate reader | Promega, Madison, Wisconsin, USA | GlowMAx®, GM3510 | |
| Hemocytometer | Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland | 4042 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA | ImageJ (versie: 1.53a) | Software voor het verwerken en analyseren van wetenschappelijke beelden; https://imagej.net/ |
| Inverse phase-contrast microscope | Leica, Wetzlar, Germany | DM IMBRE 100 | |
| Methanol AnulaR Normapur | VWR, Fontenay-Sous-Bois, France | 20847.307 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 158127 | Poeder, 95% zuiverheid |
| PDT device (light box and accesories) | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | Blauw licht 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15140-122 | 10.000 U/mL Penicillin 10.000 μg/mL Streptomycin |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10010-015 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21875034 | |
| Spectrophotomete/ microplate reader | BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germany | EL800 | |
| Trypan Blue dye 0.4% | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 10x | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | T4174 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar