Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63646

⸱

1 juni 2022

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Deze methode maakt gebruik van de bijdrage van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie aan protonlek met lage geleiding om de spanningsdrempel voor porieopening te bepalen bij neonatale fragiele X-syndroommuizen met een verhoogd cardiomyocyt mitochondriaal co-enzym Q-gehalte in vergelijking met wildtypecontrole.

Samenvatting

De mitochondriale permeabiliteitstransitieporie (mPTP) is een voltage-gated, niet-selectief, inner mitochondriaal membraan (IMM) megakanaal dat belangrijk is in gezondheid en ziekte. De mPTP bemiddelt lekkage van protonen over de IMM tijdens opening met lage geleiding en wordt specifiek geremd door ciclosporine A (CsA). Co-enzym Q (CoQ) is een regulator van de mPTP en weefselspecifieke verschillen zijn gevonden in CoQ-gehalte en open waarschijnlijkheid van de mPTP in voorhersenen en hart mitochondriën in een pasgeboren muismodel van fragiel X-syndroom (FXS, Fmr1 knockout). We ontwikkelden een techniek om de spanningsdrempel voor mPTP-opening in deze mutante stam te bepalen, waarbij we gebruik maakten van de rol van de mPTP als protonlekkanaal.

Om dit te doen, werden zuurstofverbruik en membraanpotentiaal (ΔΨ) tegelijkertijd gemeten in geïsoleerde mitochondriën met behulp van polarografie en een tetrafenylfosfonium (TPP +) ionselectieve elektrode tijdens lekademhaling. De drempel voor mPTP-opening werd bepaald door het begin van CsA-gemedieerde remming van protonlekkage bij specifieke membraanpotentialen. Met behulp van deze benadering werden verschillen in spanningsgating van de mPTP nauwkeurig gedefinieerd in de context van CoQ-overmaat. Deze nieuwe techniek zal toekomstig onderzoek mogelijk maken voor het verbeteren van het begrip van fysiologische en pathologische regulatie van het openen van de mPTP met lage geleiding.

Inleiding

De mPTP bemiddelt de permeabiliteitsovergang (PT), waarbij de IMM abrupt doorlaatbaar wordt voor kleine moleculen en lost 1,2 op. Dit opvallende fenomeen wijkt af van de karakteristieke ondoordringbaarheid van de IMM, die fundamenteel is voor het vaststellen van de elektrochemische gradiënt die nodig is voor oxidatieve fosforylering3. PT is, in tegenstelling tot andere mitochondriale transportmechanismen, een hooggeleidend, niet-specifiek en niet-selectief proces, waardoor de passage van een reeks moleculen tot 1,5 kDa 4,5 mogelijk is. De mPTP is een spanningsafhankelijk kanaal binnen de IMM waarvan de opening ΔΨ, ATP-productie, calciumhomeostase, reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie en cel levensvatbaarheid verandert4.

Aan het pathologische uiterste leidt ongecontroleerde en langdurige hooggeleidingsopening van mPTP tot de ineenstorting van de elektrochemische gradiënt, matrixzwelling, uitputting van matrixpyridinenucleotiden, buitenmembraanruptuur, afgifte van intermembraaneiwitten (inclusief cytochroom c) en uiteindelijk celdood 4,6. Een dergelijke pathologische mPTP-opening is betrokken bij cardiale ischemie-reperfusieletsel, hartfalen, traumatisch hersenletsel, verschillende neurodegeneratieve ziekten en diabetes 1,7. MPTP-opening met lage geleiding is echter fysiologisch van aard en leidt, in tegenstelling tot opening met hoge geleiding, niet tot diepgaande depolarisatie of mitochondriale zwelling4.

Lage geleidingsopening van de porie beperkt de permeabiliteit tot ~ 300 Da, maakt de passage van protonen onafhankelijk van ATP-synthese mogelijk en is een potentiële bron van fysiologisch protonlek5. Fysiologische mPTP-opening veroorzaakt een gecontroleerde afname van ΔΨ, verhoogt de elektronenflux door de ademhalingstransportketen en resulteert in een korte uitbarsting of flits van superoxide, wat bijdraagt aan ROS-signalering8. Regulatie van dergelijke voorbijgaande mPTP-opening is belangrijk voor calciumhomeostase en normale cellulaire ontwikkeling en rijping 4,9,10,11. Tijdelijke porieopening in zich ontwikkelende neuronen veroorzaakt bijvoorbeeld differentiatie, terwijl de sluiting van de mPTP rijping induceert in onrijpe cardiomyocyten 4,5.

Hoewel de functionele betekenis van de mPTP in gezondheid en ziekte goed is vastgesteld, blijft de precieze moleculaire identiteit ervan ter discussie staan. Vooruitgang met betrekking tot de moleculaire structuur en functie van het mPTP is elders uitgebreid besproken12. Kortom, momenteel worden hoog- en laaggeleidingstoestanden van de mPTP verondersteld te worden bemiddeld door verschillende entiteiten12. De belangrijkste kandidaten zijn de F1/F0 ATP-synthase (ATP-synthase) en adeninenucleotidetransporter (ANT) voor respectievelijk hoge en lage geleidingsmodi12.

Ondanks het gebrek aan consensus over de exacte identiteit van de porievormende component van de mPTP, zijn bepaalde belangrijke kenmerken gedetailleerd beschreven. Een goed ingeburgerd kenmerk van de mPTP is dat deze wordt gereguleerd door de elektrochemische gradiënt zodanig dat depolarisatie van de IMM leidt tot porieopening13. Eerder werk heeft aangetoond dat de redoxtoestand van vicinale thiolgroepen de spanningsgating van de mPTP verandert, zodanig dat oxidatie de porie opent bij relatief hogere ΔΨs, en thiolgroepreductie resulteert in gesloten mPTP-waarschijnlijkheid14. De identiteit van de eiwitspanningssensor is echter onbekend.

Verschillende kleine moleculen die de open waarschijnlijkheid van de porie moduleren, zijn geïdentificeerd. De mPTP kan bijvoorbeeld worden gestimuleerd om te openen met calcium, anorganisch fosfaat, vetzuren en ROS en kan worden geremd door adeninenucleotiden (met name ADP), magnesium, protonen en CsA 5,12. De werkingsmechanismen van sommige van deze regelgevers zijn opgehelderd. Mitochondriaal calcium veroorzaakt mPTP-opening ten minste gedeeltelijk door binding aan de β-subeenheid van het ATP-synthase15. ROS kan de mPTP activeren door de affiniteit voor ADP te verminderen en de affiniteit voor cyclofiline D (CypD), de best bestudeerde eiwitachtige mPTP-activator16, te verbeteren. Het mechanisme van activering van de mPTP door anorganisch fosfaat en vetzuren is minder duidelijk. Wat endogene remmers betreft, wordt gedacht dat ADP de mPTP remt door zich te binden aan de ANT- of ATP-synthase, terwijl magnesium zijn remmende effect uitoefent door calcium van zijn bindingsplaats te verdringen 15,17,18,19.

Lage pH remt mPTP-opening door histidine 112 van de regulerende oligomycinegevoeligheidsverlenende eiwit (OSCP) subeenheid van de ATP-synthase12,20,21 te protoneren. De prototypische farmacologische remmer van de mPTP, CsA, werkt door CypD te binden en de associatie met OSCP 22,23 te voorkomen. Eerder werk heeft ook aangetoond dat een verscheidenheid aan CoQ-analogen interageert met de mPTP, deze remt of activeert24. In recent werk vonden we bewijs van een pathologisch open mPTP, overmatig protonlek en inefficiënte oxidatieve fosforylering als gevolg van een CoQ-tekort aan voorhersenen mitochondriën van pasgeboren FXS-muizenpups25.

Sluiting van de porie met exogene CoQ blokkeerde het pathologische protonlek en veroorzaakte morfologische volwassenheid van dendritische stekels25. Interessant is dat FXS-cardiomyocyten bij dezelfde dieren overmatige CoQ-niveaus en gesloten mPTP-waarschijnlijkheid hadden in vergelijking met wildtypecontroles26. Hoewel de oorzaak van deze weefselspecifieke verschillen in CoQ-niveaus onbekend is, onderstrepen de bevindingen het concept dat endogene CoQ waarschijnlijk een belangrijke regulator van de mPTP is. Er is echter een grote lacune in onze kennis omdat het mechanisme van CoQ-gemedieerde remming van de mPTP onbekend blijft.

Regulatie van de mPTP is een kritische determinant van celsignalering en overleving4. Het detecteren van mPTP-opening in mitochondriën is dus de sleutel bij het overwegen van specifieke pathofysiologische mechanismen. Meestal wordt de drempel voor het openen van porieporiën met hoge geleiding bepaald met behulp van calcium om de permeabiliteitsovergang te activeren. Een dergelijke calciumbelasting leidt tot de ineenstorting van het membraanpotentiaal, snelle ontkoppeling van oxidatieve fosforylering en mitochondriale zwelling 27,28. We probeerden een methode te ontwikkelen om mPTP-openingen met lage geleiding in situ te detecteren, zonder dit per se te induceren.

De aanpak maakt gebruik van de rol van de mPTP als protonlekkanaal. Om dit te doen, werden Clark-Type en TPP + ionselectieve elektroden gebruikt om tegelijkertijd respectievelijk zuurstofverbruik en membraanpotentiaal te meten in geïsoleerde mitochondriën tijdens lekademhaling29. De drempel voor mPTP-opening werd bepaald door het begin van CsA-gemedieerde remming van protonlekkage bij specifieke membraanpotentialen. Met behulp van deze benadering werden verschillen in spanningsgating van de mPTP in de context van CoQ-overmaat nauwkeurig gedefinieerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Institutional Animal Care and Use Committee van Columbia University Medical Center goedkeuring werd verkregen voor alle beschreven methoden. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) en control (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) muizen die als modelsystemen voor deze studie werden gebruikt, werden commercieel aangeschaft (zie de Tabel met Materialen). In elke experimentele groep werden vijf tot elf dieren gebruikt. Postnatale dag 10 (P10) muizen werden gebruikt om te modelleren voor een tijdspunt in de menselijke kindertijd.

1. Mitochondriale isolatie van muizenhart

  1. Bereid buffers voor voor mitochondriale isolatie en ademhalingsexperimenten zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4 °C indien van tevoren gemaakt.
    1. Bereid 15% dichtheidsgradiëntmedium voor: verdun commercieel dichtheidsgradiëntmedium tot 80% volume/volume (v/v) met dichtheidsgradiëntverdunningsmiddel. Verdun verder 80% dichtheidsgradiënt medium 15% v/v door toevoeging van mitochondriale isolatiebuffer (MI)/runderserumalbumine (BSA).
  2. Isoleer mitochondriën uit vers, niet bevroren weefsel voor deze experimenten en gebruik op de dag van voorbereiding, meestal binnen vijf uur26. Voer alle isolatiestappen uit op ijs.
    1. Onthoofd de muis en snijd het hart weg. Onmiddellijk 1-2 keer wassen in een petrischaaltje met ijskoude MI/BSA. Snijd het atrium af en hak het weefsel fijn.
    2. Breng het gehakte hartweefsel over in een glas-glas homogenisator met 1 ml MI/BSA. Homogeniseer met een lossere (A) stamper (10 slagen), dan een strakkere (B) stamper (10 slagen).
    3. Centrifugeer het homogenaat bij 1.100 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C om nucleair en cellulair vuil te verwijderen.
    4. Neem het supernatant voorzichtig zonder een donzige pellet aan te raken en leg het voorzichtig op 700 μL van 15% dichtheidsgradiëntmedium in een centrifugebuis. Centrifugeer bij 18.500 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    5. Resuspend de pellet in 1 ml sucrosebuffer (SB)/BSA en gecentrifugeerd bij 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    6. Verwijder het supernatant volledig en gooi het weg. Resuspend de pellet in SB/BSA tot een eindvolume van 55 μL.
    7. Kwantificeer mitochondriaal eiwitgehalte met behulp van een standaardtest zoals de bicinchoninezuur (BCA) eiwittest.

2. Mitochondriaal zuurstofverbruik (O2) en ΔΨ

  1. Assemblage en kalibratie van zuurstofelektrode
    1. Stel de zuurstofelektrode in en kalibreer deze (zie de tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Plaats een druppel 50% kaliumchloride (KCl) elektrolytoplossing bovenop de koepel van de elektrodeschijf.
      2. Plaats een klein stukje ~2 cm2 sigarettenpapier afstandhouder bedekt met een iets groter stuk van het meegeleverde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan over de elektrolyt druppel.
      3. Duw met behulp van het meegeleverde applicatorgereedschap de kleine elektrodeschijf O-ring over de koepel van de elektrode.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn en dat het membraan glad is.
    2. Vul het reservoir goed aan met de elektrolytoplossing.
    3. Plaats de grotere O-ring in de uitsparing rond de elektrodeschijf goed.
    4. Installeer de schijf in de elektrodekamer en sluit deze aan op de besturingseenheid.
    5. Voeg 2 ml met lucht verzadigd gedeïoniseerd water toe aan de reactiekamer en de ptfe-gecoate magneet aan de kamer.
    6. Sluit de kamer aan op de achterkant van de besturingseenheid.
    7. Stel de temperatuur in op 37 °C en de roersnelheid op 100.
    8. Wacht 10 minuten voordat de systeemtemperatuur in evenwicht is voordat u met de kalibratie begint.
    9. Selecteer op het tabblad Kalibratie de optie Vloeistoffasekalibratie om vloeistoffasekalibratie uit te voeren. Controleer of de temperatuur is ingesteld op 37 °C, de roersnelheid 100 is en de druk is ingesteld op atmosferische druk (101,32 kPa).
    10. Druk op OK en wacht tot het signaal is afgevlakt.
    11. Wanneer een plateau is bereikt, drukt u op OK.
    12. Stel nul O2 in de kamer vast door een kleine hoeveelheid (~ 20 mg) natriumdyniet toe te voegen.
    13. Druk op OK en wacht tot het signaal is afgevlakt.
    14. Wanneer een plateau is bereikt, drukt u op Opslaan om de kalibratie te accepteren.
  2. TPP+-selectieve elektrodeassemblage
    1. Vul de TPP+- selectieve elektrodepunt met 10 mM TPP-oplossing met behulp van de meegeleverde spuit en flexibele naald, waarbij u ervoor zorgt dat luchtbellen worden vermeden.
    2. Monteer het TPP+-selectieve elektrodeapparaat, inclusief de referentie-elektrode en elektrodehouder (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Maak kort de dop van de elektrodehouder los en plaats de interne referentie-elektrode in de TPP+-tip. Draai de dop vast om de punt vast te zetten. Sluit de meegeleverde kabel aan op de elektrodehouder en de hulppoort van de schakelkast.
    4. Plaats de TPP+-selectieve elektrode en referentie-elektroden in de aangepaste plunjerassemblage voor ionselectieve elektroden. Sluit de referentieelektrode aan op de referentiepoort van de besturingskast.
    5. Plaats de TPP+-selectieve en referentie-elektroden in de aangepaste plunjerassemblage voor ionselectieve elektroden.
  3. Voorbereiding reactiekamer
    1. Voeg het reactiemengsel toe aan de reactiekamer: 10 mM succinaat (complex II substraat), 5 μM rotenon (complex I-remmer ), 80 ng ml−1 nigericine (om de pH-gradiënt over IMM te laten samenvouwen), 2,5 μg ml-1 oligomycine (om toestand 4-ademhaling te induceren) en ademhalingsbuffer (RB) / BSA-reactiebuffer tot een eindvolume van 1 ml. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen in de kamer brengt.
    2. Sluit de kamer met de aangepaste plunjer met de TPP+-selectieve en de referentie-elektrode op zijn plaats. Selecteer GO om de opname te starten. Zodra de kamer is gesloten, brengt u extra reagentia rechtstreeks in de reactieoplossing met behulp van afzonderlijke microsyringes die zijn gemodificeerd met plastic slangen om de naaldlengte aan te passen.
  4. TPP+ kalibratie
    1. Zodra een stabiel spanningssignaal is verkregen, kalibreert u de TPP+-selectieve elektrode door stappen van 1 μM van een TPP-oplossing van 0,1 mM toe te voegen aan een eindconcentratie van 3 μM. Merk op dat er een logaritmische afname is in het TPP + spanningssignaal bij elke optelling.
      OPMERKING: Kalibreer de TPP+-selectieve elektrode aan het begin van elk experiment.
  5. Data-acquisitie
    1. Laat de O2 - en TPP+ -sporen stabiliseren en voeg 100 μg vers bereide cardiomyocytenmitochondriën toe aan de reactiekamer tot een eindconcentratie van 0,1 mg ml-1 via de reagenstoevoegingspoort in de plunjerassemblage. Observeer de afname van de O2-niveaus in de kamer naarmate mitochondriën energie krijgen en O2 verbruiken en de abrupte toename van het TPP + -spanningssignaal als de mitochondriën een membraanpotentiaal genereren en TPP + van de oplossing opnemen.
    2. Voeg 2,5 μg ml-1 oligomycine toe om de ademhaling van toestand 4 te induceren.
      OPMERKING: O 2-verbruikssnelheden vertegenwoordigen nu de snelheid van protonlekademhaling. Oligomycine kan voorafgaand aan TPP+ als alternatief aan de reactiekamer worden toegevoegd.
  6. Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mPTP
    1. Merk op dat ΔΨ na verloop van tijd afneemt tijdens lekademhaling. Zodra de gewenste ΔΨ is bereikt, voegt u 1 μM CsA (mPTP-remmer) toe aan de reactiekamer om de open waarschijnlijkheid van de mPTP bij die specifieke ΔΨ te beoordelen.
    2. Meet het effect van CsA op O2-verbruik en ΔΨ voor en na CsA-toevoeging
    3. Bepaal de spanningsafhankelijkheid van mPTP-opening door de ΔΨ te variëren waarbij CsA in opeenvolgende experimenten wordt toegevoegd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Typische O2-verbruiks- en ΔΨ-curven die in deze experimenten worden gegenereerd, worden weergegeven (figuur 1A,B). De logaritmische afname van het spanningssignaal met TPP+-kalibratie wordt aan het begin van elk experiment weergegeven. De afwezigheid van dit logaritmische patroon kan wijzen op een probleem met de TPP+ selectieve elektrode. Mitochondriën genereren meestal ΔΨ onmiddellijk na toevoeging aan de ademhalingsbuffer. ΔΨ kan worden ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft een methode om de open waarschijnlijkheid van de mPTP te beoordelen. In het bijzonder werd de spanningsdrempel voor mPTP-opening met lage geleiding bepaald door het effect van CsA-remming op protonlekken over een bereik van ΔΨs te beoordelen. Met behulp van deze techniek konden we verschillen in spanningsgating van de mPTP tussen FXS-muizen en FVB-controles identificeren in overeenstemming met hun verschillen in weefselspecifieke CoQ-inhoud. Cruciaal voor het succes van deze methodologie is dat mit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de volgende beurzen: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award aan de afdeling Anesthesiologie (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.), en NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Fisher Scientific15630080
Aangepaste plunjersamenstelling voor pH- of ion-selectieve elektroden voor gebruik met OXYT1PP systems941039
BD Intramedic PE-slang, PE 50, 0,023 inch. 10 ft.Fisher Scientific14-170-11Bom de lengte van de Hamilton-spuit naar behoefte aan te passen
Bovine Serum Albumine (BSA). VetzuurvrijSigmaA7030-10G
Dri-Ref Referentie-elektrode, 2 mmWorld Precision Inst. LLCDRIREF-2
Elektrodenhouder voor KWIK-TipsWorld Precision Inst. LLCKWIK-2 ion-selectieve elektrodehouder
Ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur  (EGTA)Sigma324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/JJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFXS-muizen, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJJackson Laboratory, Bar Harbor, MEFVB-muizen
Hamilton 80366 Standaardspuit, 10 uL, Verbonden-Naald, 6/pkCole-ParmerEW-07938-30microspuiten
Hamilton 80500 Standaard Microliterspuit, 50 uL, Verbonden-NaaldCole-ParmerEW-07938-02microspuiten
Hansatech Instruments Oxytherm+ Systeem (Ademhaling) CompleetPP systemsOXYTHERM+Rzuurstofreeksel en software
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma1374248
MannitolSigmaM9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentafosfaat pentanatrium (AP5A)SigmaD4022-10MG
PercollSigmaP1644medium voor dichtheidsgradiëntscheiding
Kaliumchloride (KCl)SigmaP3911
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)Sigma5.43841
SucroseSigmaS0389
TPP+ Elektrode Tips (3)World Precision Inst. LLCTIPTPP

Referenties

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76(2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357(2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

MembraanpotentiaalCyclosporine AZuurstofconsumptieTPP-elektrodeCardiale MitochondriënLekrespiratieCalciumingang
Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.