Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63647

⸱

30 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Second Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, 3Hunan Fangsheng Pharmaceutical Co., Ltd.

In dit artikel

Samenvatting

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Samenvatting

Het belangrijkste doel van celtherapie na myocardinfarct (MI) is om de celgetransplanteerde snelheid effectief te verbeteren, en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn een veelbelovende celbron voor hartherstel na ischemische schade. Een lage getransplanteerde snelheid is echter een belangrijk obstakel voor effectieve hartweefselregeneratie na transplantatie. Dit protocol toont aan dat meerdere hiPSC-CM echogeleide percutane injecties in een MI-gebied de celtransplantatiesnelheden effectief verhogen. De studie beschrijft ook het volledige hiPSC-CM-cultuurproces, voorbehandeling en echogeleide percutane toedieningsmethoden. Bovendien helpt het gebruik van menselijk mitochondriaal DNA de afwezigheid van hiPSC-CMs in andere muisorganen te detecteren. Ten slotte beschrijft dit artikel de veranderingen in hartfunctie, angiogenese, celgrootte en apoptose in de infarctgrenszone bij muizen 4 weken na celafgifte. Er kan worden geconcludeerd dat echocardiografie-geleide percutane injectie van het linkerventrikelmyocardium een haalbare, relatief invasieve, bevredigende, herhaalbare en effectieve cellulaire therapie is.

Inleiding

Wanneer acute MI optreedt, sterven myocardiale cellen in het infarctgebied snel als gevolg van ischemie en hypoxie. Verschillende ontstekingsfactoren komen vrij na celdood en breuk, terwijl ontstekingscellen de infarctplaats infiltreren om ontsteking1 te veroorzaken. Significant is dat fibroblasten en collageen, beide zonder contractiliteit en elektrische geleidbaarheid, de myocardiale cellen op de infarctplaats vervangen om littekenweefsel te vormen. Vanwege de beperkte regeneratiecapaciteit van cardiomyocyten bij volwassen zoogdieren is levensvatbaar weefsel gevormd na een groot infarctgebied meestal niet voldoende voor het handhaven van voldoende cardiale output2. MI veroorzaakt hartfalen en in ernstige gevallen van hartfalen kunnen patiënten alleen vertrouwen op harttransplantaties of ventriculaire hulpmiddelen om normale hartfuncties te behouden 3,4.

Na MI is de ideale behandelingsstrategie om de dode cardiomyocyten te vervangen door nieuw gevormde cardiomyocyten, waarbij elektromechanische koppeling met gezonde weefsels wordt gevormd. Behandelingsopties hebben echter meestal myocardiale berging aangenomen in plaats van vervanging. Momenteel behoren op stamcellen en voorlopercellen gebaseerde therapieën tot de meest veelbelovende strategieën om myocardherstel na MI5 te bevorderen. De transplantatie van deze cellen heeft echter verschillende problemen, voornamelijk het onvermogen van volwassen stamcellen om te differentiëren in cardiomyocyten en hun korte levensduur6.

De ethische kwesties met betrekking tot het gebruik van embryonale stamcellen (ES) kunnen worden omzeild door iPSC's, die een veelbelovende bron van cellen zijn. Bovendien beschikken iPSC's over sterke zelfvernieuwingscapaciteiten en kunnen ze differentiëren in cardiomyocyten7. Studies hebben aangetoond dat hiPSC-CMs getransplanteerd in de MI-site kunnen overleven en gap junctions vormen met gastheercellen 8,9. Omdat deze getransplanteerde cellen zich echter in de micro-omgeving van ischemie en ontsteking bevinden, is hun overlevingskans extreem laag10,11.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de overlevingskans van getransplanteerde cellen te verbeteren, zoals hypoxie en hitteschokvoorbehandeling van getransplanteerde cellen12,13, genetische modificatie 14,15 en de gelijktijdige transplantatie van cellen en haarvaten 16. Helaas worden de meeste methoden beperkt door complexiteit en hoge kosten. Daarom stelt deze studie een reproduceerbare, handige, relatief invasieve en effectieve hiPSC-CM-toedieningsmethode voor.

Echogeleide intramyocardiale celinjectie kan worden uitgevoerd met alleen een kleine veterinaire echografiemachine met hoge resolutie en een micro-injector, ongeacht de locatie. Onder echografische begeleiding is het direct afleveren van cellen onder het xiphoid-proces van het hartzakje naar het myocardium bij muizen een veilig protocol dat lever- en longschade voorkomt. Deze methode kan gelijktijdig met andere technologieën worden gecombineerd om de overlevingskans van getransplanteerde cellen aanzienlijk te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het Second Xiangya Hospital van de Central South University. Zie de Tabel met materialen voor details over alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. De tijdlijnen voor celinjectie, beeldvorming en euthanasie zijn als volgt: t0- induce infarct, t1 week- beeld- en implantaatcellen, t2 weken- beeld- en implantaatcellen, t4 weken- definitieve beeldvorming, euthanasie en weefselverzameling.

1. hiPSC-cultuur, cardiomyocytendifferentiatie en celzuivering

  1. Meng DMEM/F12 en keldermembraanmatrixoplossing met ijs bij 4 °C in een verhouding van 1,5:1, aliquot, en bewaar het resulterende mengsel (matrixverdunningsmiddel) bij -20 °C. Meng 25 ml DMEM/F12-kweekmedium bij 4 °C en 1 ml matrixverdunningsmiddel grondig met ijs en verdeel 1 ml/put in een plaat met 6 putten. Houd de plaat 1 uur rechtop in een incubator bij 37 °C en zuig het DMEM/F12-supernatant uit de putjes. Raak de onderkant van de 6-putplaat niet aan tijdens het uitvoeren van de procedure.
  2. Verwijder de cryopreservatiebuis met de hiPSC's uit vloeibare stikstof en ontdooi ze snel in een waterbad van 37 °C. Steriliseer het buitenoppervlak van de cryopreservatiebuis met 75% alcohol, veeg de alcohol af en breng de buis over naar een steriele ultraschone tafel.
  3. Gebruik een pipet om de cryopreservatieoplossing met hiPSC's voorzichtig over te brengen in een centrifugebuis van 15 ml, voeg 5 ml invoervrij ES-medium toe en centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g . Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen voorzichtig in 6 ml van het feedervrije ES-medium. Tel de cellen en pas de celconcentratie aan op 5 × 105 cellen/ml met het kweekmedium.
  4. Voeg ROCK-remmer (Y27632) toe aan de hiPSC's tot een eindconcentratie van 5 μM. Breng de hiPSC's met Y27632 over naar de 6-well-plaat die is voorbehandeld met keldermembraanmatrix en draai voorzichtig de 6-well-plaat, waarbij de vorm van het getal "8" wordt gevolgd om de hiPSC's gelijkmatig te verdelen. Plaats de hiPSC's in een vochtige incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur rechtop. Vervang het supernatant door het feedervrije ES-medium zonder de Y27632.
  5. Wanneer hiPSC's 80% mate van samenvloeiing bereiken, zuigt u het kweeksupernatant op, wast u de cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voegt u insulinevrije RPMI1640 + B27 toe met 10 μM CHIR99021 (GSK3-β-remmer) en plaatst u de hiPSC's gedurende 24 uur in een vochtige CO 2-incubator bij 37 °C.
  6. Vervang de helft van het supernatant door RPMI1640 + B27 medium zonder insuline en incubeer de cellen gedurende nog eens 24 uur.
  7. Vervang het kweekmedium volledig door RPMI1640 + B27 (zonder insuline). Plaats de platen in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur rechtop.
  8. Vervang het kweekmedium na 3 dagen volledig door insulinevrije RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt-signaalwegremmer) en plaats de platen in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
  9. Vervang het kweekmedium na 5 dagen door RPMI1640 + B27 zonder insuline en blijf gedurende 48 uur incuberen in een vochtige CO 2-incubator bij 37 °C.
  10. Vervang het kweekmedium na 7 dagen door het RPMI + B27 (inclusief insuline) medium en plaats de platen gedurende 3 dagen in een bevochtigde CO 2-incubator bij 37 °C. Vervang het medium elke 3 dagen door het RPMI + B27 medium. Zoek naar het spontaan kloppen van cellen na 9-12 dagen differentiatie.
  11. Vervang na het observeren van de pulserende cellen het RPMI + B27-medium door glucosevrij RPMI 1640-medium dat melkzuur bevat (1 ml melkzuur toegevoegd aan 500 ml glucosevrij RPMI 1640-medium). Incubeer de cellen gedurende 72 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  12. Vervang na 72 uur het supernatant door RPMI + B27 medium en incubeer gedurende 48 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  13. Zuig het kweeksupernatant op onder onderdruk en was de cellen 3x met PBS om sporen van het kweekmedium te verwijderen. Gebruik het enzymmengsel voor celloslating om de hiPSC-CMs bij 37 °C in afzonderlijke cellen te dissociëren. Verzamel de verkregen cellen in een centrifugebuis van 15 ml met 3 ml cardiomyocytenondersteuningsoplossing, centrifugeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g en gooi het supernatant weg.
  14. Resuspendeer de cellen met RPMI + B27-medium, zaai ze op 6-putplaten met keldermembraanmatrix en incuber ze gedurende 48 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  15. Vervang het kweeksupernatant voor zuivering door glucosevrij RPMI 1640-medium dat melkzuur bevat en incubeer gedurende 72 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  16. Vervang het kweeksupernatant door RPMI + B27 medium en verander het medium om de 3 dagen.
  17. Ga door met het bovenstaande proces gedurende 30 dagen en vervang het kweeksupernatant door glucosevrij medium dat melkzuur bevat voor verdere zuivering. Incubeer de cellen gedurende 3 dagen met dit medium en vervang het supernatant door RPMI + B27. Kweek de cellen continu gedurende 30 dagen totdat de hiPSC-CMs stabiel kloppen en gebruik deze cellen voor intramyocardiale injectie bij muizen.

2. Voorbereiding van hiPSC-CMs en de opstelling van een acuut myocardinfarctmodel bij muizen

  1. Vacuüm aspirateer het kweeksupernatant van hiPSC-CMs gekweekt gedurende 60 dagen, was de cellen 3x met PBS en dissocieer de hiPSC-CMs in individuele cellen bij 37 °C met het celloslatingsenzymmengsel (~ 3-5 min). Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml RPMI + B27-medium en meng goed voordat u de cellen telt om het totale aantal cellen te berekenen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op 300 × g . Gooi het supernatant weg en voeg cardiomyocytenondersteunend medium toe om te resuspenderen tot een concentratie van 0,6 × 105 cellen/μL.
  2. Houd de centrifugebuis met de geresuspendeerde hiPSC-CMs gereed bij 37 °C voor injectie 14,17,18,19,20.
  3. Plaats de muizen in een anesthesiedoos die is verbonden met isofluraan om anesthetische inhalatie te induceren, gevolgd door het gebruik van vetzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl ze onder narcose zijn.
    OPMERKING: De isofluraanconcentratie was 5%. Let tijdens het experiment op laboratoriumventilatie.
  4. Let op verlies van reflexen in de voeten en het staartgebied na het knijpen wanneer de muis plat op de operatietafel wordt gelegd, wat wijst op voldoende anesthesie. Buprenorfine (0,1 mg/kg) intraperitoneaal toedienen.
  5. Smeer het haar op het midden van de nek en de linkerborst van de muizen in met een ontharingscrème en veeg de aangebrachte crème en het haar na 5 minuten af met gaas.
  6. Bevestig de ledematen en de muizenstaart met tape. Bevestig de snijtanden van de muis met een 2-0 zijden draad en tape. Steriliseer het operatiegebied (mediane nek en linkerborst) met drie afwisselende rondes betadine gevolgd door alcohol.
  7. Plaats een chirurgisch gordijn rond het gesteriliseerde chirurgische gebied. Maak vervolgens een mediane nekincisie met een fijne anatomische schaar en een fijne ontleedtang om de luchtpijp volledig bloot te leggen. Snijd indien nodig een paar voorste cervicale spieren af voor stabilisatie.
    OPMERKING: De operators waren blind voor de diergroepen.
  8. Breng een tracheale buis (20 G katheterpunctienaald) door de mond.
  9. Sluit de tracheale buis aan op de ventilator en controleer op thoracale beweging om ervoor te zorgen dat beide longen goed worden geventileerd.
  10. Pas de ademhalingsparameters aan (ademhalingssnelheid: 100-150 bpm, getijdenvolume 250-300 μL). Bevestig daarna de linkerachterpoot aan de rechteronderkant, maak de tape rond de linker bovenste ledemaat los en voer een thoracotomie uit in de 3-4 intercostale ruimte van de linker thorax met behulp van een fijne ontleedschaar en tang voor maximale blootstelling aan het hart.
  11. Verwijder met een tang het hartzakje onder een microscoop om de linker voorste dalende kransslagader (LAD) aan de onderrand van het linker atriale aanhangsel te visualiseren.
  12. Gebruik een 6-0 zijden draad om het proximale uiteinde van de LAD te ligaten. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het acute MI-model voldoende is vastgesteld (wanneer de distale LAD op de ligatieplaats verandert van rood naar wit), sluit u de borstkas laag voor laag en hecht u de huid met 4-0 intermitterende hechtingen met schroefdraad. Voer alle bovengenoemde chirurgische procedures uit voor MI-inductie voor de schijngroep van dieren, behalve voor ligatie.
  13. Schakel de inhalatie-anesthesie uit, verwijder de canule nadat de muis de spontane ademhaling hervat en breng deze terug naar zijn kooi. Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om sternale lighouding te behouden. Breng het niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld. Dien intraperitoneale injecties van buprenorfine (0,1 mg/kg x 3 dagen) en carprofen (5 mg/kg x 1 dag) elke 12 uur postoperatief toe.
  14. Injecteer ciclosporine A (10 mg·kg-1·dag-1) in de intraperitoneale holte van muizen 3 dagen voor toediening van hiPSC-CMs om de afstoting van de getransplanteerde cellen te voorkomen. Injecteer ciclosporine A continu gedurende 1 maand na transplantatie.

3. hiPSC-CM injectie onder echografische begeleiding

  1. Na het instellen van het MI-model, wijst u de MI-modelmuizen (12 weken oude C57BL / 6-muizen; 22 g tot 24 g in gewicht, 50% mannelijk en 50% vrouwelijk) toe aan groepen met een enkele dosis (SD, n = 8 in deze studie) en groepen met meerdere doses (MD, n = 8 in deze studie) op de eerste post-MI-dag en plaatst u ze in de eerste en tweede week na MI in een anesthesiebox verbonden met 5% isofluraan voor de inductie van inhalatie-anesthesie gevolgd door tracheale intubatie.
  2. Smeer het haar op de borst en bovenbuik van de muizen in met ontharingscrème en veeg de crème 5 minuten later af met gaas. Controleer de hartslag van de muis op de operatiekaart en dien inhalatie-isofluraan toe totdat de hartslag op 400-500 bpm wordt gehouden.
  3. Bevestig de ledematen en staart van de muis met tape op de detectieconsole en stel de platformtemperatuur in op 37 °C.
  4. Breng een speciale ultrasone gelei aan op de bovenbuik en gebruik een kleinere veterinaire ultrasone sonde met hoge resolutie om leverbeelden van muizen te verkrijgen.
  5. Verlaag de ventilatorsnelheid tot 50 bpm. Gebruik een microspuit van 5 μL om ~3 × 105 cellen te tekenen (vanaf stap 2.1). Houd de spuit vast met een micromanipulator en steek een naald van 3 mm in het linker para-xiphoid-proces (figuur 1A). Volg de bovenrand van het middenrif onder echografische begeleiding (figuur 1B), observeer het ademhalingsritme en -bereik (figuur 1C, D) en voer het hartzakje in aan het einde van de expiratoire cyclus om schade aan de lever en de longen te voorkomen (figuur 1D).
  6. Nadat de micro-injectornaald de pericardholte is binnengegaan, past u de ademhalingssnelheid aan op de oorspronkelijke parameter (150 bpm). Verkrijg het parasternale lange-asbeeld van het muizenhart door M-schimmel echocardiografie volgens de instructies van de fabrikant17 (figuur 1E). Injecteer onder ultrasone begeleiding 3 × 10 5 cellen (figuur 1F) in drie marginale gebieden (1 × 105 cellen per geïnjecteerde plaats) van de infarctplaats.
  7. Verwijder de speciale ultrasone sonde en spoel de gelei af. Spenen de muis van de inhalatie-anesthesie en breng hem na volledig bewustzijn terug naar zijn kooi.
  8. Herhaal de bovenstaande echogeleide celinjectieprocedures 1 en 2 weken na het vaststellen van MI voor de MD-groep muizen.

4. Evaluatie van de hartfunctie, fluorescentielabeling, getransplanteerd celgetal, myocardinfarct en detectie van menselijke mitochondriën van organen bij muizen 30 dagen na de ligatie van de linker voorste dalende tak

  1. Hartfunctie beoordeling
    1. Plaats de muis in een met isofluraan verbonden anesthesiedoos voor inductie-inhalatie-anesthesie, gevolgd door het gebruik van vetzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens anesthesie. Verwijder het haar op de linkerborst van de muis met ontharingscrème. Leg de muis op het bedieningspaneel om de hartslag te controleren en de isofluraaninhalatie aan te passen. Houd de hartslag van de muis op 400-500 bpm. Het experimentele eindpunt is dag 30 (na de MI-inductie).
    2. Bevestig de ledematen en staart van de muis met tape op de detectieconsole en stel de platformtemperatuur in op 37 °C.
    3. Na het aanbrengen van een speciale ultrasone gel op het voorste hartgebied, gebruikt u een (veterinaire) cardiale ultrasone sonde met hoge resolutie om parasternale beelden met lange as en tweedimensionale korte-asbeelden te verkrijgen onder echocardiografie van M-schimmel en B-schimmel volgens de instructies van de fabrikant17.
    4. Nadat de ultrasone detectie is voltooid, spoelt u de speciale ultrasone gel af, schakelt u de inhalatie-anesthesie uit en brengt u de muis na volledig bewustzijn afzonderlijk terug naar zijn kooi.
    5. Analyseer de verkregen gegevens en bereken de linkerventrikel ejectiefractie (EF) en fractionele verkorting (FS) met behulp van de analysesoftware. Zorg ervoor dat de operator blind is voor de experimentele groepen17.
  2. Fluorescentie-etikettering van secties
    1. Was het geïsoleerde hart met PBS, dompel het onder in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 12 uur. Haal het hart eruit en dompel het gedurende 24 uur onder in 30% sucrose om uit te drogen.
    2. Sluit het gedehydrateerde hart in met de optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding op droogijs. Snijd het hart van onder tot aan de top met een cryostaatdikte van 10 μm en plaats de secties op dia's en bewaar de dia's bij -20 °C.
    3. Was de dia's met het hartweefsel met PBS gedurende 3 minuten.
    4. Permeabiliseer het weefsel op dia's met 0,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten en was ze 3x met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt.
    5. Nadat u het weefsel hebt bedekt met 10% ezelsserum en 90% PBS (blokkeringsoplossing), blokkeert u de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Na het verwijderen van de blokkerende oplossing, incubeer de secties met het primaire antilichaam (verdund tot 1:100 met de blokkerende oplossing) gedurende een nacht bij 4 °C. Was ze 3x met PBS gedurende 5 min per wasbeurt.
    7. Incubeer het weefsel op glaasjes met fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund tot 1:100 met de blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Vermijd het blootstellen van de weefsels met het fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam aan licht vanaf dit punt.
    8. Was de dia's 3x met PBS gedurende 5 min per wasbeurt.
    9. Monteer de dia's met behulp van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-bevattend montagemedium en fotografeer onder een fluorescentiemicroscoop17.
  3. Getransplanteerde hiPSC-CMs tellen17
    1. Voer weefselimmunofluorescentiekleuring uit op bevroren delen van het hart voor voetgangersspecifieke troponine T (hcTnT), humaan nucleair antigeen (HNA) en niet-specifieke sarcomerische alfa-actinine.
    2. Nadat het hele hart serieel is gesneden, neemt u één sectie voor elke 50 secties voor fluorescentie-etikettering.
    3. Leg willekeurig vijf afbeeldingen met een hoge vergroting per segment vast. Tel het geënte aantal gezichtsvelden, bereken het gemiddelde aantal getransplanteerde cellen per oppervlakte-eenheid en stel ze in als A1/μm2. Bereken het totale geënte oppervlak van het segment met ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) en stel dit in als B1μm2, zodat het geënte getal in dit segment = A1 × B121,22.
    4. Bereken het totale aantal getransplanteerde cellen per muizenhart met behulp van Eq (1) en het percentage engraftmentsnelheid met Eq (2), aangezien uit elke 50 secties één sectie werd gekozen21,22.
    5. Totaal aantal getransplanteerde cellen per muizenhart = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ Een × Bn) × 50 (1)
      engraftment tarief = figure-protocol-1 (2)
      OPMERKING: Het aantal leveringen bedroeg 3 × 10 5 voor de SD-groep en 3 × 3 × 105 voor de MD-groep.
  4. Beoordeling van het myocardinfarctgebied
    1. Snijd een dwarsdoorsnede bevroren sectie (korte as) van het geïsoleerde hart, van de top tot de basis van het hart met een dikte van 10 μm.
    2. Nadat het hele hart in serie is gesneden, neemt u één sectieschuif voor elke 30 secties en fixeert u deze in een voorverwarmde Bouin-oplossing bij 58 °C. Bevlek de sectie met 0,04% Direct Red en 0,1% Fast Green collageenvlekken (verdund in PBS) volgens de instructies van de fabrikant17.
    3. Gebruik software (bijv. ImageJ) om de beelden te analyseren na cross-sectionele fotografie van het hele lichaam van het hart onder een microscoop met behulp van Eq (3):14,17
      Infarctgebied % = figure-protocol-2 × 100% (3)
  5. Detectie van menselijk mitochondriaal DNA in verschillende organen
    1. Verdoof de muizen met 5% isofluraan en offer ze op door posterieure cervicale dislocatie. Ontleed de muizen 4 weken na celtransplantatie. Oogst de organen (lever, longen, hersenen, nieren, milt) en een deel van het myocardium (n = 3 in deze sectie).
    2. Maal elk orgaanweefsel in vloeibare stikstof en extraheer DNA uit het weefsel met behulp van de kit waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Volg de instructies van de fabrikant om de kit en primers waarnaar wordt verwezen te gebruiken (zie de materiaaltabel) om menselijk mitochondriaal DNA in de bovengenoemde weefsels te detecteren (vanaf stap 4.5.1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Echocardiografie voor evaluatie van de linkerventrikelfunctie van de muizen in elke groep toonde aan dat de MI-verwondingen effectief waren omgekeerd in de MD-groep (figuur 2A). Vergeleken met de MI-groep vertoonde de SD-groep een verhoogde ejectiefractie (EF) (van 30% tot 35%; Figuur 2B) en fractieverkorting (FS) (van 18% naar 22%; Figuur 2C) na MI. Het is echter nog belangrijker om op te merken dat meerdere injecties van de hiPSC-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De kritieke stappen van deze studie omvatten hiPSC-cultuur, cardiomyocytendifferentiatie, hiPSC-CM-zuivering en hiPSC-CM-transplantatie in de plaats van het myocardinfarct van de muis. De sleutel is om cardiale echografie te gebruiken om de behandeling transcutaan te leiden naar de infarctplaats aan de rand van het infarct waar hiPSC-CMs in het gebied werden geïnjecteerd.

Met de verlenging van de kweektijd verandert het hiPSC-CM-fenotype in morfologie (grotere celgrootte), structuur (spier, fi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Major Research Plan van de National Natural Science Foundation of China (nr. 91539111 tot JY), Key Project of Science and Technology van de provincie Hunan (nr. 2020SK53420 tot JY) en het Science and Technology Innovation Program van de provincie Hunan (2021RC2106 tot CF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichaam
Cardiac troponin TAbcamab8295
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150105
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555)Abcamab150110
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150073
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)Abcamab150062
Human cardiac troponin TAbcamab91605
Isolectin B4VectorFL-1201
Sarcomeric alpha actininAbcamab9465
Wheat germ agglutininThermo Fisher ScientificW11261
Reagens
AccutaseThermo Fisher Scientific00-4555-56
B27 Supplement(minus insulin)Thermo Fisher ScientificA1895601
B27 Supplement(serum free)Thermo Fisher Scientific17–504-044
Bouin's solutionThermo Fisher ScientificSDHT10132
CHIR99021SelleckCT99021
cyclosporine AMedchemexpressHY-B0579
DIRECT REDSigma-Aldrich365548-25G
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320033
DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69504
FAST GREEN FCFSigma-Aldrich F7252-5G
Glucose-free RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11879020
IWR1SelleckS7086
melkzuurSigma-AldrichL6661
MatrigelBD BiosciencesBD356234
mTeSR1Stem Cell Technologies72562
O.C.T. CompoundSAKURA4583
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PowerUP SYBR Green MasterMix kitThermo Fisher ScientificA25742
RPMI1640Thermo Fisher Scientific11875119
STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiffStem Cell Technologies5030
STEMdiff Cardiomyocyte Support MediumStem Cell Technologies5027
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
echografie koppelingsmiddelCARENT22396269389
Y-27632SelleckS6390
Apparatuur en benodigdheden
Applied BiosystemsThermo Fisher Scientific7500 Real-Time PCR
cryostatLeicaCM1950
fluorescentiemicroscoopOlympusIX83
fijne anatomische schaarFine Science Tools15000-08
fijne dissectiepincetFine Science Tools11255-20
Micro spuitHamilton7633
DiermodelanesthesiemachineMATRXVMR
Ultra-high resolutie klein dier echografie beeldvormingssysteemVisualSonicsVevo 2100
Software
Statistical Product and Service SolutionsIBM21
Image JNIH1.48
Human mitochondrial DNA primers
de voorwaartse primersequentieCCGCTACCATAATCATCGCTAT
de omgekeerde primersequentieTGCTAATACAATGCCAGTCAGG

Referenties

  1. Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
  2. Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  3. Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
  4. Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
  5. Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
  6. Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
  7. Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  8. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
  9. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
  10. Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
  11. Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
  12. Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
  13. Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
  14. Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
  15. Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
  16. Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
  17. Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873(2021).
  18. Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
  19. Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
  20. Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
  21. Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452(2019).
  22. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  23. Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).
  24. Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
  25. Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167(2019).
  26. Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Geïnduceerde pluripotente stamcellenmyocardinfarctechogeleide toedieningpercutane injectiecardiale reparatieceltransplantatieechocardiografisch geleide toedieningmenselijk mitochondriaal DNAangiogenesebeoordeling
Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.