Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Als moederlijk gekoesterde endosymbiont infecteert Wolbachia grote delen van de insectenpopulaties. Studies hebben onlangs de succesvolle regulatie van RNA-virusoverdracht gemeld met behulp van Wolbachia-getransfecteerde muggen. Belangrijke strategieën om virussen te beheersen zijn de manipulatie van de reproductie van de gastheer via cytoplasmatische incompatibiliteit en de remming van virale transcripties via immuunpriming en concurrentie voor van de gastheer afgeleide bronnen. De onderliggende mechanismen van de reacties van Wolbachia-getransfecteerde muggen op virale infectie zijn echter slecht begrepen. Dit artikel presenteert een protocol voor de in vitro identificatie van Wolbachia-infectie op het nucleïnezuur- en eiwitgehalte in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-cellen om het begrip van de interacties tussen Wolbachia en zijn insectenvectoren te verbeteren. Door het gecombineerde gebruik van polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve PCR, western blot en immunologische analytische methoden is een standaard morfologisch protocol beschreven voor de detectie van Wolbachia-geïnfecteerde cellen dat nauwkeuriger is dan het gebruik van een enkele methode. Deze aanpak kan ook worden toegepast op de detectie van Wolbachia-infectie in andere insectentaxa.
Inleiding
De Aziatische tijgermug Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), een belangrijke vector van het denguevirus (DENV) in Azië en andere delen van de wereld1, is een natuurlijke gastheer van twee soorten intracellulaire bacteriën, Wolbachia (wAlbA en wAlbB), die verspreid zijn over de kiembaan en somatisch weefsel 2,3. De Aa23-cellijn afgeleid van A. albopictus-embryo's bestaat uit ten minste twee morfologische celtypen, die beide infectie4 ondersteunen en kunnen worden genezen van inheemse Wolbachia-infectie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Materialen en reagentia
- Gebruik pyrogene oplossingen en media voor celkweek (zie de Tabel van Materialen).
- Gebruik ultrapuur water om alle oplossingen voor te bereiden.
- Wees voorzichtig bij het selecteren van foetaal runderserum (FBS) voor celkweek, na een veelcontroleproces.
OPMERKING: Aangezien FBS-partijen regelmatig kunnen worden gewijzigd, is het onmogelijk om de relevante catalogus en lotnummers in dit protocol te vermelden. - Selecteer Aa23-celstammen afgeleid van A. albopictus-eieren , overeenkomend met Wolbachia-vrije Aa23-T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voordat Wolbachia werd gedetecteerd, werden Aa23- en Aa23-T-cellen waargenomen onder een lichtmicroscoop om eventuele morfologische verschillen tussen de twee cellijnen te bepalen. Aa23- en Aa23-T-cellen hebben ten minste twee celmorfologieën, maar geen duidelijk morfologisch verschil tussen de twee celtypen (figuur 1). Hier werden Aa23-cellen gebruikt als een modelsysteem om Wolbachia-infectie te detecteren met behulp van vier methoden. Positieve amplifica.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie is essentieel voor de studie van Wolbachia-gastheerinteracties en de bevestiging van succesvolle transfectie van cellen met nieuwe stammen. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren op het nucleïnezuur- en eiwitniveau. Deze vier experimentele methoden bevestigden en verbeterden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen.
PCR we.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We bedanken Dr. Xin-Ru Wang van de Universiteit van Minnesota voor inzichtelijke suggesties en begeleiding. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (No.81760374).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petrischaal | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipet | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysesoftware | In-house ontwikkeld | ||
| Cerium-gedoteerd yttrium-aluminiumgarnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG enkele kristalsubstraten | |
| Chiphouder | In-house ontwikkeld | ||
| Besturingssoftware | In-house ontwikkeld | ||
| Dompelolie | Cargille Laboratories | 16482 | Type A lage viscositeit 150 cSt |
| inSituX platform | In-house ontwikkeld | ||
| IR-lichtbron | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED met een glazen lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Buitenring | In-house ontwikkeld | ||
| Pomplasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Veiligheidsring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1-veer voor Ø1" lensbuizen en montages |
| Kwartskristal zonder zaad | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25,4 mm diameter Z-cut 0,05 mm dikte dubbelzijdig polijsten 8 mm op -X |
| Shim | In-house ontwikkeld | ||
| Röntgenstraalstop | In-house ontwikkeld |
Referenties
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
