Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63664

⸱

28 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

In dit artikel

Samenvatting

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Samenvatting

Neutronenverstrooiing biedt de mogelijkheid om de dynamiek in monsters te onderzoeken voor een breed scala aan energieën op een niet-destructieve manier en zonder andere etikettering dan deuterium. Met name neutronen-backscatteringsspectroscopie registreert de verstrooiingssignalen onder meerdere verstrooiingshoeken tegelijk en is zeer geschikt om de dynamiek van biologische systemen op de ps-ns-tijdschaal te bestuderen. Door gebruik te maken van D2O- en mogelijk gedeutereerde buffercomponenten - maakt de methode het mogelijk om zowel het centrum van massadiffusie als backbone- en zijketenbewegingen (interne dynamiek) van eiwitten in vloeibare toestand te monitoren.

Bovendien kan hydratatiewaterdynamiek worden bestudeerd door poeders van geperdeutereerde eiwitten gehydrateerd met H2O te gebruiken. Dit artikel presenteert de workflow die wordt gebruikt op het instrument IN16B van het Institut Laue-Langevin (ILL) om de dynamiek van eiwit- en hydratatiewater te onderzoeken. De bereiding van oplossingsmonsters en gehydrateerde eiwitpoedermonsters met behulp van dampuitwisseling wordt uitgelegd. De data-analyseprocedure voor zowel eiwit- als hydratatiewaterdynamica wordt beschreven voor verschillende soorten datasets (quasi-elastische spectra of fixed-window scans) die kunnen worden verkregen op een neutronenbackscattering spectrometer.

De methode wordt geïllustreerd met twee studies met amyloïde eiwitten. De aggregatie van lysozym in bolvormige aggregaten ter grootte van μm - aangeduid met deeltjes - blijkt plaats te vinden in een proces van één stap op het ruimte- en tijdsbereik dat op IN16B wordt onderzocht, terwijl de interne dynamiek ongewijzigd blijft. Verder werd de dynamiek van hydratatiewater van tau bestudeerd op gehydrateerde poeders van geperdeuteerd eiwit. Het is aangetoond dat translationele bewegingen van water worden geactiveerd bij de vorming van amyloïde vezels. Ten slotte worden kritische stappen in het protocol besproken over hoe neutronenverstrooiing is gepositioneerd met betrekking tot de studie van dynamica ten opzichte van andere experimentele biofysische methoden.

Inleiding

Het neutron is een ladingloos en massief deeltje dat in de loop der jaren met succes is gebruikt om monsters te onderzoeken op verschillende gebieden, van fundamentele fysica tot biologie1. Voor biologische toepassingen worden neutronenverstrooiing met een kleine hoek, inelastische neutronenverstrooiing en neutronenkristallografie en reflectometrie op grote schaal gebruikt 2,3,4. Inelastische neutronenverstrooiing biedt een ensemblegemiddelde meting van de dynamiek zonder dat specifieke etikettering per se nodig is, en een signaalkwaliteit die niet afhankelijk is van de grootte of het eiwit5. De meting kan worden uitgevoerd met behulp van een zeer complexe omgeving voor het onderzochte eiwit dat het intracellulaire medium nabootst, zoals een gedeutereerd bacterieel lysaat of zelfs in vivo 3,6,7. Verschillende experimentele opstellingen kunnen worden gebruikt om de dynamica te bestuderen, namelijk i) time-of-flight-giving access to sub-ps-ps dynamics, ii) backscattering-giving access to ps-ns dynamics, and iii) spin-echo-giving access to dynamics from ns to hundreds of ns. Neutronenverstrooiing maakt gebruik van de wet van Bragg 2d sinθ = nλ, waarbij d de afstand is tussen vlakken in een kristal, θ de verstrooiingshoek, n de verstrooiingsvolgorde en λ de golflengte. Het gebruik van kristallen voor backscattering naar de detectoren zorgt voor het bereiken van een hoge resolutie in energie, meestal ~ 0,8 μeV. Om de energie-uitwisseling te meten, wordt ofwel een Doppler-aandrijving met een kristal in backscattering gebruikt om de inkomende neutronengolflengte 8,9,10 te definiëren en af te stemmen (figuur 1), of een time-of-flight-opstelling kan worden gebruikt ten koste van een afname van de energieresolutie 11.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schets van een neutronen-backscattering spectrometer met een Doppler-aandrijving. De inkomende bundel raakt de phase space transformation (PST) chopper42, waardoor de flux op de monsterpositie toeneemt. Vervolgens wordt het teruggekaatst naar het monster door de Doppler-aandrijving, die een energie E1 (cyaanpijl) selecteert. De neutronen worden vervolgens verstrooid door het monster (met verschillende energieën vertegenwoordigd door de kleur van de pijlen) en de analyzers, gemaakt van Si 111-kristallen, zullen alleen neutronen met een specifieke energie E0 terugverstrooien (rood gekleurde pijlen hier). Daarom wordt de momentumoverdracht q verkregen uit de gedetecteerde positie van het neutron op de detectorarray en wordt de energieoverdracht verkregen uit het verschil E1- E0. De verwachte vluchttijd voor de neutronenpuls die door de PST wordt geproduceerd, wordt gebruikt om het signaal van de neutronen die rechtstreeks naar de detectorbuizen zijn verspreid, weg te gooien. Afkorting: PST = phase space transformation. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor backscatteringspectroscopie is de belangrijkste bijdrage aan het signaal van waterstofprotonrijke monsters, zoals eiwitten, afkomstig van onsamenhangende verstrooiing, waarvoor de verstrooiingsintensiteit Sinc(q, ω) wordt weergegeven door Eq (1)12

figure-introduction-2 (1)

Waarbij σinc de onsamenhangende doorsnede van het beschouwde element is, is k' de norm van de verstrooide golfvector, k de norm van de inkomende golfvector, q (= k - k') de impulsoverdracht, r j(t) de positievector van atoom j op tijdstip t, en ω de frequentie die overeenkomt met de energieoverdracht tussen het inkomende neutron en het systeem. De hoekige haakjes geven het ensemblegemiddelde aan. Vandaar dat onsamenhangende verstrooiing de ensemble-gemiddelde zelfcorrelatie van één deeltje van atoomposities met de tijd onderzoekt en de zelfdynamiek gemiddeld geeft over alle atomen in het systeem en verschillende tijdsoorsprongen (ensemblegemiddelde). De verstrooiingsfunctie is de Fouriertransformatie in de tijd van de tussenliggende verstrooiingsfunctie I(q, t), die kan worden gezien als de Fouriertransformatie in de ruimte van de van Hove-correlatiefunctie weergegeven door Eq (2):

figure-introduction-3 (2)

Waarbij ρ(r,t) de kansdichtheid is van het vinden van een atoom op positie r en tijd t 13.

Voor een Fickisch diffusieproces resulteert de zelfdiffusiefunctie (zie Eq (3)) na een dubbele Fouriertransformatie in een verstrooiingsfunctie bestaande uit een Lorentzian met een lijnbreedte gegeven door γ = Dq2.

figure-introduction-4 (3)

Meer geavanceerde modellen werden ontwikkeld en nuttig bevonden, zoals het sprongdiffusiemodel van Singwi en Sjölander voor ps-ns interne eiwitdynamica14 of het rotatiemodel van Sears voor hydratatiewater15,16,17.

Op het neutron backscattering (NBS) instrument IN16B 8,9 bij de IBL, Grenoble, Frankrijk (aanvullende figuur S1), bestaat een opstelling die vaak wordt gebruikt met eiwitten uit Si 111-kristallen voor de analyzers met een doppleraandrijving voor het afstemmen van de inkomende golflengte (aanvullende figuur S2A), waardoor toegang wordt gegeven tot het momentumoverdrachtsbereik ~ 0,2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 en energieoverdrachtsbereik van -30 μeV < figure-introduction-5 < 30 μeV-overeenkomend met tijdschalen variërend van enkele ps tot enkele ns en afstanden van enkele Å. Daarnaast biedt IN16B de mogelijkheid om elastische en inelastische fixed-window scans (E/IFWS)10 uit te voeren, waaronder data-acquisitie bij een vaste energieoverdracht. Omdat de flux beperkt is bij het werken met neutronen, maakt E/IFWS het mogelijk om de flux voor één energieoverdracht te maximaliseren, waardoor de acquisitietijd die nodig is om een bevredigende signaal-ruisverhouding te verkrijgen, wordt verkort. Een recentere optie is de backscattering en time-of-flight spectrometer (BATS) -modus11, waarmee een breed scala aan energieoverdrachten kan worden gemeten (bijv. -150 μeV < < figure-introduction-6 150 μeV), met een hogere flux dan met de Doppler-aandrijving, maar ten koste van een lagere energieresolutie (aanvullende figuur S2B).

Een belangrijke eigenschap van neutronenverstrooiing is dat de onsamenhangende doorsnede σinc een 40 keer hogere waarde heeft voor waterstof dan voor deuterium en verwaarloosbaar is voor andere elementen die vaak in biologische monsters worden aangetroffen. Daarom kan de dynamiek van eiwitten in een vloeibare omgeving worden bestudeerd met behulp van een gedeutereerde buffer, en de poedertoestand maakt de studie mogelijk van ofwel eiwitinterne dynamiek met gehydrogeneerd eiwitpoeder gehydrateerd met D 2 O, of de studie van hydratatiewater voor geperdeutereerd eiwitpoeder gehydrateerdmet H2O. In vloeibare toestand maakt neutronenverstrooiing meestal gelijktijdige toegang mogelijk tot het massacentrum zelfdiffusie van eiwitten (Fickian-type diffusie) en hun interne dynamiek. De laatste zijn ruggengraat- en zijketenbewegingen die meestal worden beschreven door het zogenaamde sprongdiffusiemodel of andere 3,18. In gehydrogeneerde eiwitpoeders is de eiwitdiffusie afwezig en hoeft alleen de interne dynamiek te worden gemodelleerd. Voor hydratatiewater vertonen de bijdragen van translatie- en rotatiebewegingen van watermoleculen een andere afhankelijkheid van de momentumoverdracht q, wat hun onderscheid in het data-analyseproces mogelijk maakt17.

Dit artikel illustreert de neutronen-backscatering-methode met de studie van eiwitten die zich bleken te kunnen ontvouwen, aggregeren tot een canonieke vorm bestaande uit stapels β-strengen - het zogenaamde cross-β-patroon19,20 - en langwerpige vezels vormen. Dit is de zogenaamde amyloïde aggregatie, die uitgebreid wordt bestudeerd vanwege zijn centrale rol bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson21,22. De studie van de amyloïde eiwitten wordt ook gemotiveerd door de functionele rol die ze kunnen spelen 23,24 of hun hoge potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe biomaterialen25. De fysisch-chemische determinanten van de amyloïde aggregatie blijven onduidelijk en er is geen algemene theorie van amyloïde aggregatie beschikbaar, ondanks enorme vooruitgang in de afgelopen jaren21,26.

Amyloïde aggregatie impliceert veranderingen in eiwitstructuur en stabiliteit met de tijd, waarvan de studie van nature dynamiek impliceert, gekoppeld aan eiwitconformatiestabiliteit, eiwitfunctie en eiwitenergielandschap27. Dynamica is direct gekoppeld aan de stabiliteit van een specifieke toestand door de entropische bijdrage voor de snelste bewegingen28, en de eiwitfunctie kan worden ondersteund door bewegingen op verschillende tijdschalen van sub-ps voor lichtgevoelige eiwitten29 tot ms voor domeinbewegingen, die kunnen worden vergemakkelijkt door picoseconde-nanoseconde dynamica30.

Twee voorbeelden van het gebruik van neutronenbackscattering spectroscopie om amyloïde eiwitten te bestuderen zullen worden gepresenteerd, één in vloeibare toestand om eiwitdynamica te bestuderen en één in gehydrateerde poedertoestand om hydratatiewaterdynamica te bestuderen. Het eerste voorbeeld betreft de aggregatie van lysozym in bolletjes ter grootte van μm (deeltjes genoemd) gevolgd in real time5, en het tweede een vergelijking van de waterdynamiek in inheemse en geaggregeerde toestanden van het menselijke eiwit tau31.

Lysozym is een enzym dat betrokken is bij de immuunafweer en bestaat uit 129 aminozuurresiduen. Lysozym kan deeltjes vormen in gedeutereerde buffer bij pD van 10,5 en bij een temperatuur van 90 °C. Met neutronenverstrooiing toonden we aan dat de tijdsevolutie van de diffusiecoëfficiënt van het massamiddelpunt van lysozym de enkele exponentiële kinetiek van thioflavine-T-fluorescentie volgt (een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om de vorming van amyloïde cross-β-patronen32 te volgen, wat aangeeft dat de vorming van deeltjessuperstructuren en kruis-β patronen in één stap met dezelfde snelheid plaatsvinden. Bovendien bleef de interne dynamiek constant gedurende het aggregatieproces, wat kan worden verklaard door een snelle conformatieverandering die niet kan worden waargenomen op NBS-instrumenten, of door de afwezigheid van significante verandering in interne eiwitenergie bij aggregatie.

Het menselijke eiwit tau is een intrinsiek ongeordend eiwit (IDP) bestaande uit 441 aminozuren voor de zogenaamde 2N4R-isovorm, die met name betrokken is bij de ziekte van Alzheimer33. Met behulp van neutronenverstrooiing op poeders van geperdeutereerd eiwit tau, toonden we aan dat de hydratatiewaterdynamiek wordt verhoogd in de vezeltoestand, met een hogere populatie watermoleculen die translationele bewegingen ondergaan. Het resultaat suggereert dat een toename van hydratatiewaterentropie de amyloïde fibrillatie van tau zou kunnen veroorzaken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid de gedeutereerde buffer voor eiwitten in vloeibare toestand voor

  1. Los alle componenten van de buffer op in zuiver D2O.
  2. Als de pH-elektrode is gekalibreerd in H2O, past u de pD aan volgens de formule pD = pH + 0,4 met NaOD of DCl34.
    OPMERKING: Het gebruik van D 2 Oin plaats van H2O kan de oplosbaarheid van eiwitten beïnvloeden en de buffercondities moeten mogelijk worden aangepast (bijvoorbeeld door een kleine verandering in de zoutconcentratie).

2. Bereid de H2O-gehydrateerde poeders van geperdeuteerd eiwit

  1. Bereid de monsterhouder voor.
    1. Reinig een platte aluminium monsterhouder met zijn indiumdraadafdichting en schroeven grondig met water en ethanol en laat deze drogen.
      OPMERKING: Er wordt een platte monsterhouder gebruikt zodat het poeder homogeen over het oppervlak kan worden verdeeld. De hoeveelheid poeder moet voldoende zijn om tussen de wanden te worden gehouden en niet te vallen wanneer de monsterhouder verticaal wordt geplaatst.
    2. Weeg de verschillende delen van de monsterhouder - bodem, deksel en indiumdraad - afzonderlijk af op een precisiebalans.
    3. Plaats de indiumdraadafdichting van 1 mm in de groef van het onderste deel van de monsterhouder en laat een kleine overlap achter waar de twee uiteinden samenkomen (figuur 2A).
    4. Plaats een geschikte hoeveelheid gelyofiliseerd eiwit (meestal ~ 100 mg eiwit) zodanig dat het het binnenoppervlak van het onderste deel van de monsterhouder vult.
  2. Hydrateer het eiwitpoeder.
    1. Plaats de monsterhouder gedurende 24 uur in een exsiccator met een petrischaaltje met P2O5-poeder om het eiwitpoeder35 volledig te drogen (figuur 2B). Weeg het droge onderste deel van de monsterhouder met de indiumafdichting en het droge poeder af om hetdroge te verkrijgen.
      LET OP: P2O5 poeder is zeer corrosief.
    2. Haal de P 2 O5 uit de exsiccator en zet er een petrischaaltje met D2Oin. Controleer de massa van het poeder regelmatig om het hydratatieniveau h = m hyd / m droog te controleren, waarbij mhyd en mdroog respectievelijk de massa van het gehydrateerde poeder en het droge poeder zijn.
      OPMERKING: Voor zeer hydrofobe eiwitten zoals insuline kan het nodig zijn om de temperatuur in de exsiccator te verhogen om een hogere dampdruk te krijgen en het gewenste hydratatieniveau h te bereiken.
    3. Herhaal stap 2.2.1 en 2.2.2 ten minste drie keer om alle uitwisselbare waterstofatomen goed om te zetten in deuteronen.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen cycli van vriesdrogen en oplossen in zuiver D2O worden gebruikt voor een betere H / D-uitwisseling, op voorwaarde dat het eiwit er niet door wordt beïnvloed.
    4. Hydrateer het poeder tot iets boven het gewenste niveau, laat het onderste deel van de monsterhouder met de indiumdraad en het gehydrateerde poeder op de precisiebalans blijven en wacht tot de massa langzaam afneemt tot de gewenste waarde om de doelh te krijgen (meestal 0,2-0,4 als een middelgroot bolvormig eiwit moet worden bedekt door één volledige hydratatielaag).
    5. Plaats snel het deksel op het onderste deel en sluit de monsterhouder eerst met vier schroeven om de dampuitwisseling te stoppen (aanvullende figuur S3A).
    6. Plaats en draai alle resterende schroeven vast totdat er geen opening zichtbaar is tussen het onderste deel en het deksel (aanvullende figuur S3B).
    7. Weeg de verzegelde monsterhouder af om te controleren op mogelijk hydratatieverlies via lekken na het neutronenexperiment.

3. Voer het onsamenhangende neutronenverstrooiingsexperiment uit

  1. Bespreek en controleer de configuratie van het instrument dat nodig is voor het experiment met het lokale contact enkele weken voor de toegewezen beamtime.
  2. Bereid het vloeistoftoestandsmonster voor.
    1. Los het eiwit op in de gedeutereerde buffer.
    2. Bepaal het juiste volume vloeistof dat met water in de monsterhouder moet worden gedaan (zorg ervoor dat er geen overloop is wanneer de monsterhouder gesloten is; Figuur 2C).
      OPMERKING: De volgende stappen (3.3 en 3.4) beschrijven een experiment uitgevoerd op de NBS-spectrometer IN16B bij de IBL8,9, waarbij een cryofurnace als monsteromgeving werd gebruikt. Het instrumentbesturingssysteem zal van het ene instrument naar het andere veranderen, maar de werkingsprincipes blijven hetzelfde.
  3. Voeg het voorbeeld in.
    1. Droog de monsterstaaf grondig af (figuur 2D) en verwijder het vorige monster, indien aanwezig, na te hebben gecontroleerd of de dosis ioniserende straling lager is dan 100 μSv/h voordat u materiaal hanteert (bij de IBL).
    2. Plaats het monster, controleer of de juiste centrering ten opzichte van het middelpunt van de bundel is (aanvullende figuur S4) en plaats de monsterstok in de cryofoven (figuur 2D). Schakel de vacuümpomp in om minder dan 10-3 bar te bereiken en spoel de lucht in de cryofoven weg door de volgende drie keer te herhalen: vul de cryofurnace met heliumgas totdat de atmosferische druk is bereikt en verwijder het gas opnieuw met behulp van de vacuümpomp.
      OPMERKING: In het geval van een vlakke monsterhouder moet de monsterhouder in een hoek van 45° ten opzichte van de binnenkomende bundel worden geplaatst. Het nuttige momentumoverdrachtsbereik kan worden verminderd als gevolg van absorptie en verstrooiing door de cel. Een sterke neutronenabsorber zoals cadmium kan worden gebruikt om bepaalde delen van de monsterhouder te maskeren (bijv. schroeven, dikke delen).
    3. Introduceer wat heliumgas in de cryofurnace, zodat de druk ~ 0,05 bar is.
  4. Gegevens verzamelen (bijv. met behulp van NOMAD op IN16B bij de IBL wordt aangenomen dat de gebruiker de voorkeur geeft aan een temperatuur van 200 K voordat hij een quasi-elastisch neutronenspectrum (QENS) -spectrum verwerft, vervolgens E / IFWS tijdens een temperatuurstijging tot 310 K bij 0,5 K per minuut en ten slotte een QENS bij 310 K).
    1. Met behulp van NOMAD sleept u op het tabblad Uitvoering een FurnaceCryostat-controller in het lanceerplatform. Stel de temperatuur in op 200 K. Gebruik de snelle modus en een time-out van 30 minuten , zodat de temperatuur de tijd heeft om te stabiliseren. Klik op het pictogram met de roterende pijlen om het op de achtergrond uit te voeren, zodat gegevens kunnen worden verkregen tijdens de temperatuurdaling.
    2. Sleep de IN16DopplerSettings-controller , stel het snelheidsprofiel in op Nauwkeurige snelheid ingesteld door Max ΔE, een waarde van 0,00 μeV en 128 kanalen om een EFWS-configuratie te verkrijgen.
    3. Sleep een Count-controller , vul het veld Ondertiteling in met een naam waarmee de gegevens eenvoudig kunnen worden geïdentificeerd en stel 60 herhalingen van 30 s-scans in (aanvullende figuur S5A).
    4. Sleep een IN16DopplerSettings-controller , stel het snelheidsprofiel in op Sinus ingesteld door Speed met een waarde van 4,5 m / s en 2.048 kanalen om een QENS-configuratie te verkrijgen.
    5. Sleep een Count-controller met 4 herhalingen van scans van 30 minuten (aanvullende figuur S5B).
    6. Voor de temperatuurhelling sleept u een FurnaceCryostat-controller , stelt u de temperatuur in op 310 K, stelt u Ramp in op SetPoint met Δ = 0,05 K en 6 s. Gebruik een time-out van 220 min (aanvullende figuur S6A).
    7. Gebruik een for-lus met 65 herhalingen. Plaats binnenin een IN16DopplerSettings-controller zoals in stap 3.4.2, gevolgd door een enkele telling van 30 s. Voeg vervolgens IN16DopplerSettings in, zoals eerder beschreven, maar met een energie-offset van 1,5 μeV en 1.024 kanalen , gevolgd door een enkele telling van 3 minuten (aanvullende figuur S6B).
    8. Als u de laatste QENS op 310 K wilt verkrijgen, sleept u IN16DopplerSettings en Count-controllers die zijn geconfigureerd zoals beschreven in respectievelijk stap 3.4.4 en 3.4.5.
    9. Druk op de startknop (rechterdriehoek onder in het venster) om het script uit te voeren.
      OPMERKING: Elk experiment vereist de verwerving van kalibratiegegevens; dat wil zeggen, de lege cel voor aftrekkings- of absorptiecorrecties, de buffer alleen bij de verschillende temperaturen die worden gebruikt om de achtergrond te modelleren, en een meting van vanadium (of gelijkwaardig, het monster bij een temperatuur van 10 K of lager) om de resolutiefunctie van het instrument te verkrijgen.

4. Data-analyse - QENS

  1. Importeer de dataset met behulp van de methode 'IN16B_QENS.process()' in de Python-software nPDyn v3.x36
    >>>> van nPDyn.dataParsers importeren IN16B_QENS

    >>> monster = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... formaat>]
    ... ). proces()

    >>> steekproef = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Voer gegevenscorrecties uit (optioneel) met de volgende opdrachten (zie de documentatie van nPDyn voor meer informatie, Afbeelding 3):
    #it wordt aangenomen dat gegevens voor lege cellen, vanadium en buffer
    # werden al geïmporteerd in dataset genaamd 'empty_cell', 'vanadium',
    # en 'buffer', respectievelijk.

    # voor aftrekken van lege cellen met een schaalfactor
    # (fouten worden automatisch doorgegeven)
    >>> monster = monster - 0,95 * empty_cell

    # voor correctie met Paalman-Ping-coëfficiënt
    # (wederzijds exclusief met het bovenstaande voorbeeld)
    >>> monster = monster.absorptieCorrectie(empty_cell)

    # voor normalisatie
    >>> monster = monster.normaliseren(vanadium)

    # voor binning langs waarneembare as
    # waarneembaar is hier de aggregatietijd
    >>> sample = sample.bin(3, as=0)
  3. Pas de kalibratiegegevens aan. De dataset-samples, lege cel, gedeutereerde buffer (indien nodig) en vanadium kunnen worden gemonteerd met behulp van ingebouwde modellen of een door de gebruiker gedefinieerd model (zie nPDyn documentatie):
    >>> van nPDyn.models.builtins import (
    ... modelPVoigt,
    ... modelWater,
    ... modelCalibratedD2O,
    ...     )

    # ingebouwde modellen gebruiken een kolomvector van het momentum
    # Q-waarden overbrengen
    >>> q = vanadium.q[:, Geen]

    # het vanadium is aangebracht met behulp van een pseudo-Voigt-profiel
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Gebruik het ingebouwde model voor hydratatiewater genaamd 'modelWater'. Dit model leest zoals weergegeven door Eq (4)17
    figure-protocol-1 (4)
    Waarbij een0, eenr en eent scalairen zijn die rekening houden met de relatieve bijdrage van respectievelijk elastische signaal-, rotatiebewegingen en translatiebewegingen; j1(qd) is de le orde bolvormige Besselfunctie, waarbij q de momentumoverdracht is; d de O-H-afstand in het watermolecuul; δ(ω) is de Dirac-delta, die hier wordt vermenigvuldigd met de EISF; N is de hoogste orde van de gebruikte bolvormige Besselfunctie (typisch ~5); figure-protocol-2 en zijn respectievelijk de Lorentziaanse rotatie- en figure-protocol-3 translatiebewegingen; b(q) is een vlakke achtergrondterm. De bolvormige Bessel-functies geven de relatieve bijdrage van elke impulsmomenttoestand van de watermoleculen, en het getal N wordt bepaald op basis van het momentumoverdracht q-bereik. In het geval van een typische NBS-spectrometer verklaren de termen tot N = 4 het signaal bijna volledig (aanvullende figuur S7).
    # Hier wordt vergelijking 2 gebruikt voor hydratatiewater
    # convolutie met resolutiefunctie en toevoeging van
    # D2O achtergrond wordt automatisch gedaan met de
    # aangedragen argumenten
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanadium,
    ... bkgd=buffer,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    OPMERKING: De bijdragen van rotatie- en translatiebewegingen moeten ingewikkeld zijn om perfect rigoureus te zijn. Het succes van een additievenmodel moet worden toegeschreven aan de aanwezigheid van verschillende waterpopulaties op het eiwitoppervlak en het beperkte beschikbare energiebereik.
  5. Gebruik het volgende om de gegevens uit te zetten (figuur 4):
    >>> van nPDyn.plot import plot
    >>> waarnemingspunt(monster)

5. Data-analyse - temperatuurhelling, elastische fixed-window scans (EFWS)

  1. Gebruik een procedure vergelijkbaar met sectie 4 om de temperatuurhellinggegevens te normaliseren door het signaal bij de laagste temperatuur (meestal 10 K):
    >>> van nPDyn.dataParsers importeren IN16B_FWS

    >>> monster = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). proces()

    # normalisatie met de 5 eerste punten op het waarneembare
    # as, die overeenkomt met de temperatuur
    >>> steekproef /= steekproef[:5].gemiddelde(0)

    # Het hier gebruikte Momentum Transfer Q-bereik is kleiner
    # omdat het gebruikte model alleen geldig is voor lage q
    >>> steekproef = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Gebruik een eenvoudig Gaussisch model om te beginnen, waarvan de breedte wordt gegeven door de zogenaamde gemiddelde kwadraatverplaatsing (MSD). Bouw en pas het model aan met behulp van de volgende opdrachten:
    >>> Import Numpy als NP
    >>> van nPDyn.models import Parameters, Model, Component

    # a is een schaalfactor
    >>> params = Parameters(
    ... a={'waarde': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Model(params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... "Gaussisch",
    ... Lambda X, A, MSD: A * NP.exp (-x ** 2 * MSD / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Geen])

    >>> waarnemingspunt(monster)
    OPMERKING: De Gaussische benadering geldt altijd voor q2MSD << 1, maar een breder momentumoverdrachtsbereik kan worden gebruikt voor relatieve vergelijking tussen monsters. Meer geavanceerde modellen, die verder gaan dan de Gaussische benadering, zijn ontwikkeld37,38,39.

6. Data-analyse - elastische en inelastische fixed-window scans (E/IFWS)

  1. Net als bij stap 4 importeert u de gegevensset, maar met de klasse 'IN16B_FWS':
    >>> van nPDyn.dataParsers importeren IN16B_FWS

    >>> monster = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). proces()

    >>> steekproef = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Pas de kalibratiegegevens en monstergegevens aan.
    1. Analyseer de E/IFWS-gegevens met behulp van een gegeneraliseerde MSD40 of door ze te beschouwen als grove QENS-spectra (met slechts enkele gegevenspunten op de energieas). Wanneer E/IFWS wordt gezien als grof-QENS, worden modellen die voor QENS worden gebruikt, gebruikt om de hele E/IFWS-dataset in één keer te passen (globale fit van energieoverdrachten en momentumoverdrachten).
      OPMERKING: De laatste oplossing - met behulp van modellen voor QENS op E / IFWS-gegevens - wordt hier gebruikt waar de afhankelijkheid van momentumoverdracht van massacentrumdiffusie en interne eiwitdynamiek worden opgelegd.
    2. Modelleer eiwitdynamica in vloeistoffen met behulp van de volgende Eq (5) ('modelProteinJumpDiff' in nPDyn):
      figure-protocol-4 (5)
      Waarbij R(q,ω) de resolutiefunctie is; β een scalaire onafhankelijke voor elke momentumoverdracht q; een0 is de elastische onsamenhangende structuurfactor (EISF); figure-protocol-5 een Lorentzian die rekening houdt met het massamiddelpuntdiffusie met een breedte gegeven door Eq (6); figure-protocol-6 is een Lorentzian die het centrum van de massadiffusie omvat en een bijdrage volgens het jump-diffusiemodel14 dat rekening houdt met interne dynamiek (Eq (7); figure-protocol-7 zijnde het aangebrachte signaal van D2O opnieuw geschaald door zijn volumefractie in het monster.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds zijnde de zelfdiffusiecoëfficiënt.
      figure-protocol-8 (7)
      Di zijnde de schijnbare diffusiecoëfficiënt voor interne dynamica en τ een relaxatietijd voor diffusieve bewegingen.
      >>> van nPDyn.models.builtins import (
      ... modelPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modelCalibratedD2O,
      ... )

      # ingebouwde modellen gebruiken een kolomvector van het momentum
      # Q-waarden overbrengen
      >>> q = vanadium.q[:, Geen]

      # het vanadium is aangebracht met behulp van een pseudo-Voigt-profiel
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # voor pure D2O, een model met gekalibreerde lijnbreedte
      # voor verschillende temperaturen is inbegrepen in nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Hier wordt vergelijking 3 gebruikt voor vloeistofmonsters
      # convolutie met resolutiefunctie en toevoeging van
      # D2O achtergrond wordt automatisch gedaan met de # verstrekte argumenten
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadium,
      ... bkgd=buffer,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Plot de aangebrachte gegevens met behulp van:
    >>> van nPDyn.plot import plot
    >>> waarnemingspunt(monster)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De aggregatie van lysozym tot deeltjes werd uitgevoerd bij 90 °C met een eiwitconcentratie van 50 mg/ml in een gedeutereerde buffer (0,1 M NaCl bij pD 10,5). De vorming van deeltjes wordt veroorzaakt door de temperatuurstijging tot 90 °C en vindt plaats binnen 6 uur (aanvullende figuur S8). De data-acquisitie werd uitgevoerd op IN16B, zoals beschreven in het bovenstaande protocol (gegevens worden permanent beheerd door de IBL en zijn toegankelijk op http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Neutronenspectroscopie is de enige methode waarmee de ensemblegemiddelde ps-ns-dynamiek van eiwitmonsters kan worden onderzocht, ongeacht de grootte van het eiwit of de complexiteit van de oplossing wanneer deuteratie wordt gebruikt6. Door zelfdiffusie van eiwitassemblages in oplossing te onderzoeken, kan de hydrodynamische grootte van dergelijke assemblages ondubbelzinnig worden bepaald. Niettemin wordt de methode gewoonlijk beperkt door de lage neutronenflux, wat lange acquisitietijden impliceer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn Michaela Zamponi van het Jülich Centre for Neutron Science van het Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Duitsland, dankbaar voor een deel van de neutronenverstrooiingsexperimenten die zijn uitgevoerd op het instrument SPHERES. Dit werk heeft geprofiteerd van de activiteiten van het Deuteration Laboratory (DLAB) consortium gefinancierd door de Europese Unie onder contracten HPRI-2001-50065 en RII3-CT-2003-505925, en van de UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) gefinancierde activiteiten binnen het Institut Laue Langevin EMBL DLAB onder subsidies GR/R99393/01 en EP/C015452/1. Steun van de Europese Commissie in het kader van het 7e kaderprogramma via de kernactiviteit: versterking van de Europese onderzoeksruimte, onderzoeksinfrastructuren wordt erkend [contract 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot en Christian Beck bedanken het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF, subsidienummer 05K19VTB) voor de financiering van hun postdoctorale beurzen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aluminium monsterhouderNiet commercieel verkrijgbaar. Ofwel kan de lokale contactpersoon bij het instrument ze verstrekken of ze kunnen worden vervaardigd op basis van een technische tekening die door de lokale contactpersoon kan worden verstrekt.
Deuteriumchloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atoom % DSigma-Aldrich
543047
Deuteriumoxide (D, 99,9%)EurisotopDLM-4DR-PK
Dow Corning hoogvacuüm siliconenvetSigma-AldrichZ273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph EurSigma-Aldrich1.5901
Glazen droogkastVWR  75871-660
Glazen droogkastplaat, 140 mmVWR89038-068
Indiumdraad, 1,0 mm (0,04 inch) dia, Puratronic, 99,999%Alfa Aesar00470.G1
Lysozym uit gedialyseerd kippeneiwit, gelyofiliseerd, poeder, ~100.000 U/mgSigma-Aldrich62970
nPDynv3.xzie github.com/kpounot/nPDyn, modelfuncties voor fitting ook opgenomen in de software
OHAUS AX324 Adventurer weegschaal, interne kalibratieDutscher92641
Fosforpentaoxide, ReagentPlus, 99%Sigma-Aldrich214701
Pipet ErgoOne 0,5-10 µLStarlabS7100-0510
Pipet ErgoOne 100-1.000 µLStarlabS7100-1000
Pipet ErgoOne 20-200 µLStarlabS7100-2200
Pipettip TipOne 1.000 µLStarlabS1111-6001
Pipettip TipOne 10 µLStarlabS1111-3200
Pipettip TipOne 200 µLStarlabS1111-0206
Natriumdeuteroxideoplossing, 40 wt. % in D2O, 99,5 atoom % DSigma-Aldrich372072

Referenties

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7(2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580(2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490(2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102(2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908(2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015(2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997(2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904(2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

NeutronterugverstrooiingProte nedynamiekQuasi elastische neutronenverstrooiingFixed Window ScansMoleculaire diffusieAmylo de prote nenGedeutereerde bufferCryofurnace
Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.