Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neutronenverstrooiing biedt de mogelijkheid om de dynamiek in monsters te onderzoeken voor een breed scala aan energieën op een niet-destructieve manier en zonder andere etikettering dan deuterium. Met name neutronen-backscatteringsspectroscopie registreert de verstrooiingssignalen onder meerdere verstrooiingshoeken tegelijk en is zeer geschikt om de dynamiek van biologische systemen op de ps-ns-tijdschaal te bestuderen. Door gebruik te maken van D2O- en mogelijk gedeutereerde buffercomponenten - maakt de methode het mogelijk om zowel het centrum van massadiffusie als backbone- en zijketenbewegingen (interne dynamiek) van eiwitten in vloeibare toestand te monitoren.
Bovendien kan hydratatiewaterdynamiek worden bestudeerd door poeders van geperdeutereerde eiwitten gehydrateerd met H2O te gebruiken. Dit artikel presenteert de workflow die wordt gebruikt op het instrument IN16B van het Institut Laue-Langevin (ILL) om de dynamiek van eiwit- en hydratatiewater te onderzoeken. De bereiding van oplossingsmonsters en gehydrateerde eiwitpoedermonsters met behulp van dampuitwisseling wordt uitgelegd. De data-analyseprocedure voor zowel eiwit- als hydratatiewaterdynamica wordt beschreven voor verschillende soorten datasets (quasi-elastische spectra of fixed-window scans) die kunnen worden verkregen op een neutronenbackscattering spectrometer.
De methode wordt geïllustreerd met twee studies met amyloïde eiwitten. De aggregatie van lysozym in bolvormige aggregaten ter grootte van μm - aangeduid met deeltjes - blijkt plaats te vinden in een proces van één stap op het ruimte- en tijdsbereik dat op IN16B wordt onderzocht, terwijl de interne dynamiek ongewijzigd blijft. Verder werd de dynamiek van hydratatiewater van tau bestudeerd op gehydrateerde poeders van geperdeuteerd eiwit. Het is aangetoond dat translationele bewegingen van water worden geactiveerd bij de vorming van amyloïde vezels. Ten slotte worden kritische stappen in het protocol besproken over hoe neutronenverstrooiing is gepositioneerd met betrekking tot de studie van dynamica ten opzichte van andere experimentele biofysische methoden.
Inleiding
Het neutron is een ladingloos en massief deeltje dat in de loop der jaren met succes is gebruikt om monsters te onderzoeken op verschillende gebieden, van fundamentele fysica tot biologie1. Voor biologische toepassingen worden neutronenverstrooiing met een kleine hoek, inelastische neutronenverstrooiing en neutronenkristallografie en reflectometrie op grote schaal gebruikt 2,3,4. Inelastische neutronenverstrooiing biedt een ensemblegemiddelde meting van de dynamiek zonder dat specifieke etikettering per se nodig is, en een signaalkwaliteit die....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid de gedeutereerde buffer voor eiwitten in vloeibare toestand voor
- Los alle componenten van de buffer op in zuiver D2O.
- Als de pH-elektrode is gekalibreerd in H2O, past u de pD aan volgens de formule pD = pH + 0,4 met NaOD of DCl34.
OPMERKING: Het gebruik van D 2 Oin plaats van H2O kan de oplosbaarheid van eiwitten beïnvloeden en de buffercondities moeten mogelijk worden aangepast (bijvoorbeeld door een kleine verandering in de zoutconcentratie).
2. Bereid de H2O-gehydrateerde poeders van geperdeuteerd e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De aggregatie van lysozym tot deeltjes werd uitgevoerd bij 90 °C met een eiwitconcentratie van 50 mg/ml in een gedeutereerde buffer (0,1 M NaCl bij pD 10,5). De vorming van deeltjes wordt veroorzaakt door de temperatuurstijging tot 90 °C en vindt plaats binnen 6 uur (aanvullende figuur S8). De data-acquisitie werd uitgevoerd op IN16B, zoals beschreven in het bovenstaande protocol (gegevens worden permanent beheerd door de IBL en zijn toegankelijk op http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Neutronenspectroscopie is de enige methode waarmee de ensemblegemiddelde ps-ns-dynamiek van eiwitmonsters kan worden onderzocht, ongeacht de grootte van het eiwit of de complexiteit van de oplossing wanneer deuteratie wordt gebruikt6. Door zelfdiffusie van eiwitassemblages in oplossing te onderzoeken, kan de hydrodynamische grootte van dergelijke assemblages ondubbelzinnig worden bepaald. Niettemin wordt de methode gewoonlijk beperkt door de lage neutronenflux, wat lange acquisitietijden impliceer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn Michaela Zamponi van het Jülich Centre for Neutron Science van het Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Duitsland, dankbaar voor een deel van de neutronenverstrooiingsexperimenten die zijn uitgevoerd op het instrument SPHERES. Dit werk heeft geprofiteerd van de activiteiten van het Deuteration Laboratory (DLAB) consortium gefinancierd door de Europese Unie onder contracten HPRI-2001-50065 en RII3-CT-2003-505925, en van de UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) gefinancierde activiteiten binnen het Institut Laue Langevin EMBL DLAB onder subsidies GR/R99393/01 en EP/C015452/1. Steun van de Europese Commissie in het kader van het....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aluminium monsterhouder | Niet commercieel verkrijgbaar. Ofwel kan de lokale contactpersoon bij het instrument ze verstrekken of ze kunnen worden vervaardigd op basis van een technische tekening die door de lokale contactpersoon kan worden verstrekt. | ||
| Deuteriumchloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atoom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
| Deuteriumoxide (D, 99,9%) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning hoogvacuüm siliconenvet | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| Glazen droogkast | VWR | 75871-660 | |
| Glazen droogkastplaat, 140 mm | VWR | 89038-068 | |
| Indiumdraad, 1,0 mm (0,04 inch) dia, Puratronic, 99,999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| Lysozym uit gedialyseerd kippeneiwit, gelyofiliseerd, poeder, ~100.000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | zie github.com/kpounot/nPDyn, modelfuncties voor fitting ook opgenomen in de software | |
| OHAUS AX324 Adventurer weegschaal, interne kalibratie | Dutscher | 92641 | |
| Fosforpentaoxide, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipet ErgoOne 0,5-10 µL | Starlab | S7100-0510 | |
| Pipet ErgoOne 100-1.000 µL | Starlab | S7100-1000 | |
| Pipet ErgoOne 20-200 µL | Starlab | S7100-2200 | |
| Pipettip TipOne 1.000 µL | Starlab | S1111-6001 | |
| Pipettip TipOne 10 µL | Starlab | S1111-3200 | |
| Pipettip TipOne 200 µL | Starlab | S1111-0206 | |
| Natriumdeuteroxideoplossing, 40 wt. % in D2O, 99,5 atoom % D | Sigma-Aldrich | 372072 |
Referenties
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
