Methodenartikel

Beoordeling van de mechanische gevoeligheid van de rug bij de rat voor mechanistisch onderzoek naar chronische rugpijn

DOI:

10.3791/63667

⸱

30 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Université du Québec à Trois-Rivières, 2CogNAC Research Group, Université du Québec à Trois-Rivières, 3Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om nieuwe therapeutische interventies te ontwikkelen voor de preventie en het beheer van rugpijn, zijn diermodellen nodig om de mechanismen en effectiviteit van deze therapieën vanuit een translationeel perspectief te onderzoeken. Het huidige protocol beschrijft de BMS-test, een gestandaardiseerde methode om de mechanische gevoeligheid van de rug bij de rat te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lage rugpijn is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van invaliditeit, met dramatische persoonlijke, economische en sociale gevolgen. Om nieuwe therapieën te ontwikkelen, zijn diermodellen nodig om de mechanismen en effectiviteit van nieuwe therapieën vanuit een translationeel perspectief te onderzoeken. Verschillende knaagdiermodellen van rugpijn worden gebruikt in lopende onderzoeken. Verrassend genoeg werd er echter geen gestandaardiseerde gedragstest gevalideerd om de mechanische gevoeligheid in rugpijnmodellen te beoordelen. Dit is van cruciaal belang om te bevestigen dat dieren met veronderstelde rugpijn lokale overgevoeligheid voor nociceptieve stimuli vertonen en om de gevoeligheid te controleren tijdens interventies die zijn ontworpen om rugpijn te verlichten. Het doel van deze studie is om een eenvoudige en toegankelijke test te leggen om de mechanische gevoeligheid in de rug van ratten te beoordelen. Speciaal voor deze methode is een testkooi vervaardigd; lengte x breedte x hoogte: 50 x 20 x 7 cm, met een roestvrijstalen gaas aan de bovenkant. Deze testkooi maakt het mogelijk om mechanische stimuli aan de achterkant toe te passen. Om de test uit te voeren, wordt de achterkant van het dier geschoren in het gebied van belang en wordt het testgebied gemarkeerd om de test op verschillende dagen te herhalen, indien nodig. De mechanische drempel wordt bepaald met Von Frey-filamenten aangebracht op de paraspinale spieren, met behulp van de eerder beschreven up-down-methode. De positieve reacties omvatten (1) spiertrekkingen, (2) boogvorming (rugverlenging), (3) rotatie van de nek (4) krabben of likken aan de rug en (5) ontsnappen. Deze gedragstest (Back Mechanical Sensitivity (BMS) test) is nuttig voor mechanistisch onderzoek met knaagdiermodellen van rugpijn voor de ontwikkeling van therapeutische interventies voor de preventie en behandeling van rugpijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lage rugpijn (LBP) is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van invaliditeit, die dramatische persoonlijke, economische en sociale gevolgen heeft 1,2,3,4. Elk jaar wordt ongeveer 37% van de bevolking getroffen door LBP5. LBP verdwijnt meestal binnen een paar weken, maar komt terug bij 24% -33% van de individuen en wordt chronisch in 5% -10% van de gevallen2. Om de mechanismen en effecten van LBP en de effecten van verschillende therapeutische interventies te begrijpen, zijn verschillende diermodellen van LBP gebruikt, die klinische aandoeningen of sommige componenten van LBP6 nabootsen. Deze muis- en rattenmodellen kunnen worden ingedeeld in een of meer van de volgende categorieën: (1) discogene LBP7,8,, (2) radiculaire LBP 8,9,10,11, (3) facetgewrichtartrose 12 en (4) spiergeïnduceerde LBP13,14 . Omdat de pijn niet direct kan worden gemeten bij niet-menselijke soorten, zijn er talloze tests ontwikkeld om pijnachtig gedrag in deze modellen te kwantificeren8. Deze tests beoordelen gedrag dat wordt opgeroepen door een schadelijke stimulus (mechanische kracht 15,16,17, thermische stimulatie 18,19,20,21,22,23,24,25) of spontaan geproduceerd 26,27,28,29.

De methoden met mechanische stimuli omvatten de Von Frey-test 15,16 en de Randall-Selitto-test17. Methoden met behulp van warmtestimuli omvatten de staartfliktest18, hete plaattest19, Hargreaves-test20 en thermische sondetest21. Methoden met koude stimuli omvatten de koude plaattest22, acetonverdampingstest 23 en koude plantaire test24. Methoden voor spontaan gedrag omvatten de grimasschalen 26, graven27, gewichtdragende en loopanalyse 28, evenals een geautomatiseerde gedragsanalyse29. Ondanks deze talrijke beschikbare tests, is geen van hen specifiek ontworpen voor rugpijnmodellen.

Het doel van deze studie is om een eenvoudige en toegankelijke test te leggen om de mechanische gevoeligheid in de rug van ratten te beoordelen. De techniek is grotendeels gebaseerd op de Von Frey-test toegepast op het plantaire oppervlak van de achterpoot15,16. Het basisprincipe van de Von Frey-test is om een reeks monofilamenten te gebruiken voor het gebied van belang, waarbij constante vooraf bepaalde krachten worden geleverd. Een reactie wordt als positief beschouwd als de rat een nocifensief gedrag vertoont. De mechanische drempel kan dan worden berekend op basis van de filamenten die reacties oproepen. In de huidige studie wordt een eenvoudige en toegankelijke methode aangeboden die is aangepast aan de Von Frey-test om de mechanische gevoeligheid in de rug van ratten te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de dierverzorgingscommissie van de Université du Québec à Trois-Rivières en voldeed aan de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en de richtlijnen van de Committee for Research and Ethical Issues van de International Association for the Study of Pain (IASP). De huidige studie gebruikte zes mannelijke Wistar-ratten (lichaamsgewicht: 320-450 g; leeftijd: 18-22 weken). De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen). Gegevens van deze ratten zijn afkomstig uit de grotere steekproef van een eerdere studie30.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Plaats de dieren in een temperatuurgecontroleerde ruimte in standaard dierenfaciliteiten met toegang tot voedsel en water ad libitum en een licht-donkercyclus van 14 h-10 h. Zorg ervoor dat alle dieren in goede gezondheid zijn op de dag van de experimenten.
  2. Genereer het diermodel voor chronische rugpijn volgens de onderstaande stappen.
    1. Om chronische rugpijn te veroorzaken, voert u een intramusculaire injectie van Complete Freund Adjuvant (CFA) in de rugspieren uit na de vorige rapporten 14,30,31.
    2. Verdoof het dier met isofluraan (4% voor inductie en 2% -2,5% voor onderhoud).
    3. Injecteer met een naald van 27 G 150 μL van een kant-en-klare water-in-olie-emulsie van CFA (zie materiaaltabel) eenzijdig of bilateraal in de paraspinale spieren, afhankelijk van de protocolbehoeften.
    4. Houd de injectienaald ten minste 3 minuten na het voltooien van de injectie op zijn plaats. Gebruik voor dieren in de controlegroep dezelfde procedures30, maar injecteer een oplossing van steriele fysiologische zoutoplossing (150 μl, 0,9%) in plaats van CFA.
  3. Fabriceer de testkooi.
    1. Maak een testkooi voor twee dieren die bestaat uit één kamer voor elk dier.
      OPMERKING: Voor dit onderzoek heeft elke kamer de volgende afmetingen: lengte x breedte x hoogte: 50 x 20 x 7 cm (zie materiaaltabel).
    2. Monteer de twee aaneengesloten kamers op vier 33 cm lange plexiglas poten. Gebruik transparant plexiglas voor de wanden van de kamers, maar gebruik zwart plexiglas om kamers te scheiden om te voorkomen dat dieren elkaar zien.
    3. Gebruik roestvrijstalen gaas van 1 mm draad met een interdraadafstand van 8 mm om de vloer en het plafond van de testkooi te maken (figuur 1).

2. Mechanische gevoeligheidstest (BMS)

  1. Maak het dier vertrouwd met de testkooi 30 min/dag gedurende 5-7 opeenvolgende dagen voorafgaand aan de eerste test. Herhaal de test indien nodig.
  2. Verdoof de dieren met 2% isofluraan31 (zie materiaaltabel).
  3. Scheer in buikligging onder isofluraananesthesie het rughaar van het interessegebied (van T6 tot L6 wervelniveaus) met behulp van een trimmer voor dierenhaar (zie materiaaltabel). Voor herhaalde maatregelen, scheer het rughaar om de 3 dagen op een dag zonder gedragsbeoordeling om ervoor te zorgen dat stimuli altijd rechtstreeks op de huid worden aangebracht. Teken een zwarte markering op de huid met een permanente marker om ervoor te zorgen dat filamenten altijd op hetzelfde gebied worden aangebracht wanneer de test op verschillende dagen wordt herhaald.
  4. Zet de dieren op de testdag 15-30 minuten voorafgaand aan de test in de testkooi totdat het dier rustig is.
  5. Breng tijdens de test Von Frey-filamenten (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 en 26 g) loodrecht op de rug aan, altijd beginnend met de gloeidraad van 2 g en met behulp van de up-down methode15 (zie materiaaltabel). Benader de achterkant van het dier langzaam met de gloeidraad van achter het dier.
    1. Breng het filament alleen aan als het dier wakker is, op zijn vier poten staat en niet beweegt. Breng de gloeidraad gedurende 2 s bilateraal aan op het interessegebied, 10 mm van het processus spinosus (figuur 2), om de 15-30 s.
      OPMERKING: Een reactie wordt als positief beschouwd als het dier een of meer van de volgende gedragingen vertoont tijdens of onmiddellijk nadat de gloeidraad is aangebracht: (1) spiertrekkingen, (2) boogvorming (rugverlenging), (3) rotatie van de nek om naar de rug te kijken, (4) krabben of likken aan de rug en (5) ontsnappen.
  6. Zoals eerder beschreven15, als er geen respons wordt waargenomen bij het aanbrengen van een filament, breng dan de volgende gloeidraad aan met een hogere kracht in de serie. Als een reactie wordt waargenomen, gebruik dan de volgende gloeidraad met een lagere kracht in de serie. Ga door met deze procedure totdat vier metingen zijn verkregen na de eerste gedragsverandering (respons na een reeks "geen respons" of geen reactie na een reeks "respons").
  7. Zodra de gegevensverzameling is voltooid, berekent u de waarde die 50% van de mechanische drempel vertegenwoordigt, zoals beschreven door Chaplan et al.15, met behulp van deze formule:
    Drempel van 50% (g) = 10(Xf+kδ)/10 000
    OPMERKING: In deze formule is "Xf" het handvatteken van het laatste von Frey-filament dat werd gebruikt. "k" is de tabelwaarde op basis van het reactiepatroon van het dier15, en "δ" is het gemiddelde van de stappen van Handle Mark tussen von frey-filamenten. Afhankelijk van het experimentele ontwerp en de experimentele behoeften, kan slechts één kant van de wervelkolom worden beoordeeld om één drempel te rapporteren, of twee zijden kunnen worden geëvalueerd en drempels worden afzonderlijk of als een gemiddelde gerapporteerd. Zie aanvullende tabel 1 voor het berekeningsmodel32.

3. Terugwinning van dieren

  1. Nadat de intramusculaire injectie is voltooid, stopt u met anesthesie en plaatst u het dier alleen in een standaard huisvestingskooi voor herstel.
  2. Onderzoek tijdens de herstelperiode het gedrag van het dier en laat het niet onbeheerd achter.
  3. Bevestig dat het dier herstelt van anesthesie en normaal beweegt binnen 5 minuten. Breng het dier vervolgens terug naar zijn gebruikelijke huisvestingskooi met de andere dieren.
    OPMERKING: Aan het einde van het experiment wordt het dier door het hart geperfuseerd met een 10% formaline-oplossing, onder diepe isofluraananesthesie (5%). De rugspieren in het geïnjecteerde gebied worden vervolgens geëxtraheerd voor histologie en bevestiging van inflammatoire veranderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode werd gebruikt in een eerdere studie, waarin volledige gegevens en statistieken werden gepresenteerd om de mechanische gevoeligheid tussen CFA en controleratten te vergelijken30. Representatieve individuele gegevens (gemiddelde van linker- en rechterdrempels) van zes ratten die in het vorige onderzoek zijn opgenomen, zijn weergegeven in figuur 3 en tabel 1. Bij baseline was de mechanische gevoeligheid vergelijkbaar tussen de groepen. Intramu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen
De BMS-test is een eenvoudige methode om de mechanische gevoeligheid in de rug van ratten te beoordelen, hetzij op één tijdstip of herhaaldelijk gedurende dagen of weken, wanneer veranderingen worden verwacht (pijnmodellen) of na farmacologische of niet-farmacologische interventie. Kritieke problemen van de methode zijn de testkooi, waarvan de afmetingen ervoor moeten zorgen dat de rat comfortabel is, maar niet te veel beweegt. De rug van het dier moet toegankelijk blijven via het gaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen of relaties te hebben die tot belangenconflicten kunnen leiden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Fondation Chiropratique du Québec en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (MP: grant #06659). De bijdrage van HK werd ondersteund door de Université du Québec à Trois-Rivières (PAIR-programma). De bijdrage van BP werd ondersteund door het Fonds de recherche du Québec en Santé (FRQS) en de Fondation Chiropratique du Québec. De bijdrage van TP werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De bijdrage van NE en EK werd ondersteund door de Fondation Chiropratique du Québec. De bijdrage van MP werd ondersteund door de FRQS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use OnlyBaxterNDC 10019-773-60Inhalatieanestheticum ; DIN 02225875, voor het induceren van anasthesie
Complete Freund Adjuvant (CFA)Fisher Scientific#77140Water-in-olie emulsie van Complete Freund Adjuvant (CFA) met gedode cellen van Mycobacterium butyricum.
Male Wistar RatsCharles River Laboratorieslichaamsgewicht: 320–450 g; leeftijd: 18-22 weken.
Penlon Sigma Delta VerdamperPenlon990-VI5K-SVEEKPenlon Sigma Delta Verdamper gebruikt voor anasthesie
Sharpie Permanent MarkerSharpieBC23636Permanente stift, fijne punt, zwart
TestkooiOp maat gemaaktBreedte: 20 cm; Lengte: 50 cm; Hoogte van de bodem tot de bovenkant: 40 cm; Hoogte van de bodem mesh tot de bovenkant van de kooi: 7 cm; Wanddikte: 5 mm; Mesh: 1 mm draad met een 8 mm draadafstand   
Von Frey FilamentsAesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator514000-20CFilamenten van 0,07 g tot 26 g
Wahl Professional Animal, ARCO snoerloze Huisdier Clipper, Trimmer Grooming WahlKit #8786-1201Dierlijke haarkapper, voor scheerdoeleinden, nul blad 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartvigsen, J., et al. What low back pain is and why we need to pay attention. Lancet. 391 (10137), 2356-2367 (2018).
  2. Manchikanti, L., Singh, V., Falco, F. J., Benyamin, R. M., Hirsch, J. A. Epidemiology of low back pain in adults. Neuromodulation. 17, Suppl 2 3-10 (2014).
  3. Urits, I., et al. Low back pain, a comprehensive review: Pathophysiology, diagnosis, and treatment. Current Pain and Headache Reports. 23 (3), 23(2019).
  4. James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  5. Hoy, D., et al. A systematic review of the global prevalence of low back pain. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 2028-2037 (2012).
  6. Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research. 36 (5), 1305-1312 (2018).
  7. Olmarker, K. Puncture of a lumbar intervertebral disc induces changes in spontaneous pain behavior: An experimental study in rats. Spine. 33 (8), 850-855 (2008).
  8. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
  9. Kawakami, M., et al. Pathomechanism of pain-related behavior produced by allografts of intervertebral disc in the rat. Spine. 21 (18), 2101-2107 (1996).
  10. Hu, S. -J., Xing, J. -L. An experimental model for chronic compression of dorsal root ganglion produced by intervertebral foramen stenosis in the rat. Pain. 77 (1), 15-23 (1998).
  11. Xie, W. R., et al. Robust increase of cutaneous sensitivity, cytokine production and sympathetic sprouting in rats with localized inflammatory irritation of the spinal ganglia. Neuroscience. 142 (3), 809-822 (2006).
  12. Arthritis and Rheumatism. Characterization of a new animal model for evaluation and treatment of back pain due to lumbar facet joint osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 63 (10), 2966-2973 (2011).
  13. Kobayashi, Y., Sekiguchi, M., Konno, S. -I., Kikuchi, S. -I. Increased intramuscular pressure in lumbar paraspinal muscles and low back pain: Model development and expression of substance P in the dorsal root ganglion. Spine. 35 (15), 1423-1428 (2010).
  14. Touj, S., et al. Sympathetic regulation and anterior cingulate cortex volume are altered in a rat model of chronic back pain. Neuroscience. 352, 9-18 (2017).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Deuis, J. R., et al. Analgesic effects of clinically used compounds in novel mouse models of polyneuropathy induced by oxaliplatin and cisplatin. Neuro-Oncology. 16 (10), 1324-1332 (2014).
  17. Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
  18. D'Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 72 (1), 74-79 (1941).
  19. Woolfe, G. The evaluation of the analgesic actions of pethidine hydrochlodide (Demerol). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 80 (3), 300-307 (1944).
  20. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  21. Deuis, J. R., Vetter, I. The thermal probe test: A novel behavioral assay to quantify thermal paw withdrawal thresholds in mice. Temperature. 3 (2), 199-207 (2016).
  22. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular Pain. 1, 36(2005).
  23. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56 (2), 155-166 (1994).
  24. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. I. V. A novel behavioral assay for measuring cold sensation in mice. PLoS One. 7 (6), 39765(2012).
  25. Moqrich, A., et al. Impaired thermosensation in mice lacking TRPV3, a heat and camphor sensor in the skin. Science. 307 (5714), 1468-1472 (2005).
  26. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  27. Deacon, R. M. J. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nature Protocols. 1 (1), 118-121 (2006).
  28. Griffioen, M. A., et al. Evaluation of dynamic weight bearing for measuring nonevoked inflammatory hyperalgesia in mice. Nursing Research. 64 (2), 81-87 (2015).
  29. Brodkin, J., et al. Validation and implementation of a novel high-throughput behavioral phenotyping instrument for mice. Journal of Neuroscience Methods. 224, 48-57 (2014).
  30. Paquette, T., Eskandari, N., Leblond, H., Piché, M. Spinal neurovascular coupling is preserved despite time dependent alterations of spinal cord blood flow responses in a rat model of chronic back pain: implications for functional spinal cord imaging. Pain. , (2022).
  31. Tokunaga, R., et al. Attenuation of widespread hypersensitivity to noxious mechanical stimuli by inhibition of GABAergic neurons of the right amygdala in a rat model of chronic back pain. European Journal of Pain. 26 (4), 911-928 (2022).
  32. Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RattenpijnmodelVon Frey testparaspinale spierengedragstestencompleet adjuvans van Freundmechanische hypersensitiviteitdierlijke pijnmodellen

Gerelateerde artikelen