Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Samenvatting

Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie om de thermodynamica van Cu (II) binding aan peptiden en eiwitten te onderzoeken en te kwantificeren.

Samenvatting

Koper (II) is een essentieel metaal in biologische systemen en verleent unieke chemische eigenschappen aan de biomoleculen waarmee het interageert. Er is gemeld dat het zich direct bindt aan een verscheidenheid aan peptiden en zowel noodzakelijke als pathologische rollen speelt, variërend van de bemiddelende structuur tot elektronenoverdrachtseigenschappen tot het geven van katalytische functie. Het kwantificeren van de bindingsaffiniteit en thermodynamica van deze Cu(II)-peptidecomplexen in vitro geeft inzicht in de thermodynamische drijvende kracht van binding, potentiële competities tussen verschillende metaalionen voor het peptide of tussen verschillende peptiden voor Cu(II), en de prevalentie van het Cu(II)-peptidecomplex in vivo. Het kwantificeren van de bindende thermodynamica kan echter een uitdaging zijn vanwege een groot aantal factoren, waaronder het verantwoorden van alle concurrerende evenwichten binnen een titratie-experiment, vooral in gevallen waarin er een gebrek is aan discrete spectroscopische handgrepen die het peptide, het d-blokmetaalion en hun interacties vertegenwoordigen.

Hier wordt een robuuste reeks experimenten geleverd voor de nauwkeurige kwantificering van Cu (II) -peptide thermodynamica. Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie in de aan- en afwezigheid van chromofoor liganden om de benodigde spectroscopische handgreep op Cu(II) te bieden en het gebruik van labelvrije isothermische titratiecalorimetrie. In beide experimentele technieken wordt een proces beschreven om rekening te houden met alle concurrerende evenwichten. Hoewel de focus van dit artikel ligt op Cu (II), kan de beschreven reeks experimenten van toepassing zijn buiten Cu (II) -peptide-interacties en een kader bieden voor nauwkeurige kwantificering van andere metaalpeptidesystemen onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Inleiding

De biologie is geëvolueerd om gebruik te maken van de diverse chemie van metaalionen die nodig zijn voor het leven om zich aan te passen en te overleven in de omgeving. Naar schatting 25%-50% van de eiwitten gebruikt metaalionen voor structuur en functie¹. De specifieke rol en redoxtoestand van het metaalion is direct gerelateerd aan de samenstelling en geometrie van de biologische liganden die het coördineren. Bovendien moeten redox-actieve metaalionen zoals Cu (II) strak worden gereguleerd, zodat ze niet interageren met oxidatiemiddelen via Fenton-achtige chemie om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te vormen ^2,3,4. Het begrijpen van de bindingsmodi en affiniteit die de biochemie aansturen, zou moeten helpen de biologische rol van het metaalion op te helderen.

Veel technieken worden gebruikt om de bindingsinteracties van metalen en peptiden te bestuderen. Dit zijn meestal spectroscopische technieken, maar omvatten ook computersimulaties met behulp van moleculaire dynamica, zoals gezien door Cu(II) interacties met een fragment van amyloïde bèta (Aβ)⁵. Een veelgebruikte spectroscopische techniek die voor veel universiteiten toegankelijk is, is kernspinresonantie (NMR). Door gebruik te maken van de paramagnetische aard van Cu(II) konden Gaggelli et al. aantonen waar het metaalion zich bindt aan een petide door ontspanning van nabijgelegen kernen⁶. Elektron paramagnetische resonantie (EPR) kan ook worden gebruikt om de locatie en modus van de paramagnetische metaalionbinding^{te onderzoeken 7}. Andere spectroscopische technieken zoals circulair dichroïsme (CD) kunnen de coördinatie over Cu(II) in systemen zoals tripeptidesystemen⁸ beschrijven, en massaspectrometrie kan stoichiometrie aantonen en op welke residuen het metaalion wordt gecoördineerd door fragmentatiepatronen ^9,10.

Sommige van deze technieken, zoals NMR, zijn labelvrij, maar vereisen grote concentraties peptide, wat uitdagingen vormt voor studie. Een andere veel voorkomende techniek genaamd fluorescentiespectroscopie is gebruikt om de positie van een tyrosine of tryptofaan te relateren aan het blussen van een Cu (II) ^11,12. Evenzo kan deze techniek structurele veranderingen vertonen als gevolg van Cu(II)-binding¹³. Uitdagingen met deze metaal-peptidebindingsstudies zijn echter dat ze chromofoor aminozuren zoals tyrosine onderzoeken die niet alle systemen hebben, dat het metaalion bindt onder een klassiek model en dat de techniek mogelijk niet bevorderlijk is onder fysiologische omstandigheden. Er zijn inderdaad verschillende peptiden in opkomst die dergelijke chromofoor aminozuren niet bevatten of binden onder klassieke modellen, waardoor het gebruik van deze technieken wordt uitgesloten^14,15. Dit artikel beschrijft benaderingen voor het beoordelen van bindende eigenschappen in deze scenario's onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Biologische liganden kunnen verschillende protonatietoestanden aannemen die de metaalionbinding kunnen beïnvloeden, zoals de imidazoolring op histidine. Als de pH niet consistent wordt gehandhaafd, kunnen de resultaten ingewikkeld of tegenstrijdig zijn. Om deze reden zijn buffers een essentieel onderdeel in de studie van metaal-eiwit/peptide interacties. Van veel buffers is echter aangetoond dat ze gunstig interageren met metaalionen^16,17. Naast het concurreren met het biologische molecuul van belang, kan de buffer vergelijkbare coördinerende atomen hebben die moeilijk te onderscheiden zijn van de coördinerende atomen van het peptide of eiwit. In deze studie ligt de focus op elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie (ITC) als twee complementaire technieken voor het bestuderen van Cu(II)-peptide-interacties, met speciale overwegingen met betrekking tot bufferkeuze.

Elektronische absorptiespectroscopie is een snelle, breed toegankelijke techniek voor het bestuderen van metaalbindingsinteracties. Bestraling met licht in de ultraviolette (UV) of zichtbare golflengten kan leiden tot absorptie van metaalgecentreerde d-d-banden, die waardevolle informatie opleveren over ligandclassificatie, metaalgeometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten^18,19. Voor deze complexen kunnen directe titraties van metaalionen in eiwit- of peptideoplossingen bindende stoichiometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten kwantificeren. In sommige gevallen, zoals d⁵ of d¹⁰ elektronenconfiguraties, absorbeert het complex geen licht (d.w.z. is spectroscopisch stil). In deze spectroscopisch stille overgangsmetaalcomplexen kunnen deze beperkingen worden omzeild door een concurrerend ligand te gebruiken dat, bij coördinatie met het metaalion, detecteerbare ladingsoverdrachtsbanden oplevert. In beide gevallen is deze benadering beperkt tot het kwantificeren van alleen stoichiometrie en schijnbare bindingsaffiniteit, en wordt er geen inzicht in bindingsenthalpie gegeven zonder benaderingen.

Als aanvulling op informatie verkregen uit elektronische absorptiespectroscopie, is ITC een aantrekkelijke techniek voor directe en rigoureuze kwantificering van de bindende enthalpie²⁰. ITC meet direct de warmte die vrijkomt of wordt verbruikt tijdens een bindingsgebeurtenis en aangezien de titratie plaatsvindt bij constante druk, is de gemeten warmte de enthalpie van alle evenwichten (ΔH_ITC). Daarnaast worden de stoichiometrie van de bindingsgebeurtenis (n) en de schijnbare bindingsaffiniteit (K_ITC) gekwantificeerd. Uit deze parameters worden de vrije energie (ΔG_ITC) en entropie (ΔS_ITC) bepaald, waardoor een thermodynamische momentopname van de bindingsgebeurtenis ontstaat. Omdat het niet afhankelijk is van lichtabsorptie, is ITC een ideale techniek voor spectroscopisch stille soorten, bijvoorbeeld d⁵ of d¹⁰ metaalionencomplexen. Aangezien calorimetrie echter warmte meet, kunnen niet-overeenkomende buffersystemen en niet-geregistreerde evenwichten de analyse nadelig beïnvloeden om de metaalionenbindende thermodynamica nauwkeurig te bepalen, en er moet grote zorg worden besteed aan het aanpakken van deze factoren²⁰. Indien uitgevoerd met de juiste striktheid, is ITC een robuuste techniek voor het bepalen van de thermodynamica van metaal-eiwit / peptidecomplexen.

Hier wordt een chromoforisch stil koperbindend peptide, C-peptide, gebruikt om het complementaire gebruik van de twee technieken te demonstreren. C-peptide is een 31 residu splitsingsproduct (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) gevormd tijdens insulinerijping; het mist chromofore residuen, maar het is aangetoond dat het Cu(II) bindt met fysiologisch relevante affiniteit ^14,15. De Cu(II)-bindingsplaats bestaat uit de zijketens van een glutamaat en een aspartaat en de N-terminus van het peptide^14,15. Deze coördinerende atomen lijken sterk op die van veel gebruikte gebufferde systemen. Hier wordt het tandemgebruik van de d-d- en ladingsoverdrachtsbanden in elektronische absorptiespectroscopie en ITC getoond bij het kwantificeren van de Cu (II) bindende thermodynamica aan C-peptide. De benadering van het bestuderen van Cu (II) binding aan C-peptide kan worden toegepast op andere metaalionen en eiwit / peptide systemen.

Protocol

1. Elektronische absorptiespectroscopie: directe titratie met bufferconcurrentie

1. Monstervoorbereiding
   1. Bereid een gebufferde oplossing van 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propaan-1,3-diol (bisTris) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit en daaropvolgende filtratie.
   2. Los een bekende hoeveelheid van het peptide op of verdun het in de metaalvrije buffer.
      OPMERKING: Bij het monitoren van d-d-banden met kleine extinctiecoëfficiënten²¹ moeten hogere concentraties peptide worden gebruikt. Hier was de uiteindelijke concentratie van C-peptide in gebufferde oplossing 300 μM (volume hangt af van de grootte van het cuvet). C-peptide werd gesynthetiseerd door vaste-fase peptide synthese en is elders in de literatuur beschreven¹⁴.
   3. Los een bekende massa CuCl₂ op in ultrapuur water om een oplossing te maken op 10-15 mM.
      OPMERKING: Het is belangrijk om het metaalzout in eerste instantie op te lossen in niet-gebufferd water om neerslag te voorkomen. Andere Cu(II)-zouten kunnen worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat het anion zwak coördineert.
2. Het experiment uitvoeren
   1. Schakel de elektronische absorptiespectrofotometer in en laat deze voor gebruik ~15-20 min opwarmen. Start de spectrofotometersoftware en configureer de parameters zoals scanbereik (200-900 nm), scansnelheid (200 nm / s) en dubbele bundel baseline-gecorrigeerd (meer parameters worden vermeld in het aanvullende bestand).
   2. Verzamel een basislijn zonder cuvetten of monsters in de bundelpaden.
   3. Gebruik twee overeenkomende cuvetten in de dubbelstraalspectrofotometer en laad één cuvette met 115 μL ultrapuur water en de andere cuvette met 115 μL van het peptidemonster. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de cuvetten zitten, omdat deze het signaal zullen verstoren.
   4. Plaats de cuvette met ultrapuur water in de referentiestraal en de cuvette met peptide in de monsterbundel.
   5. Verzamel het absorptiespectrum van het metaalvrije (apo) peptide.
   6. Voeg een sub-stoichiometrische hoeveelheid (0,5 equivalenten, 150 μM) van de Cu(II)-oplossing toe aan het cuvette met het peptidemonster. Zorg ervoor dat het volume cu(II) toegevoegd minder dan 3 μl is en noteer het volume voor analyse later.
   7. Pipetteer voorzichtig op en neer om de oplossing te mengen en vermijd het genereren van luchtbellen. Laat de oplossing reageren en balanceren gedurende 5 minuten en noteer het absorptiespectrum.
   8. Herhaal de toevoeging van Cu(II)-aliquots zoals in stap 1.2.6 in de peptideoplossing voor de volgende equivalenten: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 en 5,0 (of een totaal van 300, 450, 600, 900 en 1.500 μM). Zorg ervoor dat u het totale volume van cu(II) toegevoegd en het totale volume van de cuvette noteert.
      OPMERKING: Als er meer resolutie gewenst is, verkleint u de afstand tussen equivalenten.
   9. Verwijder de monstercuvette en reinig grondig volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
   10. Voeg de gebufferde oplossing zonder peptide toe en noteer het absorptiespectrum. Herhaal de toevoeging van Cu(II)-aliquots zoals in stap 1.2.5-1.2.8, waarbij het absorptiespectrum voor elk Cu(II)-equivalent wordt geregistreerd.
   11. Exporteer alle spectra als csv-bestanden voor verwerking. Reinig de cuvetten grondig volgens de instructies van de fabrikant en schakel de spectrofotometer in.
3. Verwerking van de gegevens
   1. Laad alle spectra op een spreadsheetprogramma.
   2. Trek het buffer-only (0 μM Cu(II)) spectrum af van elk ander spectrum om eventuele absorptiekenmerken uit de buffer zelf te verwijderen.
   3. Normaliseer elk spectrum om rekening te houden met de verdunning als gevolg van de toevoeging van de Cu(II)-oplossing (stap 1.2.6). Zie het aanvullend bestand, Eq (1)¹⁴ voor een voorbeeld van de normalisatie waarbij v_initieel het volume (115 μL) van het aan de cuvette toegevoegde peptide is, v_Cu(II) het volume Cu(II)-oplossing is dat in stap 1.2.6 is toegevoegd, en_{Abs-bufferafgetrokken spectrum} de gegevens zijn die zijn verkregen in stap 1.2.7.
   4. Maak alle spectra samen om gebieden van verandering te identificeren.
      OPMERKING: Typische d-d-banden van Cu (II) -complexen variëren van 500 tot 750 nm. Deze spectrofotometrische titratie kan een uitdaging zijn vanwege de kleine extinctiecoëfficiënt van d-d-banden, die Laporte-verboden overgangen zijn in octaëdrische geometrie²¹. Als de absorptie te zwak is, is een alternatieve benadering het gebruik van chromofore liganden die resulteren in ladingsoverdrachtsbanden bij binding aan Cu(II) (zie rubriek 2).

2. Elektronische absorptiespectroscopie: peptideconcurrentie met chromofoor ligand

1. Monstervoorbereiding
   1. Los 1,10-fenanthroline (fen) op in ultrapuur water om een uiteindelijke concentratie van ~1 mM te verkrijgen.
   2. Bereid naast de in rubriek 1.1 beschreven monstervoorbereiding voor het peptide (stap 1.1.2) en Cu(II) (stap 1.1.3) een 10 μM Cu(II) en 40 μM fenoplossing in buffer ([Cu(phen)₃]²⁺). Zorg ervoor dat het volume de cuvette vult.
2. Het experiment uitvoeren
   1. Start de elektronische absorptiespectrofotometer zoals in stap 1.2.1 en 1.2.2, maar stel het scanbereik in op 200-400 nm.
   2. Laad in twee gematchte cuvetten één cuvette met 115 μL ultrapuur water en de andere cuvette met 115 μL van de [Cu(phen)₃]²⁺ oplossing. Plaats de cuvette met water in de referentiebalk en de cuvette met [Cu(phen)₃]²⁺ oplossing in de monsterbundel.
   3. Verzamel het absorptiespectrum van het metaal-ligandcomplex.
   4. Voeg een stoichiometrische hoeveelheid (≈1 equivalenten, ≈10 μM) peptide toe aan de [Cu(phen)₃]²⁺ oplossing. Pipetteer voorzichtig op en neer om grondig te mengen, maar pas op dat u geen luchtbellen introduceert. Noteer het volume van het toegevoegde peptide voor toekomstige analyse.
      OPMERKING: Met behulp van cuvetten die 115 μL bevatten, levert het toevoegen van 3,83 μL van 300 μM peptide een uiteindelijke peptideconcentratie van 9,7 μM op.
   5. Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten om een evenwicht te bereiken. Noteer het absorptiespectrum.
      OPMERKING: Als de bindingsaffiniteit van het metaal-peptide en metaal-ligand vergelijkbaar zijn, zal de concentratie van toegevoegd peptide in grote overmaat moeten zijn. Zorg ervoor dat u rekening houdt met het totale volume van het toegevoegde peptide voor normalisatie.
   6. Herhaal de toevoeging van peptide aliquots in de [Cu(phen)₃]²⁺ oplossing voor de volgende geschatte equivalenten: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 en 26. Noteer het volume van het toegevoegde peptide zodat de verdunde concentratie kan worden bepaald.
   7. Verwijder het monster en reinig de cuvette grondig volgens de instructies van de fabrikant. Verzamel een spectrum van de buffer. Verzamel een spectrum van 50 μM peptide in de buffer.
   8. Exporteer alle gegevens als csv-bestanden voor verwerking en reinig de cuvetten volgens de instructies van de fabrikant.
3. Verwerking van de gegevens
   1. Laad de spectra op een spreadsheetprogramma en trek het bufferspectrum af van de andere spectra.
   2. Normaliseer de spectra na Supplemental File, Eq (2)¹⁴.
   3. Gebruik de extinctiecoëfficiënt voor [Cu(phen)₃]²⁺ bij 265 nm (ε_max = 90.000 ^{M-1 cm-1})²², bepaal de concentratie van [Cu(phen)₃]²⁺ bij elke toevoeging van het peptide.
   4. Bepaal voor elke toevoeging van het peptide de concentratie van het Cu(II)-peptidecomplex door de resterende concentratie van [Cu(phen)₃]²⁺, zoals bepaald in stap 2.3.2, af te trekken van de beginconcentratie van [Cu(phen)₃]²⁺ (bij 0 μM peptide).
   5. Bereken de concentratie van vrijphenligand met de vergelijking in Supplemental File, Eq (3)¹⁴.
   6. Bereken de concentratie van vrij peptide met behulp van Supplemental File, Eq (4) ¹⁴, waarbij [peptide] _voorraad het onverdunde peptide vertegenwoordigt dat in het cuvette is getitreerd, V₁ het volume van het toegevoegde voorraadpeptide vertegenwoordigt, V₂ het totale volume van het cuvet en [Cu^{2 +}-peptide] wordt bepaald in stap 2.3.4.
   7. Bereken de experimentele bindingsaffiniteit (K_ex) met behulp van Eq (5) in aanvullend bestand²³.
   8. Relateer de dissociatieconstante van Cu(II)-peptide aan K_ex door Eq (6)²³ in Supplemental File, waarbij K_{d,Cu(II)-phen} = 1,0 × 10-9 (zie ²²). Bepaal de gemiddelde en standaarddeviatie van alle bepaalde dissociatieconstanten.
      OPMERKING: Onder een 4:1 verhouding van fen:Cu(II), [Cu(phen)₃]²⁺, [Cu(phen)₂]²⁺, en [Cu(phen)]²⁺ bestaan in de oplossing, en het peptide zal Cu(II) weg van de soort ([Cu(phen)]²⁺) met de zwakste binding²² chelate.

3. Isotherme titratiecalorimetrie

1. Monstervoorbereiding
   1. Bereid een gebufferde oplossing van 15 mM 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit met daaropvolgende vacuümfiltratie door een membraan van 0,45 μm op fles.
   2. Los een bekende massa CuCl₂ op in ultrapuur water om een oplossing van ≈50-100 mM te bereiden. Verdun deze Cu(II)-oplossing tot buffer om een oplossing van 1,0 ml met een eindconcentratie van 1,4 mM Cu(II) te verkrijgen. Noteer het exacte volume van de gebruikte CuCl_2-oplossing .
   3. Los de peptideoplossing op of verdun deze in buffer om 450 μL van een 154 μM peptide-oplossing te maken. Zorg ervoor dat hetzelfde aandeel extra ultrapuur water uit stap 3.1.2 aan de peptideoplossing wordt toegevoegd, waardoor de verdunningswarmte wordt verminderd en het signaal-naar-ruis toeneemt.
   4. Zorg er na de bereiding van de monsters voor dat de oplossingen op dezelfde pH staan en pas deze indien nodig dienovereenkomstig aan.
   5. Optionele stap: Ontgas de oplossingen om microbubbels te minimaliseren die in de ITC zijn geladen.
2. Het experiment uitvoeren
   1. Schakel de ITC in. Start de ITC-software om het instrument uit te voeren. Wacht op de eerste initialisatie, die zal vragen om de buret opnieuw te huisvesten; volg vervolgens de instructies op het scherm.
   2. Verwijder de klep uit de referentiecel. Verwijder al het water uit de referentiecel en spoel driemaal met 450 μL ontgast ultrapuur water.
   3. Zuig langzaam ultrapuur water op tot de 450 μL-markering van een oplaadspuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit worden gebracht. Steek de doseerspuit in de referentiecel totdat deze ≈1 mm van de bodem is en injecteer langzaam een deel van de oplossing totdat er 150 μL in de doseerspuit achterblijft. Beweeg de zuiger van de laadspuit meerdere keren snel op en neer met ≈25 μL om eventuele bellen op het celoppervlak los te maken. Injecteer langzaam totdat de zuiger de 100 μL-markering op de laadspuit bereikt, waardoor in totaal 350 μL ultrapuur water in de referentiecel wordt afgegeven en vervang het referentieceldeksel.
   4. Verwijder eventuele restoplossing uit de monstercel en laad met 450 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met behulp van een doseerspuit. Laat 10 minuten weken om ervoor te zorgen dat sporenmetaalionen worden verwijderd, omdat de EDTA sporenmetalen bindt.
   5. Verwijder de EDTA-oplossing (met gebonden sporenmetaalionen) en spoel de laadspuit grondig af met grote hoeveelheden ultrapuur water.
   6. Reinig de ITC in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant en spoel de monstercel met ultrapuur water.
   7. Conditioneer de monstercel door ten minste driemaal te spoelen met 450 μL buffer.
   8. Verwijder de buffer die de monstercel conditioneert. Laad de peptide-oplossing in de monstercel met behulp van de oplaadspuit (volg stap 3.2.3).
   9. Spoel de titratiespuit af met 200 μL gebufferde oplossing. Verwijder hiervoor de zuiger en gebruik een micropipette om de buffer door het gat aan de bovenkant van de glazen titratiespuit, door de spuit en uit de naald eronder te pipetteren.
   10. Steek de zuiger volledig in de titratiespuit.
   11. Dompel de punt van de naald van de titratiespuit in de metalen oplossing en trek de zuiger langzaam omhoog, waardoor de metalen oplossing de spuit vult en resulteert in een leeg volume aan de bovenkant van het glazen deel van de titratiespuit. Verwijder het grootste deel van het lege volume door de titratiespuit parallel aan de vloer te draaien, verwijder de zuiger en kantel het glazen deel enigszins naar de vloer. Geef de titratiespuit een zachte shake zodat de oplossing naar het einde van het glazen deel van de titratiespuit beweegt en het grootste deel van het lege volume opvult, maar zorg ervoor dat er 2-3 μL leegtevolume overblijft. Terwijl u de spuit evenwijdig aan de vloer houdt, plaatst u de zuiger opnieuw.
   12. Houd de titratiespuit rechtop, dompel de punt van de naald terug in de metalen oplossing en duw de zuiger naar beneden totdat er geen lucht meer uit de naald komt. Laad de titratiespuit door de zuiger langzaam omhoog te trekken tot net boven de 50 μL-markering terwijl de punt van de naald in de oplossing blijft.
   13. Steek voorzichtig het glazen deel van de titratiespuit in de buret en schroef tot het vingervast is. Wanneer een kleine hoeveelheid oplossing uit de titratiespuit komt als gevolg van compressie van de zuiger, gebruik dan een lichte delicate ruitenwisser om de oplossing zorgvuldig te absorberen zonder de punt van de naald aan te raken.
   14. Steek de buret met titratiespuit in de monstercel en bevestig deze stevig.
   15. Stel de parameters op de ITC-software in. Begin met Instrument Control en stel de roersnelheid in (typische roersnelheden variëren van 150 tot 350 RPM) en de temperatuur waarbij het experiment zal worden uitgevoerd (meestal 25 ° C). Voer de spuit - en celconcentraties in millimolaire eenheden in onder Experimentdetails.
   16. Selecteer in de sectie Experimentmethode de optie Incrementele titratie. Klik op Setup en geef 20 injecties van 2,5 μL op. Als er meer resolutie nodig is om de bindingsgebeurtenis te observeren, verhoogt u het aantal injecties en verlaagt u het volume per injectie. Voer de tijdsafstand tussen elke injectie in, zodat deze lang genoeg is om het signaal in evenwicht te brengen en terug te keren naar de basislijn, meestal 300 s.
   17. Klik op de knop Uitvoeren om het experiment te starten en op te geven waar de gegevens worden opgeslagen.
   18. Na voltooiing van het experiment reinigt u de monstercel en de titratiespuit.
   19. Voer alle experimenten ten minste in drievoud uit om nauwkeurige gegevensverzameling te garanderen.
   20. Voer een controle-experiment uit waarbij de metaaloplossing wordt getitreerd in de gebufferde oplossing (in afwezigheid van peptide) om ervoor te zorgen dat de verdunningswarmte van het metaalion klein is en dat er geen onverklaarde evenwichten zijn. Als de verdunningswarmte groot is, overweeg dan indien mogelijk een ander buffersysteem.
3. Verwerking van de gegevens
   1. Start de ITC-analysesoftware en laad het gegevensbestand voor analyse.
   2. Navigeer naar het tabblad Basislijn en inspecteer het thermogram. Let op alle exogene warmte die is geëvolueerd of geabsorbeerd uit luchtbellen of andere artefacten in het thermogram. Zoek naar spikes die niet te wijten zijn aan injectie van de metalen oplossing.
   3. Zorg ervoor dat de basislijn die door de analysesoftware wordt gegenereerd, het gedeelte van de gegevens na injectie en equilibratie volgt. Als deze afwijkt, gebruikt u basislijndraaipunten om de basislijn aan te passen. Zorg ervoor dat de integratieregio's de piek bevatten die wordt gegenereerd door injectie van het metaal, maar sluit alle luchtbellen of artefacten in het thermogram uit die in stap 2 zijn gevonden. Trek de basislijn af van het thermogram.
      OPMERKING: Dit type manipulatie wordt alleen aanbevolen nadat meerdere thermogrammen zijn verzameld, zodat de experimentator weet wat echte gegevens zijn en wat een artefact is, omdat het aanpassen van de basislijn en integratieregio's de gegevens drastisch kan beïnvloeden.
   4. Navigeer naar het venster Modellering om te beginnen met het aanpassen van de gegevens waarin de analysesoftware de geïntegreerde en concentratiegenormaliseerde gegevens voor elke injectie weergeeft.
   5. Klik met de linkermuisknop op de datum van de eerste injectie om deze uit het aanpassingsalgoritme te verwijderen.
      OPMERKING: Dit komt vaak voor omdat er een kleine menging zal zijn tussen de titrant en de monsterceloplossing, wat leidt tot onnauwkeurige molaire afgifte van de eerste injectie.
   6. Selecteer in de sectie Modellen de optie Leeg (constant) in het vervolgkeuzemenu Stijl, dat is gebaseerd op de uiteindelijke injectie-enthalpie en wordt afgetrokken van elk gegevenspunt, rekening houdend met de verdunningswarmte. Selecteer bovendien Onafhankelijk (of het beste model voor het systeem) in het tweede vervolgkeuzemenu Stijl om de gegevens te passen.
      OPMERKING: Voor standaard 1:1 bindingsinteracties is het meest voorkomende model Onafhankelijk.
   7. Pas de gegevens aan met behulp van de twee modellen door op de groene afspeelknop te drukken met een Σ.
      OPMERKING: Een andere software om ITC-gegevens te verwerken is SEDPHAT²⁴.
   8. Houd rekening met alle concurrerende evenwichten in post-hocanalyse die eerder door Grossoehme et al. is gerapporteerd. ²⁰.

Resultaten

Het doel was om de thermodynamica van Cu(II) binding aan C-peptide te kwantificeren en te bevestigen met behulp van de complementaire technieken van elektronische absorptiespectroscopie en ITC. Vanwege de robuuste aard van elektronische absorptiespectroscopie werd een directe titratie van Cu(II) in 300 μM C-peptide uitgevoerd (figuur 1). Toevoeging van 150 μM Cu(II) veroorzaakte een onmiddellijke toename van de band bij 600 nm, toegeschreven aan de d-d-band van Cu(II), en bleef toenemen totd...

Discussie

Dit artikel biedt een robuuste methode voor het kwantificeren van de affiniteit en thermodynamica van Cu(II) binding aan peptiden. Complexen met Cu(II) zijn door de d⁹ elektronenconfiguratie bij uitstek geschikt om de d-d absorptieband op de metaallocatie te bewaken. Hoewel de extinctiecoëfficiënt klein is, waardoor grotere concentraties van het complex nodig zijn om een betrouwbaar signaal te leveren, kunnen titraties van Cu(II) in peptide snel inzicht geven in de bindingsstoomometrie en de geschatte bindings...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,10-fenantroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Fles-top 0.45 micron membraan	Nalgene	296-4545	Elk filtratiesysteem dat de hars verwijdert zonder verontreinigingen te introduceren, is acceptabel
Koper(II)chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Elektronische absorptiespectrofotometer	Varian	Cary 5000	Een andere geschikte gevoelige spectrofotometer is acceptabel
Hoge affiniteitshars	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isotherme titratiecalorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC-analysesoftware	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) kan ook worden gebruikt
ITC-software	TA Instruments	ITCRun
Lichte delicaatdoek	Kimwipe	34155
Injectiespuit	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
Gematchte cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Zorg ervoor dat het venster voor de cuvette met klein volume overeenkomt met de straalhoogte van de spectrofotometer
MOPS-buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrofotometersoftware	Cary	WinUV Scan
spreadsheetprogramma	Microsoft	Excel	Elk geschikt spreadsheetprogramma werkt
Titratiespuit	TA Instruments	5346
Ultrapuur water	Millipore Sigma	Milli-Q	Elk water is oké zolang >18 MΩ weerstand