Dit protocol beschrijft de inductie van Gram-negatieve monobacteriële sepsis in een muismodelsysteem. Het model is nuttig bij het onderzoeken van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties tijdens sepsis.
Methodenartikel
Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Sepsis is een ontregelde immuunrespons van de gastheer op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging op een plaats die ver verwijderd is van die van de infectie of schade. Momenteel omvatten de veelgebruikte muizenmodellen van sepsis lipopolysaccharide (LPS) -geïnduceerde endotoxemie, cecale ligatie en punctie (CLP) en monobacteriële infectiemodelsystemen. Dit protocol beschrijft een methode om de gastheerresponsen te bestuderen tijdens Salmonella Typhimurium-infectie-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen. S. Typhimurium, een Gram-negatieve intracellulaire ziekteverwekker, veroorzaakt tyfusachtige ziekte bij muizen.
Dit protocol werkt de kweekvoorbereiding, inductie van septische peritonitis bij muizen door intraperitoneale injectie en methoden om systemische gastheerresponsen te bestuderen uit. Verder wordt de beoordeling van bacteriële belasting in verschillende organen en de flowcytometrische analyse van verhoogde neutrofielenaantallen in de peritoneale lavage gepresenteerd. Salmonella Typhimurium-geïnduceerde sepsis bij muizen leidt tot een toename van pro-inflammatoire cytokines en snelle infiltratie van neutrofielen in de peritoneale holte, wat leidt tot een lagere overleving.
Elke stap in dit protocol is geoptimaliseerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid van de pathogenese van septische peritonitis. Dit model is nuttig voor het bestuderen van immunologische reacties tijdens bacteriële sepsis, de rol van verschillende genen in ziekteprogressie en de effecten van geneesmiddelen om sepsis te dempen.
Inleiding
Sepsis wordt gedefinieerd als een ontregelde systemische ontstekings- en immuunrespons op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging ver weg van de plaats van infectie of schade. Septische shock is een subgroep van sepsis die wordt gekenmerkt door hypotensie die aanhoudt tijdens volumereanimatie, met een aanzienlijk verhoogd risico op mortaliteit1. Het grote publiek is zich meer bewust geworden van deze aandoening tijdens de COVID-19-pandemie. Ondanks de hoge geassocieerde mortaliteit ontbreken uitgebreide epidemiologische gegevens over de wereldwijde last van sepsis vanwege de complexiteit van de diagnose. In 2017 waren er wereldwijd 48,9 miljoen sepsis-incidenties en 11 miljoen sterfgevallen, goed voor 19,7% van alle wereldwijde sterfgevallen2. Verder bleek uit een onderzoek naar de uitgebreide prevalentie van infectie en gerelateerde sepsis bij patiënten op de intensive care dat 62% van de positieve isolaten van patiënten Gram-negatieve organismen waren3.
Aanvankelijk richtten de onderzoeken naar sepsis zich op het afbakenen van microbiële pathogenese. Het begrijpen van de "gevaarhypothese", die dicteert hoe de gastheer zichzelf en niet-zelf onderscheidt, leidde echter tot het kantelen van de balans van sepsisonderzoek naar het begrijpen van de gastheerrespons op een binnendringende ziekteverwekker. De meest gebruikte muizenmodellen van sepsis omvatten het lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde endotoxemiemodel, polymicrobiale sepsismodellen, cecale ligatie en punctie (CLP) en colon ascendens stent peritonitis (CASP) en monobacteriële infectiemodellen4.
We hebben een muismodelsysteem gestandaardiseerd door peritoneale sepsis te induceren met behulp van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van anderen omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is dat de klinisch relevante toestand van Gram-negatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model is systemisch, met 100% mortaliteit binnen 96 uur na infectie. Daarom is dit model instrumenteel bij het bestuderen van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties. In dit model wordt sepsis geïnduceerd door intraperitoneaal injecteren van 0,5 miljoen kolonievormende eenheden (CFU) van Salmonella Typhimurium in een 8-10 weken oude C57BL / 6-muis. Systemische infectie kan worden bevestigd door het beoordelen van orgaan bacteriële belasting ~ 16 uur na infectie. Dit artikel toont Salmonella Typhimurium-geïnduceerde peritonitis sepsis bij muizen, karakteriseert de resulterende veranderingen in peritoneale celsamenstelling en kwantificeert bacteriële belasting in verschillende organen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met Salmonella Typhimurium werden uitgevoerd in Bio Safety Level 2 (BSL-2) faciliteiten. Er moet voor worden gezorgd dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) worden gebruikt, de veiligheid wordt gewaarborgd en de standaard BSL-2 biohazard-verwijderingsmethoden worden gevolgd. Alle muizenexperimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Ethics Committee, IISc. Muizen werden gefokt en onderhouden in de Central Animal Facility van IISc (registratienummer: 48/1999/CPCSEA, gedateerd 1/3/1999), goedgekeurd door het ministerie van Milieu en Bos, regering van India. De experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Commissie voor Doel en Controle en Toezicht op Dierproeven met het goedgekeurde vergunningsnummer CAF/Ethics/797/2020.
BSL2-definitie: Een BSL2-classificatie geeft aan dat de biogevaarlijke agentia een matige bedreiging vormen voor het milieu en het laboratoriumpersoneel5.
1. Kweekvoorbereiding van Salmonella Typhimurium
- Voeg 100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerolbouillon toe aan 3 ml Luria Bertani (LB) bouillon. Incubeer de cultuur 's nachts bij 160 tpm bij 37 °C.
- Streep 50 μL van de 's nachts gekweekte cultuur in LB-bouillon op een Salmonella Shigella (SS) agarplaat en incubeer bij 37 °C gedurende ~ 12 uur. Bewaar de SS-agarplaat met de bacteriekolonies bij 4 °C gedurende enkele dagen vóór het in vivo infectie-experiment.
- Kies een enkele kolonie uit de gestreepte SS-agarplaat met behulp van een microtip. Werp de microtip uit in 3 ml LB bouillon en kweek bij 160 tpm bij 37 °C 's nachts.
- Voeg 0,1 ml van de bacteriecultuur toe aan 50 ml LB-bouillon en incubeer bij 37 °C in een schudderincubator bij 160 tpm gedurende 3-4 uur om de logaritmische groeifase te bereiken. Verdun de cultuur met een factor 2 met behulp van LB-bouillon.
OPMERKING: Tijdens de logaritmische fase zijn bacteriële cellen op hun best gezond en delen ze zich actief. - Meet de optische dichtheid (OD) van de cultuur bij 600 nm golflengte van het licht in een spectrofotometer of microplaatlezer. Zodra de OD 1,0 bereikt, maakt u twee aliquots van 1 ml cultuur in 1,5 ml microfugebuizen.
- Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 7.750 × g . Gooi het supernatant weg en was de pellet met 1 ml 1x PBS 2x. Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 7.750 × g .
- Resuspend de pellet in 0,5 ml 1x PBS in twee verschillende 1,5 ml microfugebuizen. Combineer de suspensies van beide buizen in één buis van 1,5 ml die nu ~ 2 × 108 kolonievormende eenheden (CFU) / ml bevat.
- Bereid een bacteriële celsuspensie van 1 × 106 kve/ml door deze stamoplossing te verdunnen.
LET OP: Optimaliseer de CFU die overeenkomt met OD onder specifieke laboratoriumomstandigheden om de CFU voor OD 1.0 te bepalen voordat de experimenten worden gestart.
2. Muizen en infecties
- Huis 8-10 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen met een gewicht van ~ 20 g in de schone lucht kamer van de dierenfaciliteit voor meerdere dagen voor acclimatisatie.
- Houd op de dag van infectie de muis met één hand vast, veeg de buikhuid af met 70% ethanol en spreid de achterpoten voor een betere toegankelijkheid van de buikwand.
- Injecteer 0,5 ml van 1 × 106 kve/ml bacteriële suspensie intraperitoneaal met behulp van een spuit van 1 ml. Daarom ontvangt elke muis 5 × 105 CFU. Controle, niet-geïnfecteerde muizen ontvangen 0,5 ml PBS alleen. Na infectie, plaat de cultuur om de werkelijke geïnjecteerde CFU te controleren, die kan variëren van 0,2-0,8 miljoen CFU / 0,5 ml.
- Zet de muizen terug in de kooien zoals toegewezen.
- Offer de muizen op met behulp van CO 2-verstikking ~ 12-18 uur na infectie voor de beste reactie. Meestal sterven alle geïnfecteerde muizen binnen 96 uur. Onder sommige experimentele interventies kunnen sommige muizen overleven. Euthanaseer deze muizen na 96 uur. Euthanaseer ook elke muis met een lichaamstemperatuur van minder dan 33,2 °C en acute nood bij 96 uur als een humaan eindpunt.
OPMERKING: In dit model kunnen sommige muizen beginnen te sterven na 12 uur Salmonella-injectie . Plan daarom experimenten goed met meerdere tijdspunten.
3. KvE-beoordeling van organen
- Offer de geïnfecteerde muis op door CO 2-verstikking en veeg de buik af met een stuk katoen gedoopt in 70% ethanol. Snijd de buikhuid open. Raadpleeg het artikel van Ray en Dittel voor een videoprotocol over het verzamelen van peritoneale lavagevloeistof6. Snijd de peritoneale holte open en verzamel de organen van belang in microfugebuizen. Bovendien, als het bloed bij muizen met sepsis snel wordt gecoaguleerd en de hoeveelheden laag zijn, verzamel het dan snel na het offeren.
OPMERKING: Deze video demonstreert de opsomming van orgaan-CFU uit de lever terwijl de lever uitgebreide histopathologische schade ondergaat in dit model van sepsis. - Snijd een klein stukje van de lever en plaats het in een microfuge buisje.
OPMERKING: Dit kan maximaal 2-3 uur op ijs worden bewaard voordat u doorgaat naar de volgende stap. - Weeg en breng de stukken over in microcentrifugebuizen. Snijd bij voorkeur stukken met een gewicht van ~ 10-15 mg voor een goede homogenisatie. Gebruik hele organen in het geval van kleinere zoals de mesenteriale lymfeklieren (MLN's) of thymus.
- Voeg 0,5 ml 1x PBS toe aan de buis en homogeniseer de organen met behulp van een handhomogenisator. Zorg ervoor dat de organen volledig gehomogeniseerd zijn. Vul het volume aan tot 1 ml door 0,5 ml 1x PBS toe te voegen.
- Centrifugeer de buizen bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant in verse microfugebuizen en bereid verdunningen van 1 × 10−1 en 10−2 in een 96-well plaat.
- Verdeel 50 μL van het verdunningsmiddel over verse RVS-agarplaten en incubeer de platen bij 37 °C gedurende 12 uur.
- Tel het aantal kolonies dat in elke toestand voorkomt en normaliseer de gegevens met het orgaangewicht met behulp van vergelijking (1):
Kve/mg =
(1)
OPMERKING: Het getal 20 wordt gebruikt in de formule om de kolonies per plaat om te zetten in KVE/ml. Dit aantal wordt bereikt door 1 ml te delen door de hoeveelheid van een bepaald volume van de gekweekte - in dit geval 50 μL.
Als bijvoorbeeld 100 kolonies worden gevonden in een SS-agarplaat, waar 50 μL van een 1 × 10-1 verdunning van een gehomogeniseerd orgaan met een gewicht van 10 mg wordt verspreid, dan
Kve/mg =
4. Flowcytometrische analyse van verschillende immuuncelpopulaties in peritoneaal exsudaat
- Verzamel de peritoneale cellen zoals eerder beschreven door Ray en Dittel6.
- Resuspend de celkorrel uit peritoneale lavagevloeistof in 1 ml RPMI aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Inventariseer de totale celaantallen in de peritoneale lavage met behulp van een hemocytometer. Pas het celnummer aan zodat elke buis 0,2-0,5 miljoen cellen ontvangt.
OPMERKING: Peritoneale lavage bij muizen met sepsis kan RBC's bevatten, die waarschijnlijk verschijnen als gevolg van bloeding. Wees voorzichtig om RBC's uit te sluiten tijdens het tellen van peritoneale cellen. In de brightfield microscoop lijken RBC's veel kleiner dan de immuuncellen. Deze verschijnen als platte schijven of donuts, rond, met een inkeping in het midden, maar niet hol. Een stap naar lyse RBC's kan worden toegevoegd7. - Draai de cellen gedurende 10 minuten met 200 × g bij 4 °C, gooi het supernatant weg en was de cellen 1x met 1x koude PBS. Centrifugeer de cellen bij 200 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Blokkeer de Fc-receptoren op PECs met behulp van FcR-blokker (1:400 verdunning), bereid in blokkerende buffer bestaande uit 5% FBS en 0,02% natriumazide in PBS. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
- Centrifugeer de cellen bij 200 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg. Verdun de fluorchroom-geconjugeerde antilichamen die van belang zijn voor het blokkeren van buffer. Gebruik een verdunning van 1:500 van anti-muis LY6G om de neutrofielen te kleuren.
OPMERKING: Andere immuuncelpopulaties kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van bijvoorbeeld anti-muis B220 voor B-cellen, anti-muis CD3 voor T-cellen en anti-muis F4/80 voor macrofagen. - Incubateer ~ 0,2 miljoen cellen in 200 μL van de verdunde oplossingen van antilichamen in afzonderlijke buizen. Zet als negatieve controle één buis in elk fluorochroomtype opzij voor de niet-gekleurde controle om de cellen te incuberen met 200 μL blokkerende buffer zonder antilichaam.
- Incubeer de monsters op ijs gedurende 45 minuten met intermitterend tikken om de 15 minuten.
- Centrifugeer de cellen bij 200 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende ~ 15 minuten bij kamertemperatuur als ze meerdere dagen moeten worden bewaard. Het is echter het beste om gegevens te verkrijgen van vers gekleurde monsters in een flowcytometer.
- Resuspend de cellen in 200 μL FACS-kleuringsbuffer (2% FBS in PBS). Verkrijg de gegevens in een flowcytometer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een gedetailleerde karakterisering van de immuunrespons van de gastheer met behulp van dit specifieke model wordt getoond in eerdere publicaties 8,9. Enkele representatieve resultaten van het beschreven protocol worden in deze sectie weergegeven. Dit model heeft tot doel systemische infectie van S. te induceren. Typhimurium door intraperitoneale injectie van de bacteriecultuur om sepsis te induceren. Om de infectie te bevestigen, werden de lysaten van de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft een methode voor het induceren van een ernstige vorm van bacteriële sepsis door intraperitoneale injectie van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van anderen, omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is en dus hoogpathogeen, dat de klinisch relevante toestand van Gram-negatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model is systemisch, met 100% mortaliteit binnen 96 uur na infectie. Daarom is dit model instrumenteel in ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken de Central Animal Facility, IISc voor het leveren van muizen voor onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door subsidies aan DpN van het Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board, Government of India. De infrastructurele ondersteuning van het DBT-IISc-programma en DST-FIST-subsidies worden zeer erkend. Wij danken alle eerdere en huidige leden van het DpN lab voor hun steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Verbruiksartikelen | |||
| 1 mL steriele spuit met 26 G naald | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1,5 mL microcentrifugebuisje | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL steriele spuit met 21 G naald | Beckton Dickinson, Spanje | 307758 | |
| 50 mL conische fles | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL graduele centrifugeerbuis | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL graduele centrifugeerbuis | Tarsons, USA | 546021 | |
| Celverdeler | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR-blokker | BD Biosciences | 553142 | |
| Foetaal runder serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC rat anti-muis Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Handmatige homogenisator | - | - | |
| Hemocytometer (Neubauer telkamer) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri schotel | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Apparatuur | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrofotometer | Shimadzu | ||
| Weegmachine | Sartorius |
Referenties
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen