Methodenartikel

Bacteriële beweeglijkheid visualiseren op basis van een kleurreactie

DOI:

10.3791/63706

⸱

15 februari 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om bacteriële motiliteit te detecteren op basis van een kleurreactie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze gemakkelijk te evalueren en nauwkeuriger is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële motiliteit is cruciaal voor bacteriële pathogeniciteit, biofilmvorming en medicijnresistentie. Bacteriële beweeglijkheid is cruciaal voor de invasie en/of verspreiding van vele pathogene soorten. Daarom is het belangrijk om bacteriële beweeglijkheid te detecteren. Bacteriële groeiomstandigheden, zoals zuurstof, pH en temperatuur, kunnen de bacteriegroei en de expressie van bacteriële flagellen beïnvloeden. Dit kan leiden tot verminderde beweeglijkheid of zelfs verlies van motiliteit, wat resulteert in de onnauwkeurige evaluatie van bacteriële motiliteit. Op basis van de kleurreactie van 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) door intracellulaire dehydrogenasen van levende bacteriën, werd TTC toegevoegd aan traditionele semisolid agar voor bacteriële motiliteitsdetectie. De resultaten toonden aan dat deze TTC semisolid agar-methode voor de detectie van bacteriële motiliteit eenvoudig is, gemakkelijk te bedienen en geen grote en dure instrumenten omvat. De resultaten toonden ook aan dat de hoogste beweeglijkheid werd waargenomen in halfvast medium bereid met 0,3% agar. In vergelijking met het traditionele semisolid medium zijn de resultaten gemakkelijker te evalueren en nauwkeuriger.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële motiliteit speelt een cruciale rol bij bacteriële pathogeniciteit, biofilmvorming en medicijnresistentie1. Bacteriële motiliteit is nauw verbonden met pathogeniciteit en is noodzakelijk voor bacteriële kolonisatie tijdens vroege infectie van gastheercellen2. Biofilmvorming is nauw verwant aan bacteriële motiliteit, waarbij bacteriën zich door beweeglijkheid hechten aan het oppervlak van vaste media. Bacteriële motiliteit wordt al lang beschouwd als positief gecorreleerd met biofilmvorming. Een hoge mate van bacteriële resistentie tegen geneesmiddelen als gevolg van biofilm kan leiden tot aanhoudende infecties die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid 3,4,5. Daarom is het belangrijk om bacteriële beweeglijkheid te detecteren. De bacteriële motiliteitstest wordt voornamelijk gebruikt om de beweeglijkheid van verschillende vormen van bacteriën in de levende toestand te onderzoeken, die indirect de aan- of afwezigheid van flagellen kunnen bepalen en dus een belangrijke rol spelen bij de identificatie van bacteriën.

Er zijn directe en indirecte methoden om bacteriële motiliteitte detecteren 6. Omdat bacteriën met flagella beweeglijkheid vertonen, is het mogelijk om te detecteren of bacteriën indirect beweeglijk zijn door de aan- of afwezigheid van flagella te detecteren. Het is bijvoorbeeld mogelijk om beweeglijkheid indirect te detecteren door elektronenmicroscopie en flagellaire kleuring om aan te geven dat bacteriën beweeglijk zijn. Het is ook mogelijk om te detecteren met directe methoden, zoals suspensieval en semisolid punctiemethoden.

De semisolid punctiemethode die vaak wordt gebruikt in niet-gegradueerde microbiologische laboratoria om bacteriële motiliteit te detecteren, ent de bacteriën in de punctie in het semisolid agar-medium met 0,4-0,8% agar, afhankelijk van de richting van bacteriële groei. Als de bacteriën langs de punctielijn groeien om zich te verspreiden, verschijnen er wolkachtige (borstelachtige) groeisporen, wat wijst op de aanwezigheid van flagella en dus beweeglijkheid. Als er geen groeisporen van de priklijn zijn, is de bacterie niet gevlagd of beweeglijk.

Deze methode heeft echter zijn nadelen: de bacteriën zijn kleurloos en transparant, de flagellaire activiteit wordt beïnvloed door de fysiologische kenmerken van de levende bacteriën en andere factoren, en de concentratie van agar en de kleine diameter van de reageerbuis. Bovendien zijn aërobe bacteriën alleen geschikt voor groei op het agaroppervlak, wat de observatie van bacteriële beweeglijkheid beïnvloedt. Om dit experiment te verbeteren, werd daarom 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) (kleurloos) aan het medium toegevoegd om een betrouwbaardere en intuïtievere methode voor het bepalen van bacteriële motiliteit vast te stellen dan de huidige directe punctiemethode met behulp van intracellulaire dehydrogenasen om de vorming van een rood product van TTC 7,8,9,10 te katalyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van halfvast medium

  1. Traditionele semisolid agar
    1. Bereid de traditionele halfvaste agar volgens het recept van het bacteriële motiliteitstestmedium met behulp van de basisingrediënten11. Los 10 g tryptose, 15 g NaCl, 4 g agar op in voldoende gedestilleerd water, stel de pH in op 7,2 ± 0,2 en vul het uiteindelijke volume aan tot 1.000 ml.
    2. Autoclaaf de agar bij 121 °C gedurende 20 minuten en doseer deze in 10 ml reageerbuizen als een 3 cm hoog halfvast medium.
  2. Traditionele halfvaste agar met TTC
    1. Na het autoclaveren van het conventionele halfvaste medium, koel het af tot 50 °C, voeg 5 ml steriele 1% TTC-oplossing toe aan 100 ml medium, meng en doseer het in 10 ml reageerbuizen om een 3 cm hoog halfvast medium te vormen.

2. Bacteriestammen

OPMERKING: Tachtig stammen werden geïsoleerd uit het aquatisch milieu en geïdentificeerd met behulp van een geautomatiseerd bacterie-identificatie-instrument (zie de tabel met materialen), waaronder Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae en Aeromonas hydrophila (tabel 1). Staphylococcus aureus (zie de tabel met materialen) werd gebruikt als een negatieve niet-beweeglijke controle; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella typhimurium (zie de tabel met materialen) werden gebruikt als positieve controlestammen.

  1. Identificeer testbacteriestammen die moeten worden gebruikt voor motiliteitsanalyse.
  2. Neem negatieve niet-beweeglijke controles en beweeglijke positieve controlestammen op.

3. TTC-verbeterde bacteriële motiliteitsobservatie

  1. Pluk afzonderlijke kolonies van testbacteriën uit agarplaten en ent ze in de bovenstaande twee semisolid media (stappen 1.1.2 en 1.2.1) door punctie met behulp van entnaalden.
  2. Kweek de buisjes bij 37 °C in de incubator gedurende 24-48 uur om de resultaten te observeren.
  3. Let op de groeitoestand: karakteriseer de bacteriën als niet-beweeglijk (-) als alleen de punctielijn rood is. Karakteriseer de bacteriën als beweeglijk (+) als de rode kleur zich licht naar buiten verspreidt langs de punctielijn12.

4. Effect van verschillende agarconcentraties op bacteriële motiliteit

  1. Bereid halfvaste media met 0,3%, 0,5% en 0,8% agar en ent ze door punctie, zoals hierboven beschreven. Observeer de resultaten na 24-48 uur incubatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zowel standaardstammen als geïsoleerde stammen werden vergeleken voor motiliteitsdetectie en de resultaten zijn weergegeven in tabel 1. Door de afwezigheid van flagella groeiden Staphylococcus aureus en Klebsiella pneumoniae alleen langs de geënte lijn op zowel traditionele als TTC semisolid media. Daarentegen vertoonden Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli en Salmonella typhimurium groei in alle richtingen rond de geënte lijn na 24 uur kweken op TTC halfv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De detectie van bacteriële motiliteit door de semisolid medium-methode wordt beïnvloed door vele factoren13,14. Bacteriële groeiomstandigheden, zoals zuurstof (aeroob op agaroppervlak, niet-aeroob aan de onderkant van de buis met het halfvaste medium), pH en temperatuur, kunnen de levensvatbaarheid van bacteriële flagellen beïnvloeden, wat kan leiden tot verminderde beweeglijkheid of zelfs verlies van beweeglijkheid15. Bovendien kunnen som...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) en het Teaching Reform Research Project van de China Pharmaceutical University (2019XJYB18).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacto AgarDifco
Escherichia coliATCCATCC25922Positieve controle
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC27853Positieve controle
Salmonella typhimuriumATCCATCC14028Positieve controle
Staphylococcus aureusATCCATCC25923Negatieve niet-mobiele controle
Tryptose OXOID
TTCSigma298-96-4
VITEK 2 geautomatiseerd microbiologisch identificatiesysteemBio Mérieux

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).
  2. Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
  3. Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
  4. Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
  5. Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
  6. Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
  7. Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
  8. An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
  9. Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2(2016).
  10. McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
  11. Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
  12. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).
  13. Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
  14. Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).
  15. Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  16. Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
  17. Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
  18. Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

TTC agarsemisolide mediumdetectie van beweeglijkheidpathogene bacteri nflagelexpressiebiofilmvorminginoculatietechniekdehydrogenaseactiviteit

Gerelateerde artikelen