Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

Summary

Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.

Abstract

Het begrijpen van eiwithomeostase in vivo is de sleutel om te weten hoe de cellen werken in zowel fysiologische als ziekteomstandigheden. Het huidige protocol beschrijft in vivo etikettering en daaropvolgende zuivering van nieuw gesynthetiseerde eiwitten met behulp van een gemanipuleerde muislijn om eiwitetikettering naar specifieke cellulaire populaties te leiden. Het is een induceerbare lijn door Cre-recombinase-expressie van L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*), waardoor azidonorleucine (ANL) kan worden opgenomen in de eiwitten, die anders niet zullen optreden. Met behulp van de hier beschreven methode is het mogelijk om celtypespecifieke proteomen die in vivo zijn gelabeld te zuiveren en subtiele veranderingen in het eiwitgehalte te detecteren als gevolg van vermindering van de complexiteit van het monster.

Introduction

Afwijkende eiwithomeostase wordt veroorzaakt door een onbalans in eiwitsynthese en -afbraak. Verschillende ziekten zijn gerelateerd aan veranderingen in eiwithomeostase. Het kenmerk van sommige ziekten is de aanwezigheid van aggregaten op verschillende subcellulaire locaties en hersengebieden. Eiwithomeostase is niet alleen belangrijk bij ziekte, maar speelt ook een cruciale rol in de normale orgaan- en cellulaire functie¹. Eiwitsynthese is bijvoorbeeld noodzakelijk voor vele vormen van neuronale plasticiteit ^2,3, zoals bepaald door het gebruik van chemische remmers die eiwitsynthese bl....

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd met toestemming van de lokale overheidskantoren in Duitsland (RP Darmstadt; protocollen: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) of Spanje (Comité van Dierproeven bij de UCM en Milieubegeleiding van de Comunidad de Madrid, protocolnummer: PROEX 005.0/21) en voldoen aan de regels en Spaanse voorschriften van de Max Planck Society en volgen de EU-richtlijnen voor dierenwelzijn.

1. In vivo metabole etikettering met ANL

1. Drinkwater:
   1. Los ANL en maltose op in het reguliere drinkwater van de muizen. De aanbevolen maltoseconcentratie is 0,7% (wt/vol). De maximale hoe....

Results

Volgens het beschreven protocol (samengevat in figuur 1) werd ANL toegediend aan muizen, hetzij door dagelijkse intraperitoneale injecties (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) gedurende 7 dagen, of via drinkwater (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) gedurende 21 dagen. Na het labelen werden de overeenkomstige hersengebieden ontleed, gelyseerd, gealkyleerd en geklikt. Klikreacties werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Western Immunoblot. Representatieve beelde.......

Discussion

De kritische aspecten van het protocol zijn; de opname van negatieve controles, met voldoende biologische replicaties, ANL-toedieningsroute, hoeveelheid en duur, alkylering van de monsters, alkynconcentratie en eliminatie van β-mercaptoethanol bij gebruik van DST-alkyn.

Het is van cruciaal belang om negatieve controlemonsters op te nemen die afkomstig zijn van ANL-gelabelde dieren zonder Cre-driver en dus geen MetRS*-expressie. Deze monsters moeten worden onderworpen aan elke stap die in het p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Acrylamide gels	GenScript	SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830	Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL			Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl	IrishBotech	HAA1625.0500
Benzonase	Sigma	E1014
Biotin alkyne	Thermo,	B10185
Chicken antibody anti-GFP	Aves	1020
Complete EDTA-free protease inhibitor	Roche	4693132001	Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide	Sigma	254185	99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne			Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO	Sigma	276855
Filters	Merk	SCGP00525
Iodo acetamide (IAA)	Sigma	I1149
IR anti chicken 800	LI-COR	IRDye 800CW	Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680	LI-COR	IRDye 680RD	Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose	Sigma	M9171
Manual Mixer	BioSpec Products	1083
NaCl	Sigma	S9888
N-ethylmaleimide	Sigma	4259	Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads	Pierce	29200
Nitrocellulose membrane	Bio-rad	1620112
PBS 1X	Thermo	J62036.K2
PBS 1X pH 7.8			Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns	GE Healthcare		Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo,	23225	Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody	Cell Signaling	5597
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
SDS 10%	Sigma	71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS	GenScript	M00138
SYPRO Ruby stain	Sigma	S4942
Table automatic Vortexer	Eppendorf	Mixmate
Triazole ligand	Sigma	678937
Triton X-100	Sigma	T9284
Water	Sigma	W4502	Molecular biology grade