Methodenartikel

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

DOI:

10.3791/63718

⸱

8 juni 2022

 ,  ,  , 
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skeletspier lipide-infiltratie, bekend als myosteatose, neemt toe met obesitas en veroudering. Myosteatose is onlangs ook ontdekt als een negatieve prognostische factor voor verschillende andere aandoeningen zoals hart- en vaatziekten en kanker. Overmatige lipide-infiltratie vermindert de spiermassa en kracht. Het resulteert ook in lipotoxiciteit en insulineresistentie, afhankelijk van het totale intramyocellulaire lipidengehalte, lipidedruppel (LD) morfologie en subcellulaire distributie. Vezeltype (oxidatieve versus glycolytische) is ook belangrijk, omdat oxidatieve vezels een grotere capaciteit hebben om lipiden te gebruiken. Vanwege hun cruciale implicaties in de pathofysiologie zijn diepgaande studies over LD-dynamica en -functie op een vezeltypespecifieke manier gerechtvaardigd.

Hierin wordt een compleet protocol gepresenteerd voor de kwantificering van het intramyocellulaire lipidengehalte en de analyse van LD-morfologie en subcellulaire distributie op een vezeltypespecifieke manier. Hiertoe werden seriële spier cryosecties gekleurd met de fluorescerende kleurstof Bodipy en antilichamen tegen myosine zware keten isovormen. Dit protocol maakt de gelijktijdige verwerking van verschillende spieren mogelijk, bespaart tijd en vermijdt mogelijke artefacten en dankzij een gepersonaliseerde macro die in Fiji is gemaakt, is de automatisering van LD-analyse ook mogelijk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skeletspier lipide-infiltratie, bekend als myosteatose, neemt toe met obesitas en veroudering. Myosteatose is negatief gecorreleerd met spiermassa en kracht en met insulinegevoeligheid1. Bovendien geven recente studies aan dat de mate van myosteatose kan worden gebruikt als een prognostische factor voor andere aandoeningen zoals hart- en vaatziekten2, niet-alcoholische leververvetting3 of kanker4. Lipiden kunnen zich ophopen in skeletspieren tussen spiervezels als extramyocellulaire lipiden of in de vezels, als intramyocellulaire lipiden (IMCLs). IMCLs worden voornamelijk opgeslagen als triglyceriden in lipidedruppels (LD's) die worden gebruikt als metabole brandstof tijdens lichaamsbeweging 5,6. Wanneer het lipidenaanbod echter de vraag overtreft, of wanneer mitochondriën disfunctioneel worden, zullen IMCLs betrokken zijn bij spierinsulineresistentie, zoals gezien bij metabolisch ongezonde, zwaarlijvige personen en bij type 2 diabetespatiënten7. Intrigerend genoeg hebben duursporters vergelijkbare, zo niet hogere, niveaus van IMCLs als die gevonden bij zwaarlijvige patiënten met type 2 diabetes mellitus, met behoud van een hoge insulinegevoeligheid. Dit fenomeen wordt beschreven als de "atleetparadox"8,9 en wordt verklaard door een meer genuanceerde beoordeling van spier-LD's, gerelateerd aan hun grootte, dichtheid, lokalisatie, dynamiek en samenstelling van lipidesoorten.

Ten eerste is de LD-grootte omgekeerd gecorreleerd aan insulinegevoeligheid en fysieke fitheid10,11. In feite vertonen kleinere LD's een relatief groter oppervlak voor lipasewerking en hebben ze dus mogelijk een groter vermogen om lipiden te mobiliseren12. Ten tweede speelt LD-dichtheid (getal/oppervlak) een controversiële rol bij insulinewerking 8,10; toch lijkt het bij sporters toe te nemen. Ten derde is de subcellulaire lokalisatie van LD's belangrijk, omdat LD's net onder het oppervlaktemembraan (subsarcolemmaal of perifeer) een schadelijker effect uitoefenen op de insulinegevoeligheid dan centrale 8,9,13. Deze laatste leveren brandstof aan centrale mitochondriën, die een grotere ademhalingsactiviteit hebben en meer gespecialiseerd zijn om te voldoen aan de hoge energievraag die nodig is voor contractie14. Perifere LD's leveren daarentegen subsarcolemmale mitochondriën, die betrokken zijn bij membraangerelateerde processen8. Ten slotte kunnen, naast triglyceriden, specifieke complexe lipiden in de spier schadelijker zijn dan andere. Diacylglycerol, lange-keten acyl-CoA en ceramiden kunnen zich bijvoorbeeld ophopen in spieren wanneer de triglyceridenomloopsnelheid laag is, waardoor insuline wordt aangetast die 9,15 signaleert. Terugkerend naar de "paradox van de atleet", hebben duursporters een groot aantal kleinere centrale LD's met verhoogde omloopsnelheden in type I (oxidatieve) vezels, terwijl zwaarlijvige en diabetische patiënten grotere perifere LD's hebben met lage omloopsnelheden in type II (glycolytische) vezels 8,15,16. Naast hun rol in energieopslag en -afgifte, kunnen LDs via afgeleide vetzuren (FA) en een vachteiwit (perilipin 5) ook functioneren als kritische spelers die betrokken zijn bij de transcriptionele regulatie van FA-oxidatie en mitochondriale biogenese8. Vanwege hun cruciale implicaties in de fysiologie en pathofysiologie, zijn diepgaande studies over de dynamiek en functies van LDs gerechtvaardigd.

Hoewel er verschillende technieken zijn om IMCLs te bestuderen, zijn ze niet allemaal geschikt om de LD-grootte, -dichtheid en -distributie op een vezelspecifieke manier nauwkeurig te kwantificeren. Bijvoorbeeld, de beoordeling van IMCLs door magnetische resonantiespectroscopie, hoewel niet-invasief, biedt een resolutieniveau dat niet voldoende is om de grootte en precieze locatie van LDs in de vezel te bestuderen, en het is niet vezeltypespecifiek17,18. Evenzo kunnen biochemische technieken uitgevoerd op homogene homogenen van de hele spieren19 de locatie en grootte van lipiden niet beoordelen. Bijgevolg is de meest geschikte methode om LD-morfologie en locatie te analyseren kwantitatieve transmissie-elektronische microscopie13, maar deze techniek is duur en tijdrovend. Daarom is confocale fluorescentiebeeldvorming op preparaten met kleurstoffen zoals Oil Red O (ORO)20,21, monodansylpentane (MDH)22 of Bodipy 23,24,25 naar voren gekomen als het beste hulpmiddel voor deze studies.

Hier wordt een compleet protocol beschreven, inclusief weefselbemonstering en -verwerking, Bodipy-kleuring en confocale beeldacquisitie en -analyse om de LD-grootte, het aantal en de lokalisatie in cryosecties van muizenspieren te kwantificeren. Aangezien IMCLs niet gelijkmatig verdeeld zijn over oxidatieve en glycolytische vezels, en elk vezeltype de LD-dynamiek anders reguleert, moet de studie van IMCLs vezeltypespecifiekzijn 16,25,26,27. Daarom gebruikt dit protocol immunofluorescentie op seriële secties om myosine zware keten (MyHC) isovorm (en) uitgedrukt door elke vezel te identificeren. Een ander voordeel van dit protocol is de gelijktijdige verwerking van een glycolytische (extensor digitorum longus, EDL) en een oxidatieve (soleus) spier die naast elkaar worden geplaatst voor het bevriezen (figuur 1). Deze gelijktijdige verwerking bespaart niet alleen tijd, maar voorkomt ook variabiliteit door afzonderlijke verwerking van de monsters.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de procedure. Na spierdissectie (1) worden geselecteerde spieren van vergelijkbare grootte voorbereid en samen ingevroren (2). Seriële dwarsdoorsneden van 10 μm worden verkregen met behulp van een cryostaat en direct gemonteerd op adhesieglaasjes (3). Van twee seriële dia's is de eerste (4A) immunoactief gelabeld voor laminine en gekleurd met Bodipy om LDs te herkennen en de tweede (4B) is immunostained met antilichamen tegen MyHC's voor de herkenning van spiervezeltypen. Beelden worden verkregen met behulp van een confocale microscoop voor Bodipy (5A) en een epifluorescentiemicroscoop voor spiervezeltypen (5B). Afbeeldingen worden in Fiji geanalyseerd door een drempel toe te passen en deeltjes (6A) te kwantificeren om het aantal, de gemiddelde grootte, de dichtheid en het percentage van het totale gebied bezet door LDs (7) of telcellen (6B) te verkrijgen om het percentage vezels van elk type in de sectie (7) te verkrijgen. Afkortingen: LDs = lipidedruppels; EDL = extensor digitorum longus; MyHC's = myosine zware keten isovormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures uitgevoerd op muizen werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Medische Sector aan de Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).

1. Dissectie en voorbereiding van de monsters voor bevriezing

  1. Label een 3 mm dik stuk kurk voor elk paar spieren.
  2. Steek via een kleine incisie gemaakt met een mes op het midden van de kurk loodrecht een rechthoekig stuk stijf plastic (0,5 cm B, 1 cm H) in dat als ondersteuning zal dienen (figuur 2B).
    OPMERKING: De grootte van het rechthoekige plastic stuk hangt af van de grootte van de spier. Hier worden de beschreven afmetingen aangepast aan de grootte van de soleus (~ 9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) en EDL (~ 5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) van een 3 maanden oude C57BL / 6J mannelijke muis.
  3. Verwijder op het moment van dissectie de soleus en EDL van de achterpoot van de muis. Om te voorkomen dat de monsters tijdens de dissectie uitdrogen, plaatst u ze op een kompres dat licht bevochtigd is met een zoutoplossing in een petrischaaltje dat op ijs is geplaatst.
    OPMERKING: Zie Wang et al.28 voor uitleg over hoe deze twee ledemaatspieren te ontleden.
  4. Plaats een kleine druppel Optimal Cutting Temperature compound (OCT) op de kurk/plastic junctie en vermijd luchtbellen.
  5. Verwijder overtollig vocht uit de monsters door ze voorzichtig te drogen met een papieren handdoek (figuur 2A) en plaats beide spieren op het plastic loodrecht op de kurk (figuur 2C).
  6. Controleer de oriëntatie van de spiermyofibers onder een stereomicroscoop (figuur 2D).
    OPMERKING: Het is belangrijk om de spier niet te bedekken met OCT, omdat het isolerende effect ervan snel bevriezen zou voorkomen en bevriezingsartefacten zal produceren.

2. Skeletspiermonsters invriezen voor cryosectie

LET OP: Het bevriezen van de spier moet gebeuren onder een chemische kap, met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (zie de tabel met materialen).

  1. Gebruik een roestvrijstalen beker (~ 8 cm H, 6 cm Ø) met twee zijbanden van ten minste 25 cm lang (figuur 2F) en vul de beker tot 2/3 van zijn capaciteit met isopentaan.
  2. Pak de beker bij de riemen en dompel deze voorzichtig onder in een polystyreendoos gevuld met vloeibare stikstof, zodat het stikstofgehalte buiten de container boven het niveau van isopentaan binnenin ligt (figuur 2F, G).
    LET OP: Wanneer de beker in contact komt met de stikstof, kan de thermische schok wervelingen veroorzaken. Zorg ervoor dat de tumbler voldoende is ondergedompeld, maar vermijd het binnendringen van stikstof, omdat dit isopentane neerslag zou veroorzaken. Als dit gebeurt, laat de isopentane afkoelen, vul de tumbler met nieuwe isopentane en begin opnieuw.
  3. Wanneer de binnenkant van de beker volledig bedekt is met een witte vaste laag isopentaan, haalt u deze uit de doos met vloeibare stikstof (figuur 2H).
    OPMERKING: De smelttemperatuur van isopentaan is -159 °C, de randen van de beker worden wit als het koud genoeg is.
  4. Roer de vaste stukjes isopentaan voorzichtig met een tang in de resterende vloeibare isopentaan totdat het hele volume weer vloeibaar wordt.
  5. Dompel de beker opnieuw onder in de vloeibare stikstof totdat isopentaan witte kiezels vormt over de bodem en randen van de beker (figuur 2G, H).
    OPMERKING: Deze tweede koelstap zorgt voor de juiste vriestemperatuur van het isopentaan.
  6. Verwijder de beker uit de vloeibare stikstof en dompel de spieren snel in de bodem van de beker, houd de kurk vast met een pincet met rattentanden. Draai de kurk gedurende 15 s in het isopentaan en bewaar deze bij -80 °C tot de verwerking (figuur 2I).
    OPMERKING: Voor kortdurende opslag kunnen de monsters worden bewaard in een vriezer van -20 °C. Het volledige protocol voor het snel bevriezen van skeletspieren is al elders gepubliceerd. Voor gedetailleerde referenties en probleemoplossing, zie: Meng et al.29, Kumar et al.30 en Leiva-Cepas et al.31.

3. Cryosectie

  1. Breng de monsters in de kamer van een eerder afgekoelde cryostaat tot -20 °C en de bladtemperatuur ingesteld op -25 °C.
    OPMERKING: Transporteer monsters van de vriezer van -20 °C/-80 °C naar de cryostaat in een polystyreendoos gevuld met droogijs en laat de monsters gedurende ten minste 20-30 minuten in evenwicht brengen tot de kamertemperatuur voordat ze worden gesneden.
  2. Verwijder het plastic van de kurk met een fijn pincet en plaats de cryostat monsterschijf op de snelvriesplaat om af te koelen. Zodra de plaat -50 °C heeft bereikt, plaatst u wat OCT op de schijf en plaatst u de kurk snel op de schijf en drukt u stevig. Wacht tot de OCT stolt en de kurk goed op de schijf is bevestigd.
  3. Plaats de schijf op de objectkop in de gewenste snijoriëntatie (figuur 2J,K) en trim het spierblok verder dan ten minste 1/3 van de lengte van de spieren en totdat beide doorsneden van de spieren zichtbaar zijn.
  4. Stel de snijdikte in op 10 μm en plaats één sectie op een hechtingsschuif om de juiste oriëntatie van de vezels op een brightfieldmicroscoop te controleren.
    OPMERKING: Het controleren van de transversale oriëntatie van de vezels is van cruciaal belang. Als de vezels niet voldoende zijn georiënteerd, pas dan de hoek van de objectkop aan, snijd een ander gedeelte en controleer opnieuw.
  5. Plaats twee seriële doorsneden op twee vooraf gelabelde hechtingsdia's: één dia om vezeltypen te bepalen, de andere om het lipidengehalte te kwantificeren (figuur 2L).
    OPMERKING: Aanvullende seriële doorsneden kunnen worden verkregen en bij -80 °C worden gehouden voor andere histologische onderzoeken. Om echter te voorkomen dat het lipidengehalte en de intracellulaire morfologie veranderen24, is het essentieel om de eerste twee dia's onmiddellijk na het snijden te verwerken om luchtdroging te voorkomen. Het invriezen en ontdooien van de dia's voor LD-kwantificering zou hetzelfde effect hebben en is dus zeer af te raden.

4. Vezeltypering en Bodipy-kleuring

  1. Immunohistochemische detectie van spiervezeltype
    OPMERKING: Voor het volgende protocol is een totaal oplossingsvolume van 250 μL voldoende om het hele spiergedeelte te bedekken, omringd door een cirkel getekend met een hydrofobe pen ter grootte van een muntstuk van ongeveer 1 cent.
    1. Omring de secties met een omtrek getekend met een hydrofobe pen en spoel af met ijskoude 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT). Plaats de schuif in een vochtige kamer en blok gedurende 90 minuten bij 37 °C in blokkerende oplossing (10% normaal geitenserum (NGS) en 1:30 muis op muis (MOM) blokkerend reagens in PBS).
    2. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de dia's gedurende 90 minuten bij 37 °C met de oplossing die de primaire antilichamen bevat (5% NGS, 1:30 MOM-blokkerend reagens, de primaire antilichamen van de muis om type I (IgG2b, 1:10), type IIa (IgG1, 1:10) en type IIx (IgM, 1:5) vezels en een rat anti-laminine (α2-keten) te herkennen, 1:1.000) in PBS.
    3. Was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
    4. Incubeer de dia's in het donker gedurende 1 uur bij RT met de oplossing die de secundaire antilichamen bevat (geiten anti-IgG2b AF405 (1:500), geiten-anti-IgG1 AF488 (1:500), geiten-anti-IgM AF568 (1:1.000) en geiten-anti-laminine AF647 (1:500) in PBS).
      LET OP: Voor de rest van het protocol, zorg ervoor dat u de dia's uit de buurt van licht houdt om de fluorescentie te behouden.
    5. Was opnieuw 3 x 5 minuten in PBS, spoel af in dubbel gedestilleerd H2O, verwijder overtollig water en monteer met een antifade-reagens.
      OPMERKING: Bewaar de dia's bij 4 °C, beschermd tegen licht om de fluorescentie te behouden tot de beeldacquisitie. Omdat de dia's niet vast zijn, wordt aanbevolen om voor elk experiment vers gemaakte oplossingen te gebruiken, de PBS te autoclaaf te maken en de beelden zo snel mogelijk te verkrijgen om besmetting van de secties te voorkomen.
  2. Kleuring van LDs met Bodipy
    OPMERKING: Net als bij stap 4.1 is een totaal oplossingsvolume van 250 μL voldoende om het hele spiergedeelte te bedekken, omringd door een cirkel getekend met een hydrofobe pen ter grootte van een muntstuk van ongeveer 1 cent.
    1. Omring de secties met een omtrek getekend door een hydrofobe pen en spoel met ijskoude 0,1 M PBS gedurende 10 minuten bij RT. Gebruik ijskoude PBS voor alle spoelingen en wasbeurten.
    2. Fixeren met koud 4% paraformaldehyde (PFA) zonder methanol gedurende 10 minuten bij RT. Na een eerste snelle spoeling, was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
      LET OP: Voer deze stap uit onder een chemische kap.
    3. Plaats de glijbaan in een vochtige kamer en blok gedurende 1 uur op RT met 5% NGS in PBS.
    4. Incubeer de dia's gedurende 90 minuten bij 37 °C met de oplossing van het primaire antilichaam (2% NGS en rattenantamine (α2-keten, 1:1.000) in PBS). Was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
      LET OP: Voor de rest van het protocol, zorg ervoor dat u de dia's uit de buurt van licht houdt om de fluorescentie te behouden.
    5. Incubeer gedurende 1 uur bij RT met de secundaire antilichaamoplossing die geiten anti-rat-AF647-antilichaam (1:500) in PBS bevat. Was de dia's met PBS 3 x 5 min op RT.
    6. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT met een oplossing van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 0,5 μg/ml) en BODIPY (1 μg/ml) in PBS.
      OPMERKING: Om BODIPY-stamoplossing te bereiden, lost u deze op in DMSO in een concentratie van 1 mg / ml. Verschillende Bodipy-formuleringen zijn in de handel verkrijgbaar voor LD-kleuring. Afhankelijk van de gemaakte keuze is de kleuringsmethode hetzelfde (dezelfde stappen, concentratie en incubatietijd); de acquisitiemethode zal echter iets anders zijn.
    7. Was na een eerste snelle spoeling de dia's met PBS 3 x 5 min op RT, spoel in dubbel gedestilleerd H2O, verwijder overtollig water en monteer met een antifade-reagens.
      OPMERKING: Bewaar de dia's bij 4 °C, beschermd tegen licht, om de fluorescentie te behouden tot de beeldacquisitie.

5. Verwerving van afbeeldingen

OPMERKING: Zodra de kleuringsprotocollen zijn voltooid, is het belangrijk om onmiddellijk over te gaan tot beeldacquisitie (binnen de volgende 24 uur), niet alleen om besmetting te voorkomen, maar ook om de morfologie, grootte en het aantal LDs te behouden.

  1. Verwerving van beelden om de vezeltypen van elke bemonsterde spier te beoordelen
    OPMERKING: Deze stap kan worden bereikt met een fluorescentiescanmicroscoop met hele dia's of met een conventionele epifluorescentiemicroscoop. Bij dit laatste moet handmatig of geautomatiseerd naaien van de afbeeldingen worden gedaan om de sectie te reconstrueren.
    1. Gebruik voor vezelherkenning een epifluorescentiemicroscoop met een 10x/0.3-objectief. Selecteer excitatiefilters voor DAPI (405 nm), FITC, TRITC en Cy5 om respectievelijk type I, IIa, IIx-vezels en laminine te detecteren.
      OPMERKING: Type IIb-vezels worden niet immuungelabeld. Ze zullen worden herkend als vezels gekleurd door laminine op de grenzen van het sarcolemma met een zwart sarcoplasma.
    2. Pas de juiste belichtingstijd voor elk kanaal aan.
    3. Wanneer u een conventionele epifluorescentiemicroscoop gebruikt, verwerf dan altijd de beelden van de hele spier volgens dezelfde volgorde om spierreconstructie te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de vezels aan de rechterrand van de ene afbeelding ook aan de linkerkant van de volgende afbeelding worden weergegeven. Hetzelfde geldt voor het bovenste en onderste deel van de afbeeldingen (figuur 3A).
      OPMERKING: Ter referentie, voor een sectie van de EDL of de soleus ontleed van een muis van 3 maanden oud, zullen gemiddeld zes en acht afbeeldingen, respectievelijk, de hele spierdoorsnede bedekken.
    4. Nadat de spier is gescand, uploadt u de vastgelegde digitale afbeeldingen naar elke beeldverwerkingssoftware voor reconstructie (stitching), op basis van de vezelmorfologie (laminine) en de histologie van de spiersectie, en slaat u deze op als een TIFF-, PNG- of JPG-bestand met alle kanalen (kleuren) samengevoegd (figuur 3A).
  2. Verwerving van afbeeldingen met laminine en Bodipy co-kleuring
    OPMERKING: Om het vezeltype te herkennen en een schatting te hebben van het aantal vezels voor elk type vastgelegd, is het essentieel om het vezeltypegedeelte al te laten scannen en de spieren te reconstrueren voordat de beeldacquisitie van Bodipy-laminin wordt gestart (figuur 3B).
    1. Gebruik voor Bodipy-beeldobservatie en -acquisitie een confocale microscoop met een 40x olie-immersieobjectieflens met een numeriek diafragma van 1,4.
    2. Gebruik de volgende instellingen: pinhole bij 1 AU, 2.048 pixel x 2.048 pixel resolutie, pixelgrootte bij 0,08 μm, unidirectionele modus, scansnelheid bij 4 (~4 μs/pixel), lijngemiddelde ingesteld op 4x en digitale zoom ingesteld op 1.
    3. Om cross-talk tussen Bodipy-558/568 en laminine-AF647 te voorkomen, gebruikt u de sequentiële scanmodus op de confocale software.
      OPMERKING: Wanneer de gekozen kleurstof Bodipy-493/503 is, is gelijktijdig confocale laserscanning mogelijk zonder overspraak tussen het Bodipy-kanaal en het laminine-AF647-kanaal. Dit zal de verwerving van beelden versnellen.
    4. Prikkel Bodipy-493/503 met behulp van de 488 nm laserlijn of argonlaserlijn en prikkel Bodipy-555/568 met behulp van de 561 nm diodelaserlijn. Detecteer ten slotte laminine-AF647 met een 640 nm diodelaserlijn.
      LET OP: Houd er rekening mee dat Bodipy-moleculen erg gevoelig zijn voor fotobleaching, dus vermijd onnodig laserscannen. Om vezels te herkennen, gebruikt u alleen de laser voor laminine.
    5. Afhankelijk van de gekozen kleurstof, stelt u de emissiebereiken in op 570-650 nm voor Bodipy-493/50324 en op 565-620 nm voor Bodipy-558/568. Stel het emissiebereik voor laminine in op 656-700 nm.
    6. Stel de versterking en digitale versterking op de juiste manier in, zodat er geen verzadigde pixels worden gedetecteerd op de bereikindicator. Corrigeer het achtergrondsignaal door de offset aan te passen.
      OPMERKING: Filterselectie en andere bovengenoemde scanparameters moeten worden geoptimaliseerd voor elke confocale microscoop. Het is belangrijk dat alle bovengenoemde instellingen constant worden gehouden om alle beelden die zijn vastgelegd uit monsters te vergelijken.
    7. Om het type vezel te identificeren onder degenen die op de confocale microscoop worden gevisualiseerd, gebruikt u een persoonlijke laptop waarop het beeld van de sectie gereconstrueerd na vezeltype immunodetectie wordt gecontroleerd (figuur 3B).
    8. Zodra een groep vezels correct is geïdentificeerd, verwerft u het beeld met de Bodipy- en lamininekanalen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de Bodipy-laminin-afbeeldingsnaam te noteren op het gebied van de spier waar deze vezels zich bevinden op het beeld dat is verkregen voor MyHC-herkenning om de latere vezelspecifieke analyse van LDs te vergemakkelijken.

6. Analyse van afbeeldingen

  1. Analyse van de vezeltypen op elk spiermonster
    1. Open in Fiji (of ImageJ)32 het TIFF-, PNG- of JPG-bestand met de gereconstrueerde spier die is verkregen uit de samenvoeging van alle kanalen die worden gebruikt om de vezelisovormen te detecteren.
    2. Om de cell counting tool te starten, klik op Plugins | Analyseer | Celteller | Celteller.
    3. Klik in het venster Celteller op Acties | Initialiseren.
    4. Selecteer onder Tellers in hetzelfde venster de optie Type 1.
    5. Selecteer in het hoofdvenster van Fiji het gereedschap Wand .
    6. Om het aantal vezels van elk type te kwantificeren, klikt u op elke vezel van hetzelfde type, zodat het programma het aantal aangeklikte vezels registreert.
    7. Als u klaar bent, selecteert u het volgende type vezel en herhaalt u dezelfde stappen.
    8. Wanneer alle vezels van de afbeelding zijn toegewezen aan een bepaald vezeltype, klikt u op Resultaten in het venster Celteller om de resultaten in een tabel weer te geven.
    9. Sla deze tabel op als spreadsheettabel door te klikken op Bestand | Opslaan als in het venster Resultaten .
    10. Sla de selecties op dezelfde afbeelding op elk gewenst moment op en herlaad ze opnieuw door te klikken op respectievelijk Markers opslaan of Markers laden in het venster Celtelling .
  2. Analyse van lipidedruppels op een vezeltype-afhankelijke manier
    1. Analyseer de afbeeldingen van Bodipy en laminine verkregen op de confocal met behulp van Fiji voor de kwantificering van LDs.
      OPMERKING: De auteurs hebben een aangepaste macro ontworpen om de analyse te automatiseren. Deze macro, samen met een stapsgewijze uitleg over het gebruik ervan, is beschikbaar als respectievelijk Aanvullend bestand 1 en Aanvullend bestand 2.
    2. Open elke afbeelding met behulp van de Bio-Formats Importer uit Fiji. Selecteer onder de optie Stack weergeven met de optie Hyperstack | Kleurmodus, Standaard. Zorg ervoor dat het venster Automatisch schalen is geselecteerd.
      OPMERKING: De volgende stappen beschrijven het protocol voor de analyse van één vezel op de afbeelding, maar het moet zo vaak worden herhaald als het aantal volledige vezels op de afbeelding verschijnt.
    3. Gebruik de selectietool uit de vrije hand om handmatig het sarcolemma van de vezel te selecteren op basis van het lamininekanaal (figuur 4A) en druk op T op het toetsenbord om de selectie of regio van belang (ROI) in het ROI-venster vast te leggen.
    4. Ga naar het hoofdvenster van Fiji en klik op Analyseren | Stel Metingen in en selecteer in het pop-upvenster Gebied en feretdiameter. Laat de resterende vakjes uitgeschakeld en andere parameters zoals ze standaard worden weergegeven.
    5. Klik op Meten in het ROI-venster om het gebied en de minimale diameter van Feret (MF) van de geselecteerde vezel te verkrijgen en noteer ze voor later gebruik.
      OPMERKING: Bij het analyseren van LD's is het belangrijk om in gedachten te houden dat hun grootte en dichtheid variëren tussen het centrum en de periferie (subsarcolemmale regio-SS) van de vezel. Daarom moet de analyse afzonderlijk worden uitgevoerd.
    6. Bereken de waarde van 1/6 van de MF om het centrale deel van de vezel af te bakenen.
      OPMERKING: In de macro is de standaard MF-waarde ingesteld op 6, wat betekent dat de toegepaste reductie wordt ingesteld op 1/6 van de MF. Deze waarde werd gekozen op basis van de empirische gegevens verkregen van de soleus van dieren die een vetrijk dieet kregen. Elke onderzoeker moet dit aantal echter wijzigen op basis van de empirische gegevens en de geanalyseerde spier, het type vezel en de toestand van het dier.
    7. Klik in het ROI-venster op Toevoegen om een duplicaat van de eerste ROI te hebben en selecteer de tweede ROI die in het venster verschijnt.
    8. Klik in het hoofdvenster van Fiji op Bewerken | Selectie | Vergroot en introduceer de eerder berekende waarde (uit stap 6.2.6.) met een minteken voor het getal en klik op OK. Klik in het ROI-venster op Add[t] (een derde ROI moet verschijnen) en Delete om de tweede ROI te verwijderen.
      OPMERKING: De onderzoeker kan de resultaten controleren door op het vak Alles weergeven in het ROI-venster te klikken. Op dit punt moeten twee ROI's verschijnen, een die de hele omtrek van de vezel omringt (figuur 4B) en een andere die in het midden is geplaatst (figuur 4C).
    9. Selecteer beide ROI's in het ROI-venster en klik op Meer | XOR | Voeg[t]. Wacht tot er een derde ROI verschijnt, die overeenkomt met de periferie van de vezel (figuur 4D).
    10. Sla de ROI's op door te klikken op Meer | Opslaan om de ROI's te bewaren voor het geval een latere heranalyse van dezelfde vezels nodig is.
    11. Selecteer het Bodipy-kanaal en open het gereedschap Drempel door op Afbeelding | | aanpassen Drempel op fiji's hoofdvenster .
    12. Stel in het pop-upvenster Drempel de waarden in op 70/255, selecteer Yen | B &W-methode en klik op Donkere achtergrond | Solliciteren.
      OPMERKING: De waarden die op de drempelwaarde worden toegepast, kunnen variëren afhankelijk van de omstandigheden van het experiment en de drempel moet op de juiste manier worden ingesteld om de analyse te optimaliseren. Er moet een ZWART-witvenster verschijnen met het Bodipy-signaal boven de drempellimiet in wit en de achtergrond in zwart (vergelijk de oorspronkelijke Bodipy-afbeelding in figuur 4E met die in figuur 4F).
    13. Ga naar het hoofdvenster van Fiji en klik op Analyseren | Stel Metingen in en selecteer in het pop-upvenster Gebied, Gebiedsfractie en Beperken tot drempel. Laat de resterende vakjes uitgeschakeld en andere parameters zoals ze standaard worden weergegeven.
      OPMERKING: Als de onderzoeker de "circulariteit" van LD's wil analyseren, wat een index is van de bolvormige morfologie die varieert van 1 voor een perfecte bol tot 0 voor een lijn, klikt u op het vak Vormbeschrijvingen van het pop-upvenster Metingen instellen .
    14. Ga naar het ROI-venster en selecteer de eerste ROI. Klik in het hoofdvenster van Fiji op Analyseren | Gereedschap Deeltjes analyseren.
      OPMERKING: Deze tool kwantificeert het aantal, de grootte, het bestreken gebied en het percentage van het totale gebied dat wordt bedekt door deeltjes op elke selectie en slaat de resultaten op als een spreadsheetbestand.
    15. Stel de waarden in van 2 tot Oneindig (2-Oneindig) in het venster Deeltjes analyseren , vink het vakje Pixels aan, behoud de standaard circulariteitswaarden, selecteer Samenvatten en klik op OK.
      OPMERKING: Als u de resultaten op de vezel wilt controleren, selecteert u onder de optie Weergeven een van de beschikbare opties. Als u de informatie van elke LD wilt laten herkennen op de selectie in een tabel, vinkt u de optie Resultaten weergeven aan in het venster Deeltjes analyseren . De resultaten van de analyse van de totale oppervlakte van de vezel worden gemiddeld en samengevat in een tabel met verschillende kolommen (aantal, totale oppervlakte, gemiddelde grootte, % oppervlakte; deze komen overeen met het aantal deeltjes [LDs], de oppervlakte die door deze deeltjes wordt ingenomen, hun gemiddelde grootte en het percentage van de totale oppervlakte van de selectie bezet door deeltjes, respectievelijk). Om de dichtheid te berekenen, deelt u het aantal deeltjes door de totale oppervlakte van elke selectie.
    16. Om de waarden van het centrum en de periferie van de vezel te verkrijgen, herhaalt u stap 6.2.14 en 6.2.15, waarbij u telkens de tweede (midden) en de derde ROI (periferie) selecteert.
    17. Sla de resultaten op door op Bestand | Opslaan als in het venster Samenvatting .
      OPMERKING: Vermeld het type vezel, de voorwaarde en de afbeeldingsnaam op de toegewezen naam van de resultaten om latere eenwording en statistische analyse van de gegevens te vergemakkelijken. Om de rest van de vezels in dezelfde afbeelding te analyseren, herhaalt u stap 6.2.3 tot en met 6.2.17. Voor de statistische analyse moeten per dier minstens 10-15 vezels van elk type worden geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hierin beschreven protocol biedt een efficiënte methode om LD's eenvoudig te kwantificeren op een vezeltype en subcellulair-specifieke manier. Het laat zien hoe, door twee spieren van vergelijkbare grootte, zoals de EDL en de soleus, samen te vriezen, de tijd en middelen die aan de volgende stappen worden besteed, met de helft worden verminderd.

Een compleet protocol wordt verstrekt voor immunostaining, beeldacquisitie en analyse van de verschillende MyHC-isovormen die tot expressie komen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een efficiënte methode om LD's te kwantificeren die zijn getagd met Bodipy op een vezeltype- en subcellulair-specifieke basis. In de afgelopen jaren zijn klassieke lipidekleurstoffen, zoals ORO of Sudan Black B, vervangen door een nieuwe reeks celdoorlatende, lipofiele, fluorescerende kleurstoffen die binden aan neutrale lipiden (bijv. Bodipy). Bodipy is verkrijgbaar als verschillende conjugaten en is zeer effectief gebleken in het taggen van LD's om hun morfologie, dyna...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) en de Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. is de ontvanger van een Ph.D. fellowship van de FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. ontving een fellowship van het Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.

De auteurs bedanken Alice Monnier voor haar bijdrage aan de ontwikkeling van dit protocol en Caroline Bouzin voor haar expertise en technische hulp bij het beeldverwervingsproces. We danken ook het 2IP-IREC beeldvormingsplatform voor de toegang tot de cryostaat en de microscopen (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Brussel, België). Tot slot willen de auteurs Nicolas Dubuisson, Romain Versele en Michel Abou-Samra bedanken voor de opbouwende kritiek op het manuscript. Sommige van de figuren van dit artikel zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix cameraZeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera Zeiss
Chemical hoodPotteau LaboEN-14175
Confocal microscopeZeissLSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) Electron Microscopy Sciences63305
Cryo-GlovesTempshield16072252
Cryostat Thermo Scientific Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745Nikon
Dry Ice
Dumont ForcepsF.S.T11295-10
Epifluorescence microscopeZeissAxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn ScissorsF.S.T14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm)ThermoFisher22-363-552Gebakken om een stuk te snijden om de spier op de kurk vast te houden voor bevriezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)BRAND Petri dish, MERKBR455751Gebakken om de spieren op ijs te plaatsen tijdens de dissectie
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP PenVector LabsH-4000Gebakken om een hydrofobe barrière rond de spiersecties te creëren
IncubatorMMM MedcenterIncucell 707 
Microscope Cover Glasses (24x50 mm)Assistent 40990151
Microscope Slide Boxes Kartell278Gebakken als vochtige kamers voor immunohistochemie
Neck holderLinie zwoSB-035X-02Gebakken als riem om de roestvrijstalen tumbler vast te houden
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel BladeSwann-Morton0205
Paint brushesVan BleiswijckAmazon B07W7KJQ2XGebakken om cryosecties te hanteren
Permanent Marker Pen BlackKlinipath/VWR98307-RGebakken om dia's te labelen
Pierce Fixation ForcepsF.S.T18155-13
Polystyrene Box H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, gebruikt als vloeibare stikstofcontainer en om de monsters naar de cryostaat te vervoeren
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3AesculapBB073R
Stainless Steel Cup 10oz EboxerB07GFCBPFHTumbler om te vullen met isopenteen voor spierontdooiing
Superfrost Ultra Plus slidesThermoFisherJ1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teethMedische Vakhandel1303152Ook genoemd "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting EdgeF.S.T15000-00
Weighing boatsVWR international611-2249
Whole-Slide Scanner for FluorescenceZeissAxio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2bSigma-AldrichSAB4600477Gebakken bij een eindconcentratie van 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1ThermoFisherA-21121Gebakken bij een eindconcentratie van 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgMAbcamab175702Gebakken bij een eindconcentratie van 1:1.000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibodyThermoFisherA-21247Gebakken bij een eindconcentratie van 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)ThermoFisherD3922Gebakken bij een eindconcentratie van 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)ThermoFisherD3835Gebakken bij een eindconcentratie van 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)ThermoFisherD1306Gebakken bij een eindconcentratie van 0,5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD-8418Gebakken om Bodipy op te lossen voor de 1 mg/mL stockoplossing. VOORSICHT: Giftig en ontvlambaar. Dampen kunnen irritatie veroorzaken. In een afzuigkap manipuleren. Vermijd direct contact met de huid. Draag rubberen handschoenen, beschermende oogbescherming.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Sigma-Aldrich1004969011VOORSICHT: Kan een allergische huidreactie veroorzaken. Verdacht van genetische defecten. Kan kanker veroorzaken. In een afzuigkap manipuleren. Vermijd direct contact met de huid. Draag rubberen handschoenen, beschermende oogbescherming.
Isopentane GPR RectaPurVWR international24872.298VOORSICHT: Zeer ontvlambare vloeistof en damp. Kan dodelijk zijn bij inslikken en inademing. Kan slaperigheid of duizeligheid veroorzaken. Herhaalde blootstelling kan droge of scheurende huid veroorzaken. Draag beschermende handschoenen/beschermende kleding/oogbescherming/gezichtsbescherming.
Liquid NitrogenVOORSICHT: Extreem koud. Draag handschoenen. Langzaam manipuleren om koken en spetteren te minimaliseren en in goed ge

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
  2. Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
  3. Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
  4. Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839(2020).
  5. Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
  6. van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
  7. Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
  8. Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
  9. Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
  10. Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
  11. Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
  12. Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
  13. Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
  14. Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
  15. Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
  16. Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
  17. Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
  18. Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
  19. De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
  20. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
  21. Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
  22. Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
  23. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
  24. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774(2013).
  25. Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
  26. Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
  27. Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
  28. Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
  29. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586(2014).
  30. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793(2015).
  31. Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
  34. Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
  35. Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327(2018).
  36. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
  37. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273(2012).
  38. Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
  39. Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
  40. Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
  41. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  42. de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168(2021).
  43. Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
  44. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
  45. Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
  46. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
  47. Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
  48. Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415(2020).
  49. Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2(2018).
  50. Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239(2010).
  51. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  52. Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
  53. Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852(2021).
  54. Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lipid DropletsFiber Type AnalysisMyosteatosisIntramyocellular LipidConfocal MicroscopyBodipy StainingSubcellular DistributionImmunohistochemistryMuscle Cryosection

Gerelateerde artikelen