Gebruik maken van lage zuurstofspanning om hematopoëtische cellen in stromale celculturen van muizen beenmerg te verminderen

Samenvatting

Een routinematige kweek van stromale beenmergcellen (BMSC's) leidt tot de isolatie van heterogene celpopulaties, waarbij veel cellen van hematopoëtische oorsprong zijn. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van lage zuurstofspanning om hematopoëtische verontreinigingen in BMSC-culturen van muizen sterk te verminderen.

Samenvatting

Momenteel blijft er een gebrek aan universeel aanvaarde markers om prospectief een homogene populatie van skeletstamcellen (SSC's) te isoleren. Om deze reden worden BMSC's, die hematopoëse ondersteunen en bijdragen aan alle functies van het skelet, nog steeds veel gebruikt om multipotente mesenchymale voorlopercellen (MMP's) te bestuderen en om de SSC-functie af te leiden. Gezien de breedte van transgene muizenmodellen die worden gebruikt om musculoskeletale aandoeningen te bestuderen, dient het gebruik van BMSC's bovendien ook als een krachtig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die MMP's en SSC's reguleren. Gebruikelijke isolatieprocedures voor BMSC's bij muizen leiden er echter toe dat meer dan 50% van de herstelde cellen van hematopoëtische oorsprong is, wat de interpretatie van de tijdens deze onderzoeken gegenereerde gegevens mogelijk belemmert. Hier beschrijven we een methode waarbij gebruik wordt gemaakt van lage zuurstofspanning of hypoxie voor de selectieve eliminatie van CD45^+- cellen in BMSC-culturen. Belangrijk is dat deze methode gemakkelijk kan worden geïmplementeerd om niet alleen hemopoëtische verontreinigingen te verminderen, maar ook om het percentage MMP's en vermeende SSC's in BMSC-culturen te verbeteren.

Inleiding

Net als bij hematopoëtische stamcellen (HSC's), zijn SSC's gehuisvest in de micro-omgeving van het bot; in tegenstelling tot HSC's is er momenteel echter een gebrek aan universeel geaccepteerde celoppervlaktemarkers die kunnen worden gebruikt om SSC's prospectief te identificeren ^1,2,3. In vitro kweeksystemen en in vivo reconstitutietesten tonen echter aan dat een deel van de BMSC's het vermogen heeft om hematopoëse te ondersteunen, evenals het vermogen om te differentiëren in alle cellen van de mesenchymale lijnen ^4,5. Hoewel BMSC's een zeer heterogene populatie vertegenwoordigen, heeft een deel van deze cellen kenmerken van bonafide stamcellen, zoals gedefinieerd door hun vermogen om alle cellen van hun weefsel van oorsprong zichzelf te vernieuwen en te reconstrueren. Bovendien kunnen BMSC's, in tegenstelling tot het gebruik van celoppervlakmarkers, snel worden geïsoleerd op basis van hun snelle hechting aan weefselkweekplastic ^6,7. Om deze redenen worden BMSC's vaak gebruikt als surrogaat voor SSC's⁵.

Hoewel preferentiële hechting aan weefselkweekplastic (TC) is gebruikt om BMSC's met succes uit menselijk weefsel te isoleren, vormen muizenmodellen extra uitdagingen voor deze methode. Het meest opmerkelijk is dat, aangezien hematopoëtische cellen van muizen het vermogen hebben om zich aan zowel TC-plastic als aan BMSC's te hechten, een hoge hematopoëtische besmetting optreedt in dit modelsysteem, waardoor de interpretatie van de gegevens die met deze isolatiemethode worden gegenereerd, wordt belemmerd⁶.

BMSC's bevinden zich met name in de micro-omgeving van het bot, waar de zuurstofspanningen variëren van 1%-4%⁸. Onder standaard weefselkweekomstandigheden worden celkweekincubatoren echter op een atmosferisch zuurstofgehalte van 21% gehouden, wat neerkomt op suprafysiologische niveaus. Om de functionele betekenis van deze verschillen te benadrukken, wordt het kweken van cellen van mesenchymale oorsprong bij 21% zuurstof geassocieerd met verhoogde celdood ^9,10. Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat hematologische cellen en mesenchymale cellen differentieel reageren op lage zuurstofspanningen. Concreet is er een substantiële afname van het aantal CD45⁺ hematopoëtische cellen wanneer BMSC-culturen worden gehandhaafd bij lage zuurstofspanningen. We merkten inderdaad een vermindering van 90% op in CD45⁺ hematopoëtische cellen met behulp van deze techniek¹¹.

Hier delen we een protocol dat gemakkelijk kan worden geïmplementeerd voor laboratoria om hematopoëtische besmetting aanzienlijk te verminderen en om de zuiverheid van mesenchymale cellen te verbeteren tijdens routinematige kweek van BMSC's.

Protocol

Alle beschreven methoden met behulp van muizenmodellen werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (A187-19-08).

1. Dissectie van de achterpoten

1. Euthanaseer 10-12 weken oude mannelijke of vrouwelijke C57BL/6-muizen door CO 2-verstikking met behulp van een stroomsnelheid van 2-4 l/min, gevolgd door bevestiging van overlijden door onthoofding. In deze test kunnen zowel vrouwelijke als mannelijke muizen worden gebruikt zonder verwachte verschillen in de resultaten. Spuit de vacht in met 70% ethanol.
2. Gebruik een steriele chirurgische tang en schaar om een kleine incisie in de huid onder het borstbeen te maken. Gebruik de handen om de huid rond de omtrek van het lichaam te scheuren en trek de huid vervolgens distaal naar de achterpoten om het onderliggende weefsel bloot te leggen.
3. Gebruik een gesteriliseerde chirurgische tang en schaar om de achterpoot voorzichtig te verwijderen door de heupkop (bal) te scheiden van het acetabulum (kom) van het bekken (heup). Gebruik een steriele tang en een scalpel om voorzichtig langs de botten te schrapen om zoveel mogelijk zacht weefsel te verwijderen.
4. Gebruik een steriel scalpel om het dijbeen en het scheenbeen te scheiden met minimale weerstand om de ligamenten (laterale en mediale collaterale, voorste en achterste kruisband en patellapees [ligament]) die de twee botten met elkaar verbinden, door te snijden. Belangrijk is dat na scheiding de condylen op zowel het distale dijbeen als het proximale scheenbeen intact blijven.
5. Maak voor distale dijbenen een snede tussen de heupkop en de derde trochanter en een snede in de epifyse proximaal van de groeischijf, waardoor schade aan de groeischijf tot een minimum wordt beperkt.
6. Maak voor proximale tibiae een snede proximaal van de laterale malleolus en een snede distaal van het scheenbeenplateau net proximaal van de groeischijf.
7. Plaats de dijbenen en het scheenbeen met de snijkant naar beneden in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.

2. Isolatie van BMSC's uit dijbenen en scheenbenen

1. Plaats de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml in een tafelcentrifuge en draai gedurende 1 s op 10.000 x g bij 4 °C.
2. Gebruik een steriel pincet om de botten voorzichtig uit de microcentrifugebuisjes te verwijderen, waarbij een rode prop beenmerg op de bodem van de microcentrifugebuis achterblijft. Als er wat merg in de botschacht achterblijft, breng het bot dan over in een nieuwe buis, herhaal de snelle centrifuge en combineer de pellets in één buis tijdens de resuspensie Stap 2.3.
3. Gebruik een P1000-pipet om de mergpellet voorzichtig te resuspenderen in 500 μL groeimedia, MEMa aangevuld met 20% foetaal runderserum en 1.000 E/ml penicilline-streptomycine. Breng stromale beenmergcellen over naar een conische buis van 15 ml met 4,5 ml groeimedia.

3. Lysis van rode bloedcellen

1. Draai de cellen 5 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Zuig de groeimedia op en resustrien voorzichtig de pellet in 1,5 ml lysisbuffer van rode bloedcellen.
2. Incubeer 75-90 s bij kamertemperatuur. Blus onmiddellijk af met 10 ml groeimedia.
3. Draai de cellen 5 minuten lang af bij 300 x g bij 4 °C. Zuig de media op en suspendeer de pellet opnieuw in 10 ml groeimedia om te tellen (zie stap 4).
   OPMERKING: De celkorrel mag niet langer rood maar wit zijn, wat wijst op een succesvolle lysis van rode bloedcellen. Als de pellet nog steeds rood is, kan een extra ronde lysisbuffer van rode bloedcellen worden uitgevoerd.

4. BMSC's plateren

1. Om levende cellen voor plating te tellen, verwijdert u 10 μl celsuspensie en voegt u 10 μl Trypan Blue-oplossing toe.
2. Plaats 10 μL cel:Trypan Blue-oplossingsmengsel op een hemocytometer en tel de levensvatbare (niet-blauwe) cellen. De meeste cellen zouden trypanblauw moeten uitsluiten.
3. Voor kolonietesten worden de cellen met een dichtheid van 60.000 cellen/^cm2 in weefselkweekkolven T-25^cm2 geplateerd. Voor BMSC-culturen met een hoge dichtheid worden cellen met een dichtheid van 130.000 cellen/^cm2 in 100^mm2 weefselkweekschaaltjes geplaatst. Gebruik een totaal volume van 5 ml voor T-25 cm² kolven en een totaal volume van 10 ml voor^{100 cm 2} schalen.
4. Incubeer de cellen gedurende 3 uur bij 1%-2% (hypoxie) of 21% zuurstof (normoxie) en 5% CO₂. Voor routinematige kweek van BMSC's bij lage zuurstofspanningen kan een hypoxische celincubator of een hypoxiekamer worden gebruikt. Stel elk instrument in volgens de instructies van de fabrikant, zodat de gasstroom van stikstof en kooldioxide resulteert in het gewenste bereik van zuurstof en CO₂.
5. Spoel de platen na 3 uur 3x voorzichtig af met 1x PBS. Om te voorkomen dat cellen die zich beginnen te hechten worden verstoord, spoelt u voorzichtig af door het aanzuigen en pipetteren op de zijkant van de weefselkweekschaaltjes te vertragen.
6. Vervang na de laatste 1x PBS-spoeling de PBS door 10 ml groeimedia bij gebruik van 100 cm² schaaltjes of 5 ml groeimedia bij gebruik van T-25cm² kolven. Na het spoelen moeten de meeste drijvende cellen worden verwijderd.

5. BMSC's in hypoxische omstandigheden houden

1. Bewaar voor hypoxische culturen cellen in een hypoxiekamer of incubator die is ingesteld op 1%-2% O₂ en 5% CO₂. Houd voor normoxische culturen de cellen op 21% O₂ en 5% CO_2. Als u een hypoxische couveuse gebruikt, zorg er dan voor dat de deuren minimaal worden geopend om instroom van zuurstof uit de lucht te voorkomen (21%). Vervang de media elke 2-3 dagen.
2. Incubeer de cellen voor kolonietests gedurende 7-10 dagen, waarna de kolonies worden opgesomd of wordt begonnen met differentiatie of andere gewenste tests. Onder hypoxische omstandigheden kunnen tussen de 50-120 kolonies worden verwacht, terwijl onder normoxische omstandigheden tussen de 5-30 kolonies kunnen worden verwacht.
3. Voor BMSC-culturen met hoge dichtheid worden de cellen geïncubeerd tot ze confluent zijn, ongeveer 7-10 dagen voor hypoxische culturen en ongeveer 14-21 dagen voor normoxische culturen. Eenmaal confluent, trypsiniseer de cellen met 0,25% trypsine voor gebruik in de gewenste testen.
4. Om de cellen te visualiseren, plaatst u de weefselkweekschaal op een podium, draait u het fase-objectief in het optische pad en zorgt u ervoor dat de fasecontrastschuifregelaar is geselecteerd voor het bijbehorende objectief. Bekijk de cellen met een vergroting van 100x of 200x.

Resultaten

Na 7 dagen celisolatie zijn cellen gekweekt met 21% zuurstof zeer heterogeen. Concreet is er een grote variatie in grootte, met grotere bipolaire cellen op afstand van kleinere cellen die meerdere uitsteeksels bevatten (Figuur 1A). Cellen die in hypoxische omstandigheden worden gekweekt, zijn daarentegen zeer homogeen. Cellen in kolonies zijn relatief vergelijkbaar in grootte en hebben een bipolair uiterlijk, dat lijkt op andere cellen van mesenchymale oorsp...

Discussie

Op basis van onze observaties hechten BMSC's zich eerder aan weefselkweekplastic dan macrofagen en andere cellen van hemopoëtische oorsprong¹¹. Om deze reden is het spoelen van platen 3 uur na het plateren een cruciale stap, omdat hierdoor zwevende hematopoëtische cellen worden verwijderd die het potentieel hebben om latere tijdstippen te hechten. Bovendien moeten deze spoelingen met zorg worden uitgevoerd, met name door media op de zijkant van de schaal te pipett...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100mm2 weefselkweekschalen	Corning	353003
1x Fosfaatgebufferde Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Bright-Line hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Gekarakteriseerd	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosides	Gibco	12571-063
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  weefselkweekflacons	Corning	430168
Trypan Blauw Oplossing	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0,25%), fenol rood	Gibco	25200-056