Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ubiquinone (CoQ) pools in het binnenste mitochondriale membraan (IMM) zijn gedeeltelijk gesegmenteerd tot complexe I- of FAD-afhankelijke enzymen. Een dergelijke onderverdeling kan gemakkelijk worden beoordeeld door een vergelijkende test met NADH of succinaat als elektronendonor in bevroren ontdooide mitochondriën, waarin cytochroom c (cyt c) reductie wordt gemeten. De test is gebaseerd op het effect van Na + op de IMM, waardoor de vloeibaarheid ervan afneemt. Hier presenteren we een protocol om NADH-cyt c oxidoreductase-activiteit en succinaat-cyt c oxidoreductase-activiteiten te meten in aanwezigheid van NaCl of KCl. De reacties, die afhankelijk zijn van het mengsel van reagentia in een cuvette stapsgewijs, worden gedurende 4 minuten spectrofotometrisch gemeten in aanwezigheid van Na+ of K+. Hetzelfde mengsel wordt parallel uitgevoerd in aanwezigheid van de specifieke enzymremmers om de niet-specifieke verandering in absorptie af te trekken. Nadh-cyt c oxidoreductase activiteit neemt niet af in de aanwezigheid van een van deze kationen. De activiteit van succinaat-cyt c oxidoreductase neemt echter af in de aanwezigheid van NaCl. Dit eenvoudige experiment benadrukt: 1) het effect van Na + bij het verminderen van IMM-vloeibaarheid en CoQ-overdracht; 2) dat supercomplex I+III2 de overdracht van ubiquinon (CoQ) beschermt tegen beïnvloeding door verlaging van de IMM-vloeibaarheid; 3) dat CoQ-overdracht tussen CI en CIII functioneel verschilt van CoQ-overdracht tussen CII en CIII. Deze feiten ondersteunen het bestaan van functioneel gedifferentieerde CoQ-pools in de IMM en tonen aan dat ze kunnen worden gereguleerd door de veranderende Na + -omgeving van mitochondriën.
Inleiding
Mitochondriaal oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) is de belangrijkste route die adenosinetrifosfaat (ATP) synthese, reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie en consumptie van reducerende equivalenten, zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) of succinaat, door mitochondriën aandrijft. OXPHOS-systeem bestaat uit vijf eiwitcomplexen: Complex I (CI) oxideert NADH en reduceert CoQ tot ubiquinol (CoQH2). Complex II (CII) oxideert succinaat tot fumaraat en reduceert CoQ tot CoQH2. Complex III (CIII) oxideert CoQH2 terug tot CoQ, waardoor cytochroom c (cyt c) wordt verminderd. Ten slotte oxideert complex IV (CIV) cyt c en reduceert zuurstof tot water. Deze oxidoreductieketen, de zogenaamde elektronentransportketen (mETC), is gekoppeld aan het pompen van H+ over de IMM, waardoor een elektrochemische gradiënt ontstaat die door complex V (CV) wordt gebruikt om adenosinedifosfaat (ADP) in ATP te fosforyleren.
mETC-complexen kunnen alleen in de IMM zijn of zich samenvoegen tot quaternaire structuren die supercomplexen worden genoemd. CIV kan assembleren met CIII, waardoor het III2+IV of Q-respirasoom ontstaat (omdat het kan ademen in aanwezigheid van CoQH2)1,2,3 of homodimeren of homooligomeren4 vormt. CIII kan interageren met CI en vormt het supercomplex I+III25. Ten slotte is CI ook in staat om te interageren met het Q-respirasoom, waarbij het I + III2 + IV of N-respirasoom wordt gebouwd (omdat het kan ademen met NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ en cyt c zijn mobiele elektronendragers die verantwoordelijk zijn voor de overdracht van elektronen van CI/CII naar CIII en van CIII naar CIV. Of supercomplexen al dan niet een functionele lokale beperking opleggen voor deze dragers is de afgelopen twee decennia een kwestie van intens debat geweest 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Verschillende onafhankelijke groepen hebben echter aangetoond dat CoQ en cyt c functioneel kunnen worden gesegmenteerd in pools in de IMM. Met betrekking tot de CoQ kan het functioneel worden gesegmenteerd in een specifieke CoQ-pool voor CI (CoQNAD) en een andere pool gewijd aan FAD-afhankelijke enzymen (CoQFAD)1,7,12,18,19. Om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te differentiëren, waren echter de overexpressie van het alternatieve oxidase (AOX) en de generatie van specifieke mtDNA-mutanten, die CI kunnen assembleren in afwezigheid van CIII, vereist 1,19,20.
Het mechanisme van reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie tijdens hypoxie was tot voor kort onbekend. Bij acute hypoxie ondergaat CI de actieve/deactieve (A/D) overgang, waarbij de H+ pompende NADH-CoQ oxidoreductase activiteit afneemt. Een dergelijke afname van H + pompen verzuurt de mitochondriale matrix en lost gedeeltelijk de calciumfosfaatprecipitaten op in de mitochondriale matrix, waardoor oplosbare Ca2+ vrijkomt. Deze toename van oplosbaar Ca2+ activeert de Na+/Ca2+ wisselaar (NCLX), die Ca2+ extrudeert in ruil voor Na+. Mitochondriale Na + -toename interageert met fosfolipiden in de binnenkant van de IMM, waardoor de vloeibaarheid en CoQ-overdracht tussen CII en CIII afnemen en uiteindelijk superoxide-anion wordt geproduceerd, een redoxsignaal21. Interessant is dat CoQ-overdracht alleen werd verminderd tussen CII en CIII, maar niet tussen CI en CIII, wat benadrukt dat 1) Na + in staat was om slechts één van de bestaande CoQ-pools in de mitochondriën te moduleren; 2) er bestaan functioneel gedifferentieerde CoQ-pools in de IMM. Zo kan een veelgebruikt protocol voor de studie van mitochondriale enzymactiviteiten worden gebruikt om het bestaan van de genoemde CoQ-pools te beoordelen.
Het huidige protocol is gebaseerd op de meting van de reductie van geoxideerde cyt c, het substraat van CIII, door absorptie in aanwezigheid van succinaat (d.w.z. CII-substraat) of NADH (d.w.z. CI-substraat). Hetzelfde monster is verdeeld in tweeën, waarvan er één zal worden behandeld met KCl en de andere met dezelfde concentratie NaCl. Op deze manier, gezien het feit dat Na + de IMM-vloeibaarheid vermindert, als CoQ in een unieke pool in de IMM zou bestaan, zouden zowel CI + CIII als CII + CIII afnemen in de aanwezigheid van Na +. Als CoQ echter zou bestaan in gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools, zou het effect van Na+ meestal (of alleen) duidelijk zijn op de CII+CIII-activiteit, maar niet op de CI+CIII. Zoals onlangs gepubliceerd21, heeft Na+ alleen invloed op de CoQ-overdracht tussen CII en CIII (figuur 1C,D), maar niet tussen CI en CIII (figuur 1A,B).
Dit protocol, samen met een arsenaal aan technieken, is gebruikt om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools in de IMM te bevestigen, een gewijd aan CI (d.w.z. CoQNAD) en een andere gewijd aan FAD-gekoppelde enzymen (d.w.z. CoQFAD)1,3,7; een constatering die, hoewel er nog steeds overwordt gedebatteerd 22, onafhankelijk van elkaar is bevestigd door verschillende groepen 7,19. De superassemblage van CI in supercomplexen heeft dus invloed op de lokale mobiliteit van CoQ, waardoor het gebruik ervan door de CIII binnen het supercomplex 1,7,13,14,23,24,25 wordt vergemakkelijkt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spanje, in overeenstemming met de richtlijn van de Europese Unie van 22 september 2010 (2010/63/UE) en met het Spaanse koninklijk besluit van 1 februari 2013 (53/2013). Alles werd in het werk gesteld om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren.
OPMERKING: Deze vergelijkende test om de segmentatie van mitochondriale CoQ-pools te bestuderen, wordt als volgt beschreven:
1. Eiwitkwantificering
- Vries en ontdooi de geïsoleerde mitochondriën26 van een wildtype muizenlever drie keer (d.w.z. mitochondriale membranen) voordat wordt geëxperimenteerd om de organellen doorlaatbaar te maken voor de reactiesubstraten.
- Kwantificeer de eiwithoeveelheid van het geïsoleerde mitochondriënmonster met Bradford- of Bicinchoninic Acid (BCA) -methoden. Voeg in het geval van Bradford 2 μL monster toe aan 1 ml 1x Bradford-reagens.
- Splits het monster in vier subsamples van elk 20 μg (namelijk: A, B, C, D; Figuur 2A).
2. Ci+CIII activiteit meten
OPMERKING: Dit deel van het protocol gebruikt de monsters A en B om de CI+CIII-activiteit te meten (figuur 2B).
- Splits monsters A en B in twee subsamples van elk 10 μg (namelijk A1, A2, B1 en B2). Meng elk van de subsamples in een cuvette van 1 ml met 30 μl cyt c (10 mg/ml), 10 μl 100 mM malonaat en voeg voorverwarmde C1/C2-buffer (tabel 1) toe bij 37 °C tot 980 μL (979 μL voor cuvetten A2 en B2).
LET OP: Deze stap omvat het gebruik van de toxische reagentia malonaat en kaliumcyanide.
OPMERKING: cyt c (10 mg/ml) moet vers worden bereid door 10 mg cyt c te mengen in 1 ml K2HPO4-oplossing , pH aangepast tot 7,2, en moet gedurende het hele experiment in ijs worden gehouden. - Voeg 10 μL van 1 M KCl toe aan cuvetten A1 en A2 en voeg 10 μL van 1 M NaCl toe aan cuvetten B1 en B2.
- Voeg 1 μL van 1 mM rotenon toe aan het cuvet met subsamples A2 en B2.
LET OP: Deze stap omvat het gebruik van het giftige reagens rotenon. - Voeg vlak voor de meting 10 μL NADH (10 mM) toe aan alle cuvetten.
OPMERKING: De 10 μL wordt bij voorkeur toegevoegd aan de stap van de cuvette, zodat de reactie begint bij het mengen. - Meng de cuvette door hem drie keer voorzichtig om te draaien. Plaats het in de absorptie cuvette lezer (UV/VISJASCO spectrofotometer).
- Klik op Meten > parameters > Algemeen en stel de meetparameters in op Golflengte: 550 nm en Tijd: 4 minuten lezen; druk op de knoppen Accepteren en Starten om het experiment te starten.
- Sla aan het einde van de meting de helling op die bestaat uit de lineaire toename van de absorptie door op Bestand en Opslaan als te klikken. De helling kan ook handmatig worden verzameld.
3. Cii+CIII activiteit meten
OPMERKING: Dit deel van het protocol gebruikt de monsters C en D om de CII+CIII-activiteit te meten (figuur 2C).
- Splits monsters C en D in twee subsamples van elk 10 μg (namelijk C1, C2, D1 en D2). Meng elk van de subsamples in een cuvette van 1 ml met 30 μl cyt c (10 mg/ml), 1 μl rotenon van 1 mM en voeg voorverwarmde C1/C2-buffer toe bij 37 °C tot 980 μL (970 μL voor cuvetten C2 en D2).
LET OP: Deze stap omvat het gebruik van de giftige reagentia kaliumcyanide en rotenon.
OPMERKING: cyt c (10 mg/ml) moet vers worden bereid door 10 mg cyt c te mengen in 1 ml K2HPO4-oplossing , pH aangepast tot 7,2, en moet gedurende het hele experiment in ijs worden gehouden. - Voeg 10 μL van 1 M KCl toe aan cuvetten C1 en C2 en voeg 10 μL van 1 M NaCl toe aan cuvetten D1 en D2.
- Voeg 1 μL van 1 mM antimycine A toe aan de cuvette met subsamples C2 en D2.
LET OP: Deze stap omvat het gebruik van het toxische reagens antimycine A. - Voeg vlak voor de meting 10 μL succinaat (1 M) toe aan alle cuvetten.
OPMERKING: De 10 μL wordt bij voorkeur toegevoegd aan de stap van de cuvette, zodat de reactie begint bij het mengen. - Meng de cuvette voorzichtig en draai hem drie keer om. Plaats het in de absorptie cuvette lezer (UV/ VIS spectrofotometer).
- Klik op Meten > parameters > Algemeen en stel de meetparameters in op Golflengte: 550 nm en Tijd: 4 minuten lezen; druk op de knoppen Accepteren en Starten om het experiment te starten.
- Sla aan het einde van de meting de helling op die bestaat uit de lineaire toename van de absorptie door op Bestand en Opslaan als te klikken. De helling kan ook handmatig worden verzameld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Typische resultaten van dit protocol zijn hieronder weergegeven (figuur 3). Aangezien de verminderde cyt c-absorptie zich bij 550 nm bevindt, moeten alle onbevangen subsamples een toename van de absorptie bij 550 nm vertonen. Geremde subsamples vertonen idealiter een vlakke lijn of licht toenemende helling (figuur 3). Hellingen van geremde subsamples moeten worden afgetrokken van ongeremde subsamples.
Monsters A en B, beide gecorrigee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel dit protocol een zeer eenvoudige procedure vertegenwoordigt om het bestaan van de gedeeltelijk gesegmenteerde CoQ-pools te identificeren, zijn er een paar kritieke stappen om rekening mee te houden. Substraten (d.w.z. NADH of succinaat) worden bij voorkeur als laatste toegevoegd, omdat autooxidatie van deze verbindingen kan optreden. Cuvette moet voorzichtig zijn om de vorming van bubbels te voorkomen die de meting kunnen verstoren.
Bovendien biedt de huidige techniek een paar beperking...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez en E. R. Martínez-Jimenez voor technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door MICIN: RTI2018-099357-B-I00 en HFSP (RGP0016/2018). Het CNIC wordt ondersteund door het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) en de Pro CNIC Foundation en is een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figuur 2 gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford-eiwittest | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochroom c uit paardenhart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonzuur | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Kaliumcyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | versie 2 | |
| Spectrofotometer | UV/VIS JASCO | ||
| Succinaat | Sigma-Aldrich | 398055 |
Referenties
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290(2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
