Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Summary

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Abstract

Verschillende technieken zijn gebruikt voor de directe visualisatie van cytoskeletale filamenten en de bijbehorende eiwitten. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopie heeft een hoge signaal-achtergrondverhouding, maar lijdt aan fotobleaching en fotoschade van de fluorescerende eiwitten. Labelvrije technieken zoals interferentiereflectiemicroscopie (IRM) en interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT) omzeilen het probleem van fotobleaching, maar kunnen afzonderlijke moleculen niet gemakkelijk visualiseren. Dit artikel presenteert een protocol voor het combineren van IRM met een commerciële TIRF-microscoop voor de gelijktijdige beeldvorming van microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) en dynamische microtubuli in vitro. Dit protocol maakt snelle observatie mogelijk van MAPs die interageren met dynamische microtubuli. Dit verbetert bestaande tweekleurige TIRF-opstellingen door zowel de noodzaak van microtubule-etikettering als de noodzaak van verschillende extra optische componenten, zoals een tweede excitatielaser, te elimineren. Beide kanalen worden op dezelfde camerachip weergegeven om problemen met beeldregistratie en framesynchronisatie te voorkomen. Deze opstelling wordt gedemonstreerd door het visualiseren van enkele kinesinemoleculen die op dynamische microtubuli lopen.

Introduction

Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopie wordt vaak gebruikt voor de visualisatie van enkele fluorescerende moleculen. In vergelijking met epifluorescentiebeeldvorming bereikt TIRF superieure achtergrondonderdrukking, waardoor lokalisatie met hoge resolutie en tracking van enkele fluoroforen mogelijk is. Om deze reden is TIRF de voorkeursmethode voor het visualiseren van fluorescerend gelabelde microtubule-geassocieerde eiwitten en wordt het vaak gebruikt om microtubuli in beeld te ^{brengen 1,2}.

Om de regulatie van microtubuledynamica door MAPs te onderzoeken, is het vaak nodig om zowel microtubuli als MAPs tegelijkertijd in beeld te brengen. De meeste bestaande methoden voor dit doel zijn duur of lijden aan technische nadelen. Simultane tweekleurige TIRF vereist bijvoorbeeld twee excitatielasers en twee camera's. Naast de hoge kosten levert de behoefte aan aparte camera's framesynchronisatie en beeldregistratieproblemen op. Deze behoefte kan worden omzeild als een roterende filterkubus wordt gebruikt om fysiek te schakelen tussen excitatielasers in opeenvolgende frames³. In zo'n opstelling kan een enkele camerachip worden gebruikt en wisselen de frames af tussen beelden van microtubuli en MAPs. Deze techniek wordt echter beperkt door de snelheid van de filterwissel, die de framesnelheid doorgaans beperkt tot minder dan 0,5 frames per seconde³ (fps). Een dergelijke framesnelheid is onvoldoende om snelle dynamische processen op te lossen, zoals de krimp van een microtubuli met een snelheid tot 500 nm/s, het lopen van een kinesine met een snelheid in de orde van grootte van 800 nm/s, of de diffusie van een MAP die optreedt met diffusiecoëfficiënten van meer dan 0,3 μm²/s⁴. Dit is met name problematisch bij het volgen van de relatieve posities van twee bewegende doelen in elk kanaal, zoals de positie van een MAP ten opzichte van de positie van een bewegende microtubule tip⁵.

Naast deze optische beperkingen vereist tweekleurige TIRF-microscopie dat MAPs en microtubuli worden gelabeld met verschillende fluoroforen waarvan de emissiespectra voldoende gescheiden zijn. Fluorescerende etikettering van tubuline kan de microtubule-dynamiek⁶ veranderen en het fotobleachen van fluoroforen beperkt de beeldvormingssnelheid⁷. Vanwege deze problemen zijn labelvrije beeldvormingstechnieken ontwikkeld om microtubuli te visualiseren. Deze omvatten interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT)^8,9, rotating-coherent-scattering microscopie (ROCS)¹⁰, spatial light interference microscopy (SLIM)¹¹ en interference reflection microscopy (IRM)^12,13. Deze technieken maken snelle labelvrije beeldvorming van microtubuli mogelijk zonder de nadelen van fluorescentiebeeldvorming, maar ze kunnen niet worden gebruikt om afzonderlijke MAPs te visualiseren.

Van deze labelvrije technieken onderscheidt IRM zich door zijn lage kosten en zijn bescheiden eisen aan instrumentatie. We hebben onlangs een protocol gepresenteerd voor het combineren van IRM met een commerciële TIRF-microscoop, waardoor microtubuli en fluorescerende MAPs in afwisselende frames kunnen worden afgebeeld ^3,13. Dit artikel presenteert een protocol voor het wijzigen van deze opstelling om tegelijkertijd TIRF- en IRM-beelden vast te leggen op een enkele camerachip. Dit omvat de toevoeging van een goedkope bundelsplitser in het excitatiepad om het monster tegelijkertijd te verlichten met een TIRF-laser en een IRM LED-lichtbron. Een gemodificeerde commerciële beeldsplitter wordt gebruikt om de TIRF- en IRM-signalen spectraal te scheiden en te projecteren op afzonderlijke helften van dezelfde camerachip. We maken ook gebruik van een microfluïdisch systeem dat de snelle uitwisseling van reagentia tijdens beeldvorming mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft hoe deze opstelling kan worden gebruikt om dynamische microtubuli en MAPs in beeld te brengen. Het vermogen van het apparaat wordt gedemonstreerd door de eerste visualisatie van kinesine-1-eiwitten te presenteren die op krimpende microtubuli lopen, die wordt vastgelegd met een framesnelheid van 10 ^s-1.

Protocol

1. Voorbereiding van stroomkamers

OPMERKING: Microfluïdische flowkamers worden geconstrueerd door polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanalen te hechten aan een gereinigd en gefunctionaliseerd afdekglas. De microkanalen worden gegoten in een meestermal.

1. Voorbereiding van PDMS-kanalen
   1. Bereid gereinigde en/of gefunctionaliseerde afdekglazen voor met een oppervlaktechemie die geschikt is voor de specifieke test die wordt afgebeeld.
      OPMERKING: Voor kinesinemotiliteitstests worden piranha-gereinigde silanized coverglazen gebruikt. Deze worden bereid zoals beschreven in Gell et. ^al.1 Als alternatief is een eenvoudigere procedure om afdekglazen in isopropanol te soniceren, gevolgd door methanol gedurende 3x 20 min cycli.
   2. Om een hoofdmal voor te bereiden, snijdt u stroken enkelzijdige stationaire tape tot de gewenste grootte van het stroomkanaal. Plak de stroken op de bodem van een petrischaaltje van 10 cm en schik ze naast elkaar met een afstand van ten minste 1 cm tussen de strips.
      OPMERKING: Als nauwkeurige kanaalafmetingen vereist zijn, kan de mal worden vervaardigd op siliciumwafers met behulp van fotolithografie¹⁴.
   3. Om het PDMS-polymeer te bereiden, combineert u het uithardingsmiddel en het basiselastomeer in een massaverhouding van 1:10. Meng gedurende 2 min.
      OPMERKING: Deze mengverhouding kan worden gevarieerd om de stijfheid van het polymeer af te stemmen. Een hogere verhouding van base tot uithardingsmiddel resulteert in een zachter polymeer.
   4. Ontgas het mengsel in een vacuümkamer totdat alle bubbels verdwijnen.
   5. Giet het mengsel op de hoofdvorm in een laag van ~ 0,5 cm dik en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.
   6. Bak het mengsel in een voorverwarmde oven op 70 °C gedurende 40 min.
      OPMERKING: Een langere uithardingstijd kan nodig zijn als het PDMS-blok dik is (>1 cm). Blijf in stappen van 5 minuten verwarmen totdat het volledig is uitgehard.
   7. Knip de gestructureerde gebieden van het polymeer uit. Pons gaten aan elk uiteinde van het kanaal met behulp van een PDMS-ponser.
      OPMERKING: In dit protocol is de gatdiameter ingesteld op 0,75 mm en kan deze worden aangepast aan de vereiste stroomsnelheden. PDMS-kanalen kunnen gedurende langere tijd in droge omgevingen worden opgeslagen, maar moeten vóór gebruik worden gereinigd.
   8. Reinig de gestructureerde kant van het PDMS-blok. Gebruik stationaire tape om grote deeltjes te verwijderen. Afspoelen met isopropanol en vervolgens methanol. Herhaal deze spoelingen 3x, spoel af met ultrapuur water en föhn het oppervlak.
   9. Plasma reinigt het PDMS met behulp van zuurstof- of luchtplasma.
      OPMERKING: In dit protocol wordt 18 W luchtplasma gebruikt.
   10. Plaats het plasma gereinigde PDMS op een goed gereinigd afdekglas en verwarm gedurende 15 minuten op een kookplaat bij 80 °C.
       OPMERKING: Epoxyhars kan op de zijkanten van het PDMS-blok worden aangebracht om het beter op het afdekglas te hechten.
   11. Plaats de op de juiste grootte zijnde polyethyleenbuizen met lage dichtheid (LDPE) in de gaten. Sluit de uitlaatslang aan op een spuit van 0,5 ml.
       OPMERKING: In dit protocol worden buizen met een binnendiameter van 0,023 inch aangesloten op het PDMS via een metalen adapter met een buitendiameter van 0,025 inch.
   12. Stroomoplossingen in de microkanalen door de inlaatbuis in de oplossing onder te dompelen en het vereiste volume met de spuit op te zuigen.

2. Optische installatie

1. Modificatie van de microscoop (figuur 1)
   1. Wijzig een TIRF-microscoop om IRM-beeldvorming¹³ mogelijk te maken. Vervang de 50/50 (Reflectance (R)/Transmission (T)) beam splitter die in het filterwiel van de microscoop wordt gebruikt door een 10/90 (R/T) beam splitter.
   2. Plaats een beeldsplitser tussen de camera en de microscoop.
   3. Plaats in de filterkubus van de beeldsplitter een 10/90 (R/T) bundelsplitser. Plaats een 600 nm langdoorlaatfilter voor de gereflecteerde bundel en een geschikt fluorescentie-emissiefilter voor de uitgezonden bundel.
      OPMERKING: Beam splitters met verschillende R/T-verhoudingen kunnen worden gebruikt om de fracties van de IRM- en TIRF-emissielamp die worden opgevangen af te stemmen.
   4. Lijn de beeldsplitser uit volgens de specificaties van de fabrikant om de TIRF- en IRM-signalen op de camerachip ruimtelijk te scheiden.
      OPMERKING: Ruimtelijke scheiding van de signalen is vereist omdat het TIRF-signaal van typische fluoroforen veel zwakker is dan het IRM-signaal van een microtubuli en niet detecteerbaar zou zijn als de twee signalen over elkaar heen lagen.

3. Beeldvorming van dynamische microtubuli en enkele Kinesine-moleculen

1. Oppervlakte functionalisatie en passivering
   1. Stroom BRB80 buffer (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, getitreerd tot pH 7,8 met NaOH) in de reactiekamer.
   2. Stroom antibiotine oplossing verdund tot 0,025 mg/ml in BRB80 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
   3. Was het kanaal met de BRB80.
   4. Stroom in F-127-oplossing (1% Pluronic F-127 (w/v) opgelost in BRB80 gedurende één nacht) en incubeer gedurende ten minste 20 minuten voor oppervlaktepassivering.
      OPMERKING: Als gemakkelijk te reinigen afdekglazen worden gebruikt in plaats van silanized coverglazen, passiveer dan met 2 mg / ml caseïne in BRB80 gedurende >20 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Was het kanaal met de BRB80.
2. Voorbereiding op beeldvorming
   1. Als temperatuurregeling vereist is, gebruikt u een objectieve verwarming en stelt u deze in op de juiste temperatuur.
      OPMERKING: In dit protocol worden alle experimenten uitgevoerd bij 28 °C.
   2. Plaats het monster op het microscoopstadium en schakel de epiilluminatielichtbron (>600 nm) in voor IRM-beeldvorming.
      OPMERKING: In dit protocol wordt een witte LED-lichtbron gebruikt met een 600 nm langdoorlaatfilter.
   3. Richt de microscoop op het monsteroppervlak. Zoek naar het juiste brandpuntsvlak in de buurt van de PDMS-oplossingsinterface.
      OPMERKING: In IRM zou de waterige binnenkant van het kanaal er veel helderder uit moeten zien dan het PDMS-polymeer.
   4. Kies een gezichtsveld in de buurt van het midden van het kanaal.
   5. Bereid een oplossing van 0,1 μm fluorescerende microbeads in BRB80 (dichtheid: 10⁹ kralen/ml, wat overeenkomt met een 200-voudige verdunning voor de kralen die in dit protocol worden gebruikt).
   6. Stroom in ten minste één kanaalvolume van de microbead-oplossing.
   7. Monitor de reactie via IRM. Wacht tot de microbeads geleidelijk aan op het oppervlak "landen". Wanneer de gewenste dichtheid van microbeads is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80.
3. Groeiende gebiotinyleerde guanylyl 5'-α,β-methyleendifosfonaat (GMPCPP)-gestabiliseerde microtubulizaden
   1. Bereid in een centrifugebuis van 0,6 ml 50 μL van een oplossing met 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl₂ en 2 μM gebiotinyleerde tubuline (5-10% etiketteringstoichiometrie) in BRB80.
      OPMERKING: De juiste etiketteringsstoichiometrie kan worden bereikt door biotinyleerde tubuline met hoge dichtheid te combineren met ongelabelde rundertubuline in de juiste verhouding.
   2. Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten op ijs en incubeer vervolgens gedurende 12,5 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: De lengte van de zaden kan worden geregeld door de polymerisatietijd af te stemmen.
   3. Stop de polymerisatie door 100 μL kamertemperatuur BRB80 toe te voegen.
   4. Draai de oplossing in een ultracentrifuge bij kamertemperatuur (126.000 x g, 5 min). Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet om niet-geplymeriseerde tubuline te verwijderen.
      OPMERKING: In dit protocol wordt een luchtaangedreven ultracentrifuge gebruikt.
   5. Voeg 200 μL BRB80 bij kamertemperatuur toe aan de pellet. Resuspend de pellet door voorzichtig maar grondig te pipetteren. Gebruik een pipet van 200 μL met een snijpunt om het afschuiven van de microtubuli te verminderen.
4. Groeiende dynamische guanosine difosfaat (GDP)-tubuline "uitbreidingen"
   OPMERKING: De zaden worden geïmmobiliseerd op het antibiotineoppervlak van het stroomkanaal. Dynamische GTP/GDP "uitbreidingen" zullen worden gekweekt vanaf de uiteinden van de geïmmobiliseerde zaden.
   1. Verdun de zaden 20x in BRB80. Laat de verdunde zaden in de reactiekamer stromen.
   2. Monitor de reactie via IRM. Wacht tot de zaden geleidelijk op het oppervlak "landen" en eraan binden. Wanneer de gewenste dichtheid van zaden is bereikt, spoelt u het teveel uit met BRB80.
   3. Bereid een microtubule-uitbreidingsmengsel: 12 μM ongelabelde tubuline, 1 mM GTP, 5 mM dithiothreitol (DTT) in BRB80-buffer.
   4. Stroom in ten minste één kanaalvolume van het uitbreidingsmengsel. Zorg ervoor dat de reactietemperatuur 28 °C is.
   5. Wacht tot de microtubule-extensies na verloop van tijd uit de zaden groeien.
      OPMERKING: De steady-state lengte wordt meestal bereikt in minder dan 20 minuten.
   6. Gebruik de dynamische microtubuli voor beeldvorming. Voeg fluorescerende MAPs toe en visualiseer deze op de microtubuli, zoals beschreven in stap 3.5 voor kinesine-1.
      OPMERKING: Omdat de microtubuli oppervlaktegebonden zijn, zijn ze gemakkelijk zichtbaar door TIRF.
5. Kinesinemotiliteitstest
   OPMERKING: Deze stap beschrijft een protocol voor het visualiseren van beweeglijk groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld kinesine-1 op krimpende microtubuli. Een afgeknotte rat kinesine-1-constructie gefuseerd met eGFP (rKin430-eGFP) werd uitgedrukt en gezuiverd, zoals eerder beschreven^15,16.
   1. Motiliteitsbuffer bereiden: 1 mM ATP en 0,2 mg/ml caseïne in BRB80.
   2. Verdun kinesine-eGFP in motiliteitsbuffer tot 10 nM.
   3. Bereid een 2x zuurstof aaseteroplossing om oxidatieve fotobleaching tegen te gaan (80 mM glucose, 80 mg/ml glucoseoxidase, 32 mg/ml catalase, 0,2 mg/ml caseïne, 20 mM DTT) aangevuld met 2 mM ATP.
   4. Combineer 10 delen zuurstofvanger, 9 delen BRB80 en 1 deel 10 nM kinesine-eGFP voor een uiteindelijke kinesineconcentratie van 0,5 nM.
      OPMERKING: Het totale volume moet minstens 1,5 keer groter zijn dan het kanaalvolume.
   5. Stel de beeldinstellingen in op de microscoopsoftware.
      OPMERKING: In dit protocol worden video's opgenomen met 10 fps met een belichtingstijd van 100 ms. De laserintensiteit is ~0,05 kW/cm².
   6. Begin met het afbeelden en laat de kinesine-oplossing in de kamer stromen.
   7. Nadat de meting is voltooid, neemt u een korte (~ 5 s) video op waarin het podium langzaam wordt vertaald in een cirkelvormige of laterale beweging. Gebruik de mediane projectie van deze video als achtergrondafbeelding en trek deze af van de onbewerkte metingen.

4. Beeldverwerking en -analyse

OPMERKING: Beeldverwerking werd uitgevoerd met behulp van NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Er is een macro ontwikkeld om het splitsen en uitlijnen van de TIRF- en IRM-kanalen te automatiseren. Voor deze macro moet de GaussFit_OnSpot plug-in worden geïnstalleerd (beschikbaar op de ImageJ plugins repository).

1. Maak vanuit de achtergrondopname een mediane projectie in ImageJ door op Image | Stapels | Z-project.
2. Trek de mediane achtergrondprojectie af van de onbewerkte afbeeldingsgegevens door op Proces | Beeldcalculator.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de optie "32-bits (float) resultaat" aanvinkt.
3. Kies voor beeldregistratie een verzameling microbeads in de buurt van de microtubule van belang en gebruik ze om de TIRF- en IRM-afbeeldingen uit te lijnen.
4. Gebruik voor elke kraal in deze verzameling het meerpuntsselectiegereedschap om de geschatte locatie in het TIRF-kanaal en vervolgens de overeenkomstige locatie in het IRM-kanaal te markeren.
   OPMERKING: Als er bijvoorbeeld twee kralen (1 en 2) zijn, heeft de meerpuntsselectie vier punten in de volgende volgorde: (1) kraal 1 in TIRF, (2) kraal 1 in IRM, (3) kraal 2 in TIRF, (4) kraal 2 in IRM.
5. Voer de meegeleverde ImageJ-macro (ImageSplitterRegistration.ijm) uit.
   OPMERKING: Dit automatiseert de volgende stappen: i) het schatten van de centrale locatie van elke kraal door het passen op een Gauss; ii) voor elke kraal, het berekenen van de verplaatsingsvector die het centrum in het TIRF-kanaal scheidt van het centrum in het IRM-kanaal; iii) het gemiddelde van deze verplaatsingsvector over alle kralen; iv) het opsplitsen van de TIRF- en IRM-kanalen in afzonderlijke beelden; v) het vertalen van het TIRF-beeld met de gemiddelde verplaatsingsvector berekend in iii; vi) het overlappen van de TIRF- en IRM-afbeeldingen in een meerkanaals .tiff bestand.

Results

De optische opstelling is geschematiseerd in figuur 1. Zowel IRM-verlichting als TIRF-excitatielicht worden via een 10/90 (R/T) bundelsplitter (BS1) op de achteropening van het objectief (100x, NA: 1,49) gericht. Het uitgezonden signaal gaat door dezelfde bundelsplitser (BS1) en wordt via een spiegel (M1) naar de beeldsplitser gereflecteerd. De componenten van de beeldsplitser (ingesloten met stippellijnen in figuur 1) scheiden de IRM- en TIRF-signalen via een 90/10 (R/T) bundelsplitser (BS2) samen met geschikte spectrale filters. Ten slotte worden de gesplitste beelden op de camerachip geprojecteerd voor visualisatie. De uitlijning van de beeldsplitser is zodanig dat de TIRF- en IRM-signalen op afzonderlijke helften van de chip worden geprojecteerd.

In een goed uitgelijnde microscoop moet het camerabeeld een half gesplitst beeld weergeven, zoals weergegeven in figuur 2. Oppervlaktegebonden microtubuli moeten gemakkelijk zichtbaar zijn in het IRM-kanaal¹³ en fluorescerende kinesine moet zichtbaar zijn in het TIRF-kanaal.

De microbeads die worden gebruikt om de twee kanalen uit te lijnen en te registreren, verschijnen als heldere vlekken in de TIRF-afbeeldingen en donkere vlekken in de IRM-afbeeldingen. Hoewel de kralen zichtbaar zijn in de onbewerkte gegevens, verbetert achtergrondaftrekken het contrast aanzienlijk (figuur 2). De achtergrondafbeelding die voor de aftrekking wordt gebruikt, is de temporele mediaan van een video die is opgenomen met een bewegende fase. Zoals beschreven in het protocol, werd de uitlijning van afbeeldingen uitgevoerd door een verzameling kralen in de buurt van het gewenste gebied te selecteren en de meegeleverde macro uit te voeren (imageSplitterRegistration.ijm). De macro past de punten aan op Galliërs en lijnt de afbeeldingen uit door de gemiddelde afstand tussen de middelpunten van de passen in elk kanaal te minimaliseren. Dit proces is weergegeven in figuur 2, die een goede uitlijning van de fluorescerende microbeads laat zien (groen in het TIRF-kanaal, zwart in het IRM-kanaal).

Ten slotte worden de mogelijkheden van deze gelijktijdige beeldvormingsopstelling gedemonstreerd door enkele kinesinemoleculen te observeren die naar de krimpende uiteinden van microtubuli lopen. Figuur 3 toont een kymograaf van eGFP-gelabelde kinesinemoleculen (groen) die op een krimpende microtubuli (grijs) lopen. Ook wordt een reeks snapshots gepresenteerd van de opname waaruit de kymograaf is gegenereerd.

Figuur 1: Schematische weergave van de optische opstelling voor gelijktijdige IRM- en TIRF-beeldvorming van kinesinemotiliteit. Epiilluminatie van een LED-lichtbron gaat door het diafragmamembraan en bereikt de 10/90 (R/ T) beam splitter (BS1). De bundelsplitser reflecteert gedeeltelijk het rode IRM-verlichtingslicht en het 488 nm TIRF-excitatielicht tot aan het objectief om het monster te verlichten. Het signaal van het monster wordt door hetzelfde doel verzameld en naar de beeldsplitsingsassemblage geleid, waar IRM- en TIRF-beelden ruimtelijk worden gescheiden door de 90/10 (R/ T) bundelsplitser (BS2). De signalen worden vervolgens spectraal gefilterd voordat ze de camerachip bereiken. Afkortingen: IRM = interferentie reflectie microscopie; TIRF = totaal-interne-reflectie-fluorescentie; LED = lichtgevende diode; I_TIRF = TIRF-verlichting; I_GFP = GFP fluorescentie; I_inc = IRM verlichting; I_ref = verstrooid licht op het glas/water grensvlak; I_scat = verstrooid licht van de microtubuli; I_IRM = IRM signaal (Interferentie van I_ref en I_scat); R/T = gereflecteerd/uitgezonden; LP600: langdoorlaatfilter (600 nm); DM = dichroïsche spiegel; BS1 en BS2 = bundelsplitsers 1 en 2; M1, M2, M3, M4 = spiegels; BP535/50 = bandpas (535/50 nm); GFP = groen fluorescerend eiwit; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-methyleendifosfonaat; BBP = guanosinedifosfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Achtergrondaftrekken en afbeeldingsuitlijning. De TIRF-beelden (linkerhelft) en IRM-beelden (rechterhelft) verschijnen tegelijkertijd op twee helften van dezelfde camerachip (camerabeeld). Temporele mediane achtergrondaftrekking verhoogt het contrast van de kralen (afbeelding met afgetrokken achtergrond), die donker lijken in IRM en helder in TIRF-afbeeldingen. IRM- en TIRF-afbeeldingen worden uitgelijnd door vertaling (rechts) op basis van de lokalisatie van geselecteerde kralen (witte rechthoeken). Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kymograaf en snapshots van Kinesins' beweging tijdens microtubule krimp. De kymograaf (links) toont eGFP-kinesine-1 (groen) lopend naar het pluseinde van de microtubuli (donkergrijs). Snapshots uit de bijbehorende tijdreeks worden getoond (rechts). Witte pijlen tonen enkele kinesine-1-moleculen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ImageSplitterRegistratiebestand: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het bestuderen van de regulatie van microtubule-dynamica door microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs) vereist vaak gelijktijdige beeldvorming van microtubuli en MAPs. Fluorescentiemicroscopietechnieken zoals TIRF worden meestal voor dit doel gebruikt. Ze worden echter beperkt door de nadelen van fluorescentiebeeldvorming, waaronder fotobleaching, fotoschade en de noodzaak van fluorofooretikettering. Labelvrije methoden, zoals IRM, zijn geschikt voor het visualiseren van microtubuli, maar zijn niet in staat om afzonderlijke fluoroforen in beeld te brengen. Dit protocol combineert labelvrije IRM-beeldvorming en TIRF-microscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en MAPs.

De IRM-opstelling maakt gebruik van een LED-verlichtingsbron gefilterd tot >600 nm, terwijl de TIRF-opstelling een 488 nm-laser gebruikt. We gebruikten een goedkope plaatbundelsplitter om het verlichtingslicht op het monster te reflecteren en het verzamelde signaal naar de detector te sturen (figuur 1). Een bundelsplitser met 10% reflectie en 90% transmissie werd gekozen om het verlies van het signaal met één molecuul te minimaliseren. Het verlies van 90% in de lichtintensiteit van de verlichting wordt gecompenseerd door het vermogen van de verlichtingslaser en LED te verhogen.

Spectrale scheiding van de signalen werd bereikt met behulp van een 90/10 (R/T) bundelsplitser en twee spectrale filters (long-pass 600 nm voor IRM en band-pass 535/50 nm voor TIRF). De spectraal gescheiden IRM- en TIRF-signalen worden geprojecteerd op twee helften van een enkele camerachip met behulp van een beeldsplitserassemblage. Het gebruik van een 90/10 beam splitter offert 90% van het IRM-signaal op, maar dit wordt gecompenseerd door de intensiteit van de LED-verlichtingsbron te verhogen. Een dichroïsche spiegel zou hier ook kunnen worden gebruikt om de IRM- en TIRF-signalen efficiënter te scheiden. Fluorescerende microbeads die in de assays zijn opgenomen, maken een nauwkeurige uitlijning van de TIRF- en IRM-beelden mogelijk en dienen als referentie voor het scherpstellen van het doel.

Het meest kritische optische element in dit protocol is het hoge numerieke diafragma (NA) objectief. Dit is niet alleen essentieel om totale interne reflectie te bereiken, maar ook om de efficiëntie van de collectie en het beeldcontrast te maximaliseren. De kwaliteit van de verkregen afbeeldingen hangt ook af van de netheid van het glasoppervlak en de verwerving van een duidelijke achtergrondafbeelding om te corrigeren voor niet-uniforme verlichting en statische kenmerken te verwijderen. Voor IRM-beeldvorming raden we aan om verlichting met een lange golflengte (>600 nm) te gebruiken om de fotoschade van microtubuli en eiwitten te minimaliseren. Dit is vooral belangrijk als een witte LED-lichtbron wordt gebruikt, in welk geval een long-pass filter moet worden meegeleverd om UV-licht te verwijderen.

Dit protocol maakt labelvrije, snelle beeldvorming van dynamische microtubuli en gelijktijdige hoge-resolutie visualisatie van fluorescerende MAPs^{17 mogelijk}. Vergeleken met de filterkubusschakeltechniek, die afwisselt tussen het vastleggen van afbeeldingen van microtubuli en MAPs, is deze opstelling in staat tot veel hogere framesnelheden omdat deze niet afhankelijk is van de fysieke rotatie van een filterkubus. In vergelijking met tweekleurige TIRF-beeldvormingstechnieken maakt deze techniek gebruik van een minder veeleisende optische opstelling en omzeilt de noodzaak van fluorofooretikettering van microtubuli. De primaire beperkingen van deze opstelling zijn te wijten aan de TIRF-beeldvorming van de MAPs; de framesnelheid wordt beperkt door de belichtingstijd van een fluorofoor en fotobleaching van fluoroforen blijft een mogelijkheid. Niettemin verbetert dit protocol de bestaande technieken omdat het TIRF alleen gebruikt wanneer dat nodig is (d.w.z. om MAPs te visualiseren, maar geen microtubuli) en de hoogst mogelijke snelheid bereikt binnen de grenzen van TIRF. Verdere verbeteringen zijn alleen mogelijk als zowel de microtubuli als de MAPs worden gevisualiseerd via een interferometrische techniek, maar dit vereist het labelen van MAPs met metalen nanodeeltjes, wat zijn beperkingen en experimentele uitdagingen heeft.

Om de mogelijkheden van deze techniek te demonstreren, hebben we tegelijkertijd twee snelle dynamische processen gevisualiseerd via IRM en TIRF: de krimp van een microtubuli en het lopen van een fluorescerend kinesinemolecuul. Deze techniek is eerder gebruikt om de snelle diffusie van spastine op krimpende microtubuli te visualiseren⁵. Naast deze toepassing op MAPs en microtubuli, kan dit protocol worden gebruikt om enkele fluorescerende moleculen tegelijkertijd te visualiseren met elke macromoleculaire structuur die massief genoeg is om te worden gevisualiseerd via IRM, zoals een celmembraan of actinefilament.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10/90 (R/T) beam splitter	Thorlabs	BSN10R	Plane beam splitter used in the excitation beam path
90/10 (R/T) beam splitter	Thorlabs	BSX10R	Plane beam splitter used in the image splitter
Anti-biotin antibody	Sigma-Aldrich	B3640	Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules
ATP	Sigma-Aldrich	FLAAS	Used for preparing the motility buffer
Band-pass filter	Newport	HPM535-50	Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal
Biotinylated tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333P-A	Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel
Casein	Sigma-Aldrich	C8654	Casein is used to block nonspesific interactions
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322	Used for preparing the oxygen scavenger solution
Desiccator chamber	Southern Labware	55207	Desiccator is used for degasing the resin
DTT	Sigma-Aldrich	D0632	Used for preparing the oxygen scavenger solution
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Used for preparing the BRB80 buffer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Used for preparing the oxygen scavenger solution
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7016	Used for preparing the oxygen scavenger solution
GMPCPP nucleotides	Jena Bioscience	NU-405L	Used for the polymerization of stabilized microtubules
Image splitter	Teledyne-Photometrics Imaging	OptoSplit II	An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope
ImajeJ2	NIH		ImageJ2 is used for image analysis
Kinesin			prepared in house (see references in text)
LDPE tubing	Thomas Scientific	9565S22	Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers
LED light source	Lumencor	Lumencor sola light engine	Used for IRM imaging
Long-pass filters	Thorlabs	FELH0600	Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63068	Used for preparing the BRB80 buffer
Micoscope objective heater	okolab	H401-T-DUAL-BL	Used to keep sample temperature constant via heating the objective
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse	An inverted microscope that is used in the experiments
Na-PIPES	Sigma-Aldrich	P2949	Used for preparing the BRB80 buffer
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective	Nikon	MRD01991	The imaging objective has 1.49 numerical aperture
PDMS and curing agent	Electron Microscopy Sciences	Sylgard 184 (24236-10)	Used for contructing the flow channels
PDMS puncher	World Precision Instruments LLC	504529	Used to punch hole into the PDMS
Plasma cleaner	Harrick Plasma	DPC-32G	The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)	Sigma-aldrich	P2443	Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	567530	Used for preparing the BRB80 buffer
Stabilized microtubules			prepared in house (see references in text)
Table-top ultracentrifuge	Beckman Coulter	340400	Used to spin down microtubule seeds
TetraSpeck beads	ThermoFisher Scientific	T7279	Used as a reference for aligning images
Zyla 4.2 camera	Andor	Zyla 4.2	Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range