Methodenartikel

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63733

⸱

6 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

In dit artikel

Samenvatting

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Samenvatting

Intravitale beeldvorming van leukocyten-endotheelinteracties biedt waardevolle inzichten in immuungemedieerde ziekten bij levende dieren. De studie van acute longbeschadiging (ALI) / acute respiratory distress syndrome (ARDS) en andere respiratoire pathologieën in vivo is moeilijk vanwege de beperkte toegankelijkheid en inherente bewegingsartefacten van de longen. Niettemin zijn er verschillende benaderingen ontwikkeld om deze uitdagingen het hoofd te bieden. Dit protocol beschrijft een methode voor intravitale fluorescentiemicroscopie om real-time leukocyten-endotheelinteracties in de pulmonale microcirculatie te bestuderen in een experimenteel model van ALI. Een in vivo longbeeldvormingssysteem en een 3D-geprint intravitaal microscopieplatform worden gebruikt om de verdoofde muis te beveiligen en de long te stabiliseren, terwijl verstorend longletsel wordt geminimaliseerd. Na voorbereiding wordt widefield fluorescentiemicroscopie gebruikt om leukocytenadhesie, leukocytenrollen en capillaire functie te bestuderen. Hoewel het hier gepresenteerde protocol zich richt op beeldvorming in een acuut model van inflammatoire longziekte, kan het ook worden aangepast om andere pathologische en fysiologische processen in de long te bestuderen.

Inleiding

Intravitale microscopie (IVM) is een nuttig beeldvormingsinstrument voor het visualiseren en bestuderen van verschillende biofysische processen in vivo. De long is zeer uitdagend om in vivo in beeld te brengen vanwege de ingesloten locatie, de fragiele aard van het weefsel en bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag 1,2. Verschillende intravitale microscopie (IVM) opstellingen zijn ontwikkeld voor real-time beeldvorming van leukocyt-endotheel interacties in pulmonale microcirculatie om deze uitdagingen te overwinnen. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op het chirurgisch blootstellen en stabiliseren van de long voor beeldvorming.

Dieren worden meestal voorbereid op long IVM door chirurgische ingrepen. Ten eerste worden dieren geïntubeerd en beademd, wat chirurgische excisie van een thoracale venster en daaropvolgende interventies mogelijk maakt om de long te stabiliseren voor beeldvorming. Eén techniek omvat het lijmen van het parenchym op een glazen afdekplaat3, een procedure die een aanzienlijk fysiek trauma aan het afgebeelde weefsel riskeert. Geavanceerder is het gebruik van een vacuümsysteem om de long te stabiliseren onder een glazen venster4. Deze opstelling vergemakkelijkt de losse hechting van het longoppervlak aan de coverslip via een omkeerbaar vacuüm verspreid over een groot lokaal gebied en breidt de long uit terwijl de beweging in x-, y- en z-dimensies4 nog steeds wordt beperkt. Het vacuüm wordt gelijkmatig aangebracht door een kanaal rond het beeldvormende gebied van de opstelling en trekt het weefsel in een ondiep conisch gebied tegenover de imaging-grade coverslip4. Via dit kijkvenster kan de longmicrocirculatie worden bestudeerd met behulp van verschillende optische beeldvormingsmodaliteiten.

Long IVM maakt kwantitatieve beeldvorming van een veelheid aan microcirculatieparameters mogelijk. Deze omvatten metingen zoals leukocytenspoorsnelheid en -lengte5, rode bloedcelstroomsnelheid6 en oxygenatie7, tumormetastasen8, het onderscheid van immuuncelsubpopulaties 9,10,11, visualisatie van microdeeltjes12, alveolaire dynamica13,14, vasculaire permeabiliteit15 en capillaire functie16 . De focus ligt hier op leukocytenrekrutering en capillaire functie. Initiatie van leukocytenrekrutering in de pulmonale microcirculatie omvat voorbijgaande rollende interacties en stevige kleefinteracties tussen leukocyten en endotheelcellen, die beide verhoogd zijn onder ontstekingsomstandigheden 16,17. Typisch wordt rollen gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat een door de operator gedefinieerde referentielijn passeert, terwijl de adhesie wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat onbeweeglijk is op het endotheel16. Capillaire functie kan ook worden beïnvloed in inflammatoire toestanden, vaak resulterend in verminderde perfusie. Dit kan worden toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder een vermindering van de vervormbaarheid van rode bloedcellen18 en bonte expressie van induceerbare NO-synthase door endotheelcellen, resulterend in pathologische rangering19. Doorgaans wordt de totale lengte van geperfuseerde haarvaten per gebied gemeten en gerapporteerd als functionele capillaire dichtheid (FCD).

Het bestuderen van leukocytenrekrutering in de longen in realtime vereist het labelen van biologische doelen met fluorescerende kleurstoffen of fluorescerend gelabelde antilichamen20. Als alternatief kunnen verschillende transgene muizenstammen zoals lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) muizen worden gebruikt om specifieke immuuncelsubsets zoals neutrofielen21,22 in beeld te brengen. De fluorescerend gelabelde leukocyten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie, confocale microscopie of multifotonenmicroscopie. Deze technieken bereiken contrast door gebruik te maken van specifieke excitatiegolflengten en uitgezonden fluorescentie te detecteren, terwijl tegelijkertijd de detectie van de excitatiegolflengte wordt geblokkeerd, waardoor het gelabelde object wordt gemarkeerd.

Bestaand onderzoek naar de kwantificering van leukocytenrollen, adhesie en functionele capillaire dichtheid in de muizenlong is voornamelijk gebaseerd op handmatige video-analyse. Dit wordt mogelijk gemaakt door open-source software zoals Fiji 6,23, propriëtaire software zoals CapImage12, of op maat gemaakte beeldverwerkingssystemen24. Omgekeerd maken verschillende eigen softwareplatforms (bijv. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) geautomatiseerde meting mogelijk van een breed scala aan andere fysiologische parameters, waaronder veel van de eerder hier genoemde 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Er zijn belangrijke observaties gedaan met betrekking tot de pathologie van acuut longletsel (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) met behulp van long IVM. ARDS wordt gekenmerkt door een groot aantal pathofysiologische processen in de longen, waaronder longoedeem en alveolaire schade veroorzaakt door disfunctie van het endotheel en de epitheliale barrière25. Met behulp van een muizenmodel is gebleken dat sepsis-geïnduceerde ALI geassocieerd is met significante schadelijke veranderingen in de handel in immuuncellen in de longomgeving26. Neutrofielen die werden gerekruteerd voor de haarvaten van muizen met sepsis-geïnduceerde ALI bleken de microcirculatie te belemmeren, waardoor hypoxie in ALI26 toenam. Daarnaast is IVM gebruikt om inzicht te krijgen in het onderliggende reparatiemechanisme na het begin van ARDS27. Long IVM is ook een waardevol hulpmiddel geweest bij het begrijpen van pathofysiologische veranderingen in verschillende obstructieve longziekten. Visualisatie van slijmtransport bij ziekten zoals cystic fibrosis (CF) en chronische obstructieve longziekte (COPD) heeft bijvoorbeeld de studie van nieuwe en bestaande behandelingen voor slijmklaringvergemakkelijkt 28. Leukocytenhandel onder deze omstandigheden is ook geanalyseerd17.

Dit protocol borduurt voort op de aanpak die oorspronkelijk werd beschreven door Lamm et al.29 om leukocyten-endotheelinteracties te bestuderen met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. De beschreven procedures maken gebruik van een in vivo longbeeldvormingssysteem, dat een metalen basis van 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulator en vacuümbeeldvormingsvenster omvat (figuur 1). Het systeem is gemonteerd in een 20 cm x 23,5 cm 3D-geprint platform (Supplemental File 1) om een veilige bevestiging voor de ventilatorbuis en het verwarmingskussen te bieden. Deze methode biedt reproduceerbare en kwantificeerbare beeldvorming van murine pulmonale microcirculatie in vivo. Belangrijke aspecten van de chirurgische voorbereiding en het juiste gebruik van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem worden in detail uitgelegd. Ten slotte wordt een experimenteel model van ALI gebruikt om representatieve beeldvorming en analyse te bieden van veranderde leukocytenrollen, leukocytenadhesie en capillaire perfusie geassocieerd met ontsteking. Het gebruik van dit protocol moet verder belangrijk onderzoek naar pathofysiologische veranderingen in de pulmonale microcirculatie tijdens acute ziektetoestanden vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van de Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA).

1. Voorbereiding

  1. Longbeeldvormingssysteem: Om het venster voor te bereiden, dient u een dunne laag vacuümvet toe aan de bovenkant van de buitenste ring terwijl verontreiniging van het vacuümkanaal wordt vermeden. Plaats een schone glazen afdekplaat van 8 mm op het raam en druk zachtjes naar beneden om een afdichting te creëren.
  2. Widefield Fluorescentie microscoop: Voer beelden uit met een conventionele widefield fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20x/ 0,40 lange werkafstandsobjectief en een zwart-wit charge-coupled device (CCD) camera met een framesnelheid van 25 FPS. Pas een 530-550 nm bandpass excitatiefilter toe om Rhodamine-6G te exciteren en een 460-490 nm bandpass filter om fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) te exciteren.
  3. Vacuümsysteem: Sluit het beeldvenster aan op een vacuümpomp die is uitgerust met een digitale manometer die een constante zuigkracht van 50-60 mmHg kan bieden, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1. Kortom, sluit het beeldvenster aan op de pomp via 1,0 mm I.D. polyethyleenbuizen, 1,0 cm I.D. polyethyleenbuizen, een vacuümkolf en een inline 0,2 μm filter.
  4. Ventilator: Stel een kleine knaagdierventilator in om drukgestuurde ventilatie te bieden met een snelheid en volume die worden berekend op basis van het gewicht van de muis. Zorg voor een positieve eind-expiratoire druk (PEEP) bij 5 cmH2O voor de duur van het experiment en stel de doeldruk in op 20 cmH2O.
  5. Verdovingsmiddel: Gebruik een low-flow anesthesieafgiftesysteem en prime een spuit van 5,0 ml met 99,9% isofluraan. Gebruik een afvalgasopruimsysteem om het risico op inademing door de chirurg te minimaliseren.

2. Anesthesie

  1. Plaats een 20-25 g 12 weken oude mannelijke C57Bl/6 muis in de anesthesie inductiekamer. Met de kamer goed gesloten, begint inductie met isofluraangas in een concentratie van 3% en een stroomsnelheid van 500 ml / min.
  2. Zodra de muis is verdoofd (gevisualiseerd door vertraagde ademhalingsfrequentie), brengt u deze over naar de intubatiestandaard en bevestigt u de bovenste snijtanden aan de hangende hechting.
  3. Span de hechting aan om de snuit in de neuskegel vast te zetten. Begin met de gasstroom door de neuskegel in een concentratie van 2,5%.
  4. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie via teenknijpen voordat u naar de volgende stap gaat.

3. Intubatie

  1. Draai de standaard zodanig dat de achterkant van de standaard en de dorsale kant van de muis naar de chirurg gericht zijn.
  2. Laat de punt van een glasvezelkabel van 20 cm lang door een endotracheale canule van 20 G lopen en dompel de punt onder in Lidocaïne HCl (1%) om de doorgang van de kabel door het strottenhoofd te vergemakkelijken.
  3. Gebruik een stompe tang om de onderkaak op te tillen en de tong te verplaatsen om een duidelijke doorgang naar de luchtwegen te bieden.
  4. Plaats een gemodificeerde otoscoop (~ 60 ° speculumomtrek verwijderd) zodat de bovenste snijtanden binnen de opening in het speculum passen. Pas de scope en tongpositie aan totdat de epiglottis en stembanden duidelijk zichtbaar zijn.
  5. Steek de glasvezelkabel geladen met de endotracheale canule door de opening in het speculum en in het strottenhoofd. Gebruik kleine cirkelvormige bewegingen om de kabel door de stembanden en in de luchtpijp te laten lopen.
  6. Duw de canule langs de glasvezelkabel en passeer tussen de stembanden en in de luchtpijp.

4. Ventilatie

  1. Haal de muis uit de intubatiestandaard en plaats hem op een verwarmingskussen in de juiste laterale decubituspositie.
  2. Sluit de canule aan op de ventilatorslang en start de ventilator. Verlaag de verdovingsconcentratie tot 1,5% en controleer de diepte door te testen op pedaalreflex. Als de reflex aanhoudt, verhoog dan de concentratie stapsgewijs tot wel 2%.
  3. Plaats de traangel in de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.
  4. Bevestig de canule met behulp van medische tape aan de snuit. Bevestig met behulp van labeling tape de juiste voorzaag aan het verwarmingskussen op ongeveer de 9 uur positie. Strek de linker achterpoot dicht en zet vast op, ongeveer, de positie van 6 uur.
  5. Rek met behulp van een doektape de linker voorpoot lichtjes uit tot de positie van 12 uur en bevestig het andere uiteinde van de tape aan de bovenkant van het IVM-platform, zoals weergegeven in figuur 2A (het handhaven van een lichte spanning hier vergemakkelijkt de daaropvolgende thoracotomie).
  6. Plaats een rectale temperatuursonde en bevestig de sonde door deze op het verwarmingskussen te plakken. Plaats een pulsoximeter op de rechter achterpoot en bevestig aan het verwarmingskussen, zorg ervoor dat de bloedsomloop niet wordt verstoord.
  7. Zodra de temperatuur stabiel is op 37,0 °C ± 0,1 °C, voert u de thoracotomie uit.

5. Thoracotomie

  1. Steriliseer de thorax en de buik met een alcoholdoekje van 70%. Breng een lichte laag minerale olie aan om het haar aan de linkerkant van de muis te bevochtigen - van het borstbeen tot de wervelkolom en van de schouder tot de onderkant van de ribbenkast.
  2. Maak met een stompe tang en een rechte schaar een kleine longitudinale incisie aan de onderkant van de ribbenkast om de onderliggende spierlaag bloot te leggen.
  3. Beweeg ventraal, gebruik stompe dissectie om het epitheliale en vetweefsel van de spierlaag te scheiden. Cauteriseer alle blootgestelde bloedvaten. Zodra het risico op bloedverlies is beperkt, verlengt u de oorspronkelijke incisie ventraal tot het xiphoid-proces.
  4. Herhaal dit proces dorsaal tot ~5 mm lateraal aan de wervelkolom.
  5. Beweeg craniaal, gebruik stompe dissectie om de ribbenkast bloot te leggen. Cauteriseer alle blootgestelde bloedvaten om de hemodynamische stabiliteit te behouden.
  6. Zodra het risico op bloedverlies is beperkt, breidt u de incisie uit van het xiphoid-proces naar de oksel.
  7. Herhaal dit proces aan de dorsale kant van de incisie tot ~ 1 cm inferieur aan het linkeroor.
  8. Pak met behulp van een hemostatische tang het ontleedde epitheel- en vetweefsel vast en plaats het operatiegebied vrij (figuur 2B).
  9. Injecteer een oplossing van Rhodamine-6G (0,5 mg / ml; 1,5 ml / kg) voor visualisatie van leukocyten en Bovine FITC-albumine (50 mg / ml; 1 ml / kg) voor visualisatie van capillaire perfusie via de staartader.
  10. Gebruik een getande tang om de rib onmiddellijk inferieur aan de positie van de basis van de long te grijpen bij eindinspiratie en trek je lichtjes terug om de rib weg te trekken van de long. Snijd de rib af om een pneumothorax te induceren.
  11. Verleng de incisie lateraal langs de intercostale spier in beide richtingen en zorg ervoor dat u het blootgestelde longoppervlak niet aanraakt.
  12. Gebruik een stompe tang, pak de op een na hoogste rib vast en trek je iets terug om de long weg te laten vallen van de borstwand. Als de long niet loslaat, druk de borstwand dan lichtjes tegen de long om ervoor te zorgen dat de long zich hecht aan het onderliggende borstvlies en dus gemakkelijker wegvalt.
  13. Ga door met de oorspronkelijke incisie ventraal tot het borstbeen en craniaal totdat de top van de long wordt blootgesteld. Gebruik katoenen applicators en gaas om eventuele bloedingen te verzachten.
  14. Verhoog de ribbenkast om intercostale bloedvaten op het dorsale aspect van de thoracale holte bloot te leggen. Zorg ervoor dat u de long niet beschadigt, dichtschroei het meest inferieure intercostale vat in de buurt van de wervelkolom en snijd vervolgens de rib door. Beweeg craniaal en ventraal, herhaal dit totdat een gedeelte van ongeveer 1 cm x 1,5 cm van de ribbenkast is weggesneden (figuur 2C).
  15. Verwijder overtollig vochtophoping in de thoracale holte via capillaire werking met behulp van kleine reepjes gaas.
  16. Terwijl u overgaat tot microscopie, wacht u ~ 5 minuten voor intrapleurale vloeistof om te dissiperen voor een veiligere interface tussen de long en het beeldvormingsvenster.

6. Microscopie

  1. Schakel de vacuümpomp in en stel de druk in op ~50-60 mmHg.
  2. Breng het IVM-platform over naar de microscoopfase. Plaats de metalen paal en micromanipulator zodanig dat het beeldvenster zich direct boven de blootgestelde long bevindt en de raamarm de long nadert vanaf, ongeveer, de positie van 3 uur.
  3. Gebruik de micromanipulator om het beeldvormingsvenster voorzichtig te laten zakken totdat het zich hecht aan het longoppervlak en het stabiliseert (figuur 3A).
  4. Met behulp van het 20x-objectief en het 460-490 nm bandpass excitatiefilter, identificeer een pulmonale venule op basis van het convergente patroon van de bloedstroom. Centreer het schip in het gezichtsveld en neem 30 s video op.
    1. Schakel over naar het 530-550 nm bandpass excitatiefilter en neem 30 s video op in hetzelfde gezichtsveld.
    2. Herhaal de vorige stap totdat vijf pulmonale venules in beeld zijn gebracht.
  5. Met behulp van het 460-490 nm bandpass excitatiefilter, identificeer een pulmonale arteriole op basis van het divergente patroon van de bloedstroom. Centreer het schip in het gezichtsveld en neem 30 s video op.
    1. Schakel over naar het 530-550 nm bandpass excitatiefilter en neem 30 s video op in hetzelfde gezichtsveld.
    2. Herhaal de vorige stap totdat vijf pulmonale arteriolen in beeld zijn gebracht.
  6. Lokaliseer met behulp van het 460-490 nm bandpass excitatiefilter een gebied van longblaasjes en haarvaten dat niet wordt doorsneden door grotere vaten en neem 30 s video op.
    1. Schakel over naar het 530-550 nm bandpass excitatiefilter en neem 30 s video op in hetzelfde gezichtsveld.
    2. Herhaal de vorige stap totdat vijf capillaire gebieden zijn afgebeeld.

7. Euthanasie- en schoonmaakprotocol

  1. Verwijder het IVM-platform uit de microscoopfase en pas de isofluraanafgifte gedurende 5 minuten aan op 5% om de muis te euthanaseren.
  2. Gooi tijdens het wachten het afdekglas weg en koppel het beeldvenster los van het platform. Reinig het beeldvenster met een kleine borstel en gebruik een spuit van 30 G die in het kanaal is ingebracht om het meerdere keren met gedestilleerd water te spoelen. Spoel vervolgens met 95% ethanol met behulp van de vacuümpomp.
  3. Nadat 5 minuten zijn verstreken, stopt u met de beademingsmachine en zorgt u voor volledige euthanasie via cervicale dislocatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de resultaten te illustreren die via dit protocol kunnen worden bereikt, werd acuut longletsel (ALI) geïnduceerd 6 uur voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een model van intranasale bacteriële lipopolysaccharide (LPS) instillatie. In het kort werden muizen (n = 3) verdoofd met isofluraan en kleine druppeltjes LPS van Pseudomonas aeruginosa in steriele zoutoplossing (10 mg / ml) werden in de linker naris gepipetteerd in een dosering van 5 mg / kg. Dit werd vergeleken met naïeve muizen (n = 3; geen intra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol vereist oefening en aandacht voor een paar kritieke stappen. Ten eerste is het belangrijk om het beeldvormingsvenster voor te bereiden voordat de intubatie en operatie worden gestart. Gebruik een minimale hoeveelheid vacuümvet om de buitenste ring van het beeldvenster te coaten, breng het afdekglas aan en test de zuigkracht met een druppel gedestilleerd water. Door dit van tevoren voor te bereiden, voorkomt u dat de blootgestelde long tijdens de installatie uitdroogt. Hoewel het mogelijk ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dr. Kamala D. Patel is de president en mede-oprichter van Luxidea, de onderneming waarvan het beeldvenster dat in dit experiment werd gebruikt, werd gekocht.

Dankbetuigingen

De auteurs willen dr. Pina Colarusso bedanken, die aanzienlijke expertise heeft geleverd bij het redigeren en herzien van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single useBecton, Dickinson and Company3096591 mL-sering
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cmRWD Life Science Co.F12002-12Blunt forceps
Albumin-Fluorescein IsothiocyanateSigma-AldrichA9771-1GFITC-albumine
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/vCanadian Custom Packaging Company80002455Alcoholdoekje
AVDC110 Advanced Digital Video ConverterCanopus00631069602029Digitaal video converter
B/W - CCD - CameraHorn ImagingBC-71Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery KitFine Science Tools18010-00Cauterizer
C57BL/6 MiceCharles River Laboratories InternationalC57BL/6NCrlC57BL/6 muizen
Cotton Tipped ApplicatorsPuritan806-WCKatoenen applicator
CS-8R 8mm Round Glass CoverslipWarner Instruments64-0701Glas dekglas
Digital Pressure GaugeITM Instruments Inc.DG2551L0NAM02L0IM&VDigitale drukmeter
Dr Mom Slimline Stainless LED OtoscopeDr. Mom Otoscopes1001Otoscoop
Ethyl Alchohol 95% VolCommercial AlcoholsP016EA9595% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless SteelFine Science Tools14094-11Schaar
Fisherbrand Colored Labeling TapeFisher Scientific1590110Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum PumpCole-Parmer Canada CompanyZA-07061-40Vakuumpomp
Hartman HemostatsFine Science Tools13003-10Hemostatische forceps
High Vacuum GreaseDow CorningDC976VFVacuumvet
Isoflurane USPFresenius KabiCP0406V2Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mLTeligent Canada0121AD01Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoardLuxidea, Inc.IMCH-0001Ontworpen voor intravitale microscopie van de long
Mineral OilTeva Canada00485802Mineraaloliën
Mouse Endotracheal Intubation KitKent Scientific CorporationETI-MSEIntubatie standaard, anesthesiemasker, 20 G endotracheale canule, glasvezelkabel
MST49 Fluorescence MicroscopeLeica Microsystems10 450 022Fluorescentiemicroscoop
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope ObjectiveLeica Microsystems56603520x objectief
Non-Woven Sponges 2" x 2"AMD-RitmedA2101-CHGaas
Optixcare Eye Lube PlusAventix5914322Traangeel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D PrinterPrusa ResearchPRI-MK3S-KIT-ORG-PEI3D printer
Oxygen, CompressedLinde Canada Inc.Zuurstof
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)Becton, Dickinson and Company30510630 G-naald
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mLCole-Parmer Canada Company5340-2LVacuumfles
Rhodamine 6 GSigma-Aldrich252433Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"PrimedPM5-630709Doektape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x.085 in. ODDow Corning602-2051.0 mm I.D. polyethyleenbuis
Somnosuite Low-Flow Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-01, SS-04-moduleKlein knaagdierventilator, lage-stroom anesthesiesysteem, verwarmingspad, rectale temperatuursonde, pulsoxymeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 TeethWorld Precision Instruments501216Getande forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)3M7000002795Medische tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.Grainger CanadaUSSZUSA-HT33141.0 cm I.D. polyethyleenbuis
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µmCole-Parmer Canada Company6720-5002Inline 0.2µm filter

Referenties

  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
  2. Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009(2015).
  3. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  4. Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
  5. Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748(2014).
  6. Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630(2014).
  7. Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
  8. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603(2016).
  9. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  10. Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
  11. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  12. Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
  13. Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
  14. Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291(2020).
  15. Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
  16. Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
  17. Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766(2017).
  18. Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
  19. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  20. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  21. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  22. Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  25. Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
  26. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).
  27. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  28. Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
  29. Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  30. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  31. Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
  32. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intravitale microscopieleukocytenadhesieleukocytenrollingcapillaire perfusiepulmonale inflammatiebeeldvorming van de muizenlong

Gerelateerde artikelen