Methodenartikel

Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur

4.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63745

⸱

25 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode om glioblastoom (GBM) organoïden te genereren uit primaire patiëntspecimens of van patiënten afgeleide celculturen en deze tot volwassenheid te houden. Deze GBM-organoïden bevatten fenotypisch diverse celpopulaties en recreëren tumormicro-omgevingen ex vivo.

Samenvatting

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersenkanker met een extreem slechte prognose. Intra-tumorale cellulaire en moleculaire diversiteit, evenals complexe interacties tussen tumormicro-omgevingen, kunnen het vinden van effectieve behandelingen een uitdaging maken. Traditionele aanhankelijke of bolcultuurmethoden kunnen dergelijke complexiteiten maskeren, terwijl driedimensionale organoïde cultuur regionale micro-omgevingsgradiënten kan samenvatten. Organoïden zijn een methode van driedimensionale GBM-cultuur die de tumorarchitectuur van patiënten beter nabootst, fenotypisch diverse celpopulaties bevat en kan worden gebruikt voor experimenten met gemiddelde doorvoer. Hoewel driedimensionale organoïde cultuur bewerkelijker en tijdrovender is in vergelijking met traditionele cultuur, biedt het unieke voordelen en kan het dienen om de kloof tussen huidige in vitro en in vivo systemen te overbruggen. Organoïden hebben zichzelf gevestigd als onschatbare hulpmiddelen in het arsenaal van kankerbiologen om tumorgedrag en resistentiemechanismen beter te begrijpen, en hun toepassingen blijven alleen maar groeien. Hier worden details gegeven over methoden voor het genereren en onderhouden van GBM-organoïden. Instructies voor het inbedden en doorsnijden van organoïdenmonsters met behulp van zowel bevroren als paraffine-inbeddingstechnieken, evenals aanbevelingen voor immunohistochemie en immunofluorescentieprotocollen op organoïde secties en meting van de totale levensvatbaarheid van organoïde cellen, worden ook allemaal beschreven.

Inleiding

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire hersentumor met een grimmige prognose van ongeveer 15 maanden vanaf diagnose1. Behandelingen die effectief zijn in preklinische studies kunnen vaak slecht effectief zijn bij patiënten 2,3. Slechte klinische respons wordt toegeschreven aan vele factoren, waaronder de micro-omgeving heterogeniteit van GBM en complexe intra-tumorale interacties. Deze kunnen moeilijk te recreëren zijn in de laboratoriumomgeving met traditionele adherenten- of bolkweekmethoden4. De aanwezigheid van een subset van zelfvernieuwende kankerstamcellen (CSC's) binnen GBM kan ook bijdragen aan deze complexiteit 5,6. CSC's zijn cruciaal voor tumorvoortplanting en houden tumorgroei in stand door actieve angiogenese, kankerinvasie en resistentie tegen therapieën, waaronder straling, te bevorderen 7,8,9. CSC's zijn niet gelijkmatig verdeeld over tumoren, maar zijn eerder verrijkt binnen specifieke micro-omgevingen, waaronder de perivasculaire niche en perinecrotische regio's, die elk een verschillende moleculaire regulatie van hun cellulaire toestanden bieden 10,11,12,13,14. CSC's zijn geen passieve ontvangers van micro-omgevingssignalen, maar bezitten in plaats daarvan de mogelijkheid om hun eigen micro-omgeving te hermodelleren 7,15,16. De micro-omgeving van een CSC kan het behoud van stamceltoestand bevorderen als reactie op drukken zoals nutriëntenschaarste, pH en hypoxie 17,18,19,20, wat het belang van deze aandoeningen in een modelsysteem suggereert. Recapitulatie van de diverse cellulaire micro-omgeving in tumoren is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van therapeutische resistentie en het identificeren van nieuwe therapieën.

Driedimensionale cultuur is de afgelopen jaren in populariteit toegenomen21,22. Organoïden zijn gebruikt bij andere soorten kanker, en het primaire doel van het handhaven van cellen als organoïden is om groei van heterogene celpopulaties mogelijk te maken (waarvan er vele normaal gesproken kunnen worden weggeconcurreerd in meer homogene bolcultuur) en ruimtelijke diversiteit, gezien als regionale tumormicro-omgevingen met genetische specificiteit 4,23,24,25,26 . Er zijn veel methoden voor driedimensionale kweek van kankercellen, die elk voor- en nadelen hebben 27,28,29. Organoïde cultuur is niet bedoeld als vervanging voor traditionele aanhangers of bolcultuur. Het kan het beste worden gebruikt als een aanvullende techniek voor tweedimensionale methoden wanneer er specifieke vragen zijn waarbij de interactie tussen celmicro-omgeving en tumorcelresponsen van cruciaal belang is.

Dit artikel beschrijft betrouwbare en herhaalbare methoden om GBM-organoïden te genereren uit primaire patiëntmonsters of van patiënten afgeleide culturen. We richten ons op twee verschillende doelstellingen voor driedimensionale organoïde cultuur: (1) het vaststellen van organoïden uit primair patiëntenweefsel, met maximaal engraftmentpotentieel ongeacht de uniformiteit, of (2) het kweken van uniforme organoïden voor meer kwantitatief experimenteel gebruik. Bij het vaststellen van een primair monster als organoïden is het niet nodig om te filteren op afzonderlijke cellen of cellen te tellen, omdat het bijhouden van maximale celaantallen en typen om de initiële cultuur vast te stellen een prioriteit is. Bij het kweken van organoïden voor vergelijkende experimenten zijn echter eencellige filtratie en celtelling nodig om ervoor te zorgen dat replicerende organoïden vergelijkbaar zijn voor experimentele consistentie. Dit protocol beschrijft hoe organoïde culturen kunnen worden vastgesteld en uniforme organoïden kunnen worden gemaakt, evenals verfijnde methoden voor het inbedden en behouden van organoïden en standaard celkweekexperimenten, waaronder immunohistochemie, immunofluorescentie en beoordeling van de totale levensvatbaarheid van cellen in GBM-organoïden.

Protocol

Alle stappen van het (de) protocol (en) die hieronder worden beschreven, zijn ontwikkeld en uitgevoerd in overeenstemming met Cleveland Clinic Institutional Review Board (IRB) Protocol # 2559 en Institutional Biosafety Committee (IBC) goedkeuring # 1711. Bollen en organoïden worden gekweekt in "Neurobasal Media Complete" (NBMc). Zie tabel 1 voor instructies.

1. Organoïde mallen maken

  1. Haal het waspapier van het parafilmvel (ongeveer 4 cm x 4 cm groot) en plaats het tussen twee steriele 96-well polymerase kettingreactie (PCR) platen.
    1. Voer deze stappen uit in de kweekkap en zorg er speciaal voor dat de "binnenkant" van de parafilm (de kant die door het papier wordt bedekt) schoon blijft. Deze schone kant moet de concaviteit van de inkepingen maken.
  2. Oefen gelijkmatige druk uit op de bovenste 96-well PCR-plaat om kleine kuiltjes in de parafilm te vormen. Het doel is om kuiltjes ongeveer 2 mm diep te laten zijn zonder gaten in de parafilm te creëren.
  3. Scheid de twee 96-well PCR-platen voorzichtig. De gerimpelde parafilm blijft aan de bovenplaat plakken. Leg dit ongeveer 30 s op droogijs.
  4. Nadat de parafilm 30 s op droogijs heeft gelegen, gebruikt u een steriele tang om de parafilm van de bovenste 96-well PCR-plaat te trekken.
    1. Gebruik bij het verwijderen van de parafilm een snelle beweging in plaats van heel "voorzichtig" te zijn. Bevroren parafilm is gemakkelijker te verwijderen dan verwarmde parafilm, waardoor de kuiltjes kunnen omkeren.
  5. Plaats de voltooide parafilmvorm in een afgedekte, steriele celkweekschaal van 10 cm. Mallen kunnen van tevoren worden gemaakt en opgeslagen als de steriliteit wordt gehandhaafd.

2. Macrodissectie van het weefselmonster van de patiënt

  1. Gebruik in een steriele kweekschaal (celkweekplaten van 10 cm) twee steriele scheermesjes om het patiëntmonster fijn te hakken terwijl u gelijkmatige druk uitoefent.
    OPMERKING: Het hakken van het exemplaar is het gemakkelijkst met ongeveer 500 μL NBMc op de kweekschaal. Probeer met scheermesjes stukjes zo fijn mogelijk te hakken; idealiter zijn individuele stukken 1 mm3 of kleiner.
  2. Breng de fijngehakte tumorstukken over naar een centrifugebuis van 15 ml met behulp van een gesneden p1000-pipetpunt.
    OPMERKING: Bij het hanteren van organoïden is het belangrijk om alleen gesneden p1000 pipetpunten te gebruiken. Deze kunnen met een scherp scheermes worden gesneden tot de gewenste openingsgrootte (tussen 5 en 8 mm ruwweg) en geautoclaveerd.
  3. Voeg 2 ml celloslatingsoplossing bij kamertemperatuur (RT) toe (tabel met materialen) en plaats deze gedurende ongeveer 10 minuten in een 37 °C, 5% CO2-incubator .
    OPMERKING: Observeer en meng om de paar minuten. Sommige celloslatingsoplossingen of monsters kunnen verschillende incubatietijden nodig hebben. Als klontering verschijnt, wat kan wijzen op DNA-afgifte als gevolg van cellyse, ga dan onmiddellijk verder met de volgende stap.
  4. Voeg 8 ml NBMc-media toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren en draai gedurende 3 minuten bij 65 x g.
  5. Aspirateer het supernatant en resuspendeer het weefsel in 1-2 ml NBMc.

3. Het genereren van organoïden uit primair patiëntenweefsel

OPMERKING: Het doel bij het maken van organoïden uit primair patiëntenweefsel is om driedimensionale cultuur vast te stellen. Filter niet op afzonderlijke cellen of tel cellen, maar houd de initiële celbelasting zo uniform mogelijk met behulp van visuele inspectie. Het is normaal om heterogeniteit te hebben in de groei en vestiging van initiële organoïden. Elke organoïde zal 20 μL in volume zijn (16 μL lamininerijke extracellulaire matrix (lrECM) en 4 μL weefsel gesuspendeerd in NBMc, vanaf stap 2.5). Instructies kunnen worden aangepast voor het beoogde aantal organoïden; het doel is om typisch ongeveer 20-30 organoïden te vormen uit primaire patiëntmonsters.

  1. Plaats in een ijsemmer of koud blok de lrECM en een kleine centrifugebuis. Plaats de juiste hoeveelheid lrECM (16 μL x X aantal beoogde organoïden) in de kleine centrifugebuis.
  2. Voeg een passend volume weefselsuspensie uit stap 2.5 (4 μL x aantal beoogde organoïden) toe aan de centrifugebuis op ijs.
  3. Pipetteer voorzichtig 20 μL van het lrECM/cel suspensiemengsel op parafilmmallen; dit zal een parelachtige druppel vormen.
    1. Zorg ervoor dat u het lrECM /cel suspensiemengsel grondig mengt; de cellen hebben de neiging zich gemakkelijk binnen de lrECM te nestelen, wat resulteert in heterogene organoïden.
    2. Houd het lrECM/cel suspensiemengsel op ijs. Als lrECM opwarmt, kan het polymeriseren en de vorming van organoïden aantasten. Zorg ervoor dat u de pipetpunt om de twee tot drie organoïden koelt om lrECM-polymerisatie te voorkomen. Breng geen luchtbellen in organoïden (vermijd het "dubbel duwen" van de pipet).
  4. Zodra het gewenste aantal organoïden op parafilmvorm is gepipetteerd in een celkweekplaat van 10 cm, bedekt u met plaatdeksel en incubeert u in een celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 1-2 uur.
  5. Nadat de organoïden zijn stollen, gebruikt u NBMc-media om ze voorzichtig van de parafilmvorm af te spoelen en in een nieuwe, steriele kweekplaat van 10 cm met in totaal 20 ml NBMc. Het gebruik van een p1000-tip werkt het beste om de organoïden van de mal te spoelen; ze glijden er zachtjes af.
    OPMERKING: Wanneer organoïden uit de mallen in celkweekplaten worden gespoeld, moeten ze in de media zichtbaar zijn als kleine roze bolletjes. Als de organoïden in de media uit elkaar lijken te zijn gevallen of verbrijzeld, duidt dit op een eerder probleem met lrECM dat is gepolymeriseerd, en organoïden kunnen nog steeds groeien, maar het is zeer onwaarschijnlijk dat ze uniform van grootte zijn.
  6. Plaats de kweekschaal van 10 cm in een celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 (zonder schudden) gedurende 4 dagen.
    OPMERKING: Het plaatsen van organoïden op een orbitale shaker in de eerste dagen kan ervoor zorgen dat ze uit elkaar vallen. Zorg ervoor dat ze niet schudden tot dag 4.
  7. Wissel na 4 dagen de media uit en plaats deze op een orbitale shaker met 80 RPM in een celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2.
    1. Het uitwisselen van media met onrijpe organoïden is een uitdaging omdat ze moeilijk te visualiseren zijn. Kantel de celkweekschaal en wacht minstens 20 s; de organoïden zullen zich aan de onderkant nestelen en de media van bovenaf langzaam kunnen verwijderen met een glazen of plastic pipet van 10-20 ml.
    2. Besteed zorgvuldig aandacht aan de verzameling organoïden aan de onderkant; als ze geroerd lijken met de kracht van mediaverwijdering, is het het beste om te pauzeren en ze toe te staan zich te hervestigen. Naarmate organoïden volwassener worden en gemakkelijker te visualiseren zijn, wordt dit proces minder genuanceerd.
      OPMERKING: Soms kan het plaatsen van een stuk donker papier onder de celkweekplaat helpen bij het visualiseren van onrijpe organoïden. Het wordt geadviseerd om geen Pasteur-pipet met vacuümafzuiging te gebruiken om media te verwijderen, omdat het heel gemakkelijk is voor de organoïden om op deze manier te worden opgezogen en verloren te gaan.
    3. Wanneer organoïden voor het eerst worden vastgesteld, verbruiken ze media niet zo snel als volwassen organoïden. Beginnen met 50% media-uitwisselingen vermindert onnodig mediagebruik en vermindert de kans op het per ongeluk beschadigen of aspirateren van nieuwe organoïden tijdens het media-uitwisselingsproces.

4. Het genereren van organoïden uit gevestigde GBM-bol, aanhanger of organoïde cultuur

OPMERKING: Het doel hier is om organoïden te maken die uniform zijn in grootte en celhoeveelheid voor gebruik in vergelijkende experimenten, dus gebruik een eencellig filter en tel cellen om dit te garanderen.

  1. Voorbereiding van eencellige suspensie van GBM-bolcultuur.
    OPMERKING: Bolculturen van GBM-cellen worden onderhouden in NBMc-media.
    1. Plaats de bollen in een centrifugebuis van 15 ml en draai gedurende 5 minuten op 120 x g .
    2. Verwijder het supernatant en voeg 2 ml RT-celloslatingsoplossing toe. Plaats gedurende 3 min in een incubator van 37 °C.
    3. Voeg 8 ml NBMc-media toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren. Zeef door een eencellige zeef (70 μm) en draai gedurende 5 minuten bij 120 x g.
    4. Verwijder het supernatant uit de buis en resuspenseer de resterende cellen in ~1 ml NBMc. Tel de cellen (met behulp van celindoorlatende kleuring) en ga verder met stap 4.4.
  2. Voorbereiding van eencellige suspensie van GBM-therapietrouw.
    1. Verwijder de gebruikte media van de plaat, voeg 2 ml RT-celloslatingsoplossing toe aan de plaat en plaats deze gedurende 3 minuten in een incubator van 37 °C.
    2. Controleer onder de microscoop of de cellen los zijn van de plaat.
    3. Voeg 8 ml NBMc-media toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren. Zeef door een eencellige zeef (70 μm).
      OPMERKING: Eencellige overbelasting is optioneel bij het werken met een hechtingscultuur.
    4. Draai gedurende 5 minuten bij 120 x g. Verwijder het supernatant uit de buis en resuspenseer de resterende cellen in ~1 ml NBMc. Tel de cellen (met behulp van celindoorlatende kleuring) en ga verder met stap 4.4.
  3. Voorbereiding van eencellige suspensie van GBM organoïde cultuur.
    1. Breng de organoïden over met een gesneden p1000 pipetpunt naar een kweekplaat van 10 cm en verwijder voorzichtig zoveel mogelijk resterende media.
    2. Gebruik twee steriele scheerapparaten om organoïden voorzichtig fijn te hakken. Verplaats met de gesneden p1000-punt de gehakte organoïden naar een centrifugebuis van 15 ml en voeg ~ 2-3 ml NBMc-media toe.
    3. Draai op 120 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant (raad aan om een pipetpunt te gebruiken in plaats van vacuümafzuiging voor dit onderdeel).
    4. Voeg gedurende 10 minuten 2 ml koudecelloslatingsoplossing toe.
      OPMERKING: Celloslatingsoplossing moet direct vanaf 4 °C worden gebruikt en niet eerst worden opgewarmd. Dit lijkt het resterende matrigel te verzachten en helpt bij het herstel van cellen.
    5. Ga vervolgens naar een incubator van 37 ° C gedurende 10-20 minuten, observeer en meng om de paar minuten. Als er klontering verschijnt, wat kan wijzen op cellyse, ga dan onmiddellijk verder met de volgende stap.
    6. Voeg 8 ml NBMc-media toe om de celloslatingsoplossing te verdunnen. Zeef door een eencellige zeef (70 μm) en draai gedurende 5 minuten bij 120 x g.
    7. Verwijder het supernatant uit de buis en resuspenseer de resterende cellen in ~1 ml NBMc. Tel de cellen (met behulp van celindoorlatende kleuring) en ga verder met stap 4.4.
  4. Organoïden maken van een eencellige suspensie
    1. Plaats in een ijsemmer of koud blok de lrECM en een kleine centrifugebuis. Plaats de juiste hoeveelheid lrECM (16 μL x X aantal beoogde organoïden) in de kleine centrifugebuis.
    2. Maak een mengsel van cellen in een totaal volume (4 μL x X aantal beoogde organoïden) dat 20.000 cellen/organoïde bevat en voeg dit toe aan de kleine centrifugebuis met lrECM op ijs.
    3. Pipetteer voorzichtig 20 μL van het lrECM/cel suspensiemengsel op parafilmmallen; dit zal een parelachtige druppel vormen.
      1. Zorg ervoor dat u het lrECM /cel suspensiemengsel grondig mengt, omdat de cellen de neiging hebben om zich gemakkelijk in de lrECM te nestelen, en dit zal resulteren in heterogene organoïden.
      2. Houd het lrECM/cel suspensiemengsel op ijs. Als lrECM opwarmt, kan het polymeriseren en de vorming van organoïden aantasten.
      3. Zorg ervoor dat u de pipetpunt om de twee tot drie organoïden koelt om lrECM-polymerisatie te voorkomen. Breng geen luchtbellen in organoïden (vermijd het "dubbel duwen" van de pipetpunt).
    4. Zodra het gewenste aantal organoïden op parafilmvorm is gepipetteerd in een kweekplaat van 10 cm, incubeer je bij 37 °C gedurende 1-2 uur in een celkweekincubator.
    5. Nadat organoïden zijn stollen, gebruikt u NBMc-media om ze voorzichtig van de parafilmvorm af te spoelen en in een nieuwe, steriele kweekplaat van 10 cm met 20 ml NBMc-totaal. Het gebruik van een p1000-tip werkt het beste om organoïden van de mal te spoelen; ze glijden er zachtjes af.
      OPMERKING: Ongeveer 15-20 organoïden per kweekschaal van 10 cm wordt aanbevolen.
    6. Plaats de kweekschaal van 10 cm gedurende 4 dagen in een couveuse (zonder te schudden).
    7. Wissel na 4 dagen de media uit en plaats deze op een orbitale shaker met 80 RPM in de celkweekincubator. Wissel daarna elke 2-3 dagen media uit.
      1. Het uitwisselen van media met onrijpe organoïden is een uitdaging omdat ze moeilijk te visualiseren zijn. Kantel de celkweekschaal en wacht minstens 20 s; de organoïden zullen zich aan de onderkant nestelen en de media van bovenaf langzaam kunnen verwijderen met een grote glazen pipet die open kan.
      2. Besteed zorgvuldig aandacht aan de verzameling organoïden aan de onderkant; als ze geroerd lijken met de kracht van mediaverwijdering, pauzeer dan en laat ze zich hervestigen. Naarmate organoïden volwassener worden en gemakkelijker te visualiseren zijn, wordt dit proces minder genuanceerd.
        OPMERKING: Soms kan het plaatsen van een stuk donker papier onder de celkweekplaat helpen bij het visualiseren van onrijpe organoïden. Gebruik geen Pasteur pipet met vacuümafzuiging om media te verwijderen, omdat het heel gemakkelijk is voor de organoïden om op deze manier te worden opgezogen en verloren te gaan.
      3. Wanneer organoïden voor het eerst worden vastgesteld, verbruiken ze media niet zo snel als volwassen organoïden. Begin met 50% media-uitwisselingen om onnodig mediagebruik te verminderen en de kans te verkleinen dat nieuwe organoïden per ongeluk worden beschadigd of geaspirateerd tijdens het media-uitwisselingsproces.

5. Cryo-embedding

  1. Plaats elke organoïde in een afzonderlijke buis van 1,5 ml (met behulp van gesneden p1000-tip) met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA). Bewaar organoïden 's nachts bij 4 °C. Als u organoïden in paraffine insluit, gaat u verder met rubriek 6.
  2. Na een nacht fixatie in 4% PFA, was de organoïden drie keer in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Breng de organoïde over in een nieuwe buis van 1,5 ml (met behulp van gesneden pipetpunt p1000) met 1 ml 30% sucrose in water en bewaar het bij 4 °C 's nachts.
  4. Voeg een kleine hoeveelheid (meestal 1-2 ml) optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) toe aan een cryomold, bedek de bodem en vul ongeveer 1/3 tot 1/2 van de diepte van de mal.
  5. Breng een enkele organoïde over naar cryomold met behulp van gesneden p1000 pipetpunt. Dit zal resulteren in sommige media die worden overgedragen met de organoïde, wat onvermijdelijk is. Gebruik een kleinere pipetpunt om de omliggende media voorzichtig te verwijderen zonder de organoïde te storen.
    OPMERKING: Dit kan moeilijk te visualiseren zijn, maar langzaam pipetteren zal een duidelijk verschil in dichtheden tussen media en OCT aantonen, dus dit wordt tot op zekere hoogte "op gevoel" gedaan).
  6. Leg de cryomold op een bakje droogijs. OCT zal beginnen te bevriezen en ondoorzichtig worden in het proces.
  7. Voeg extra OCT toe om de organoïde volledig te bedekken en vul de rest van het volume van de cryomold. Blokken kunnen worden bewaard bij -20 °C voor kortdurende opslag gedurende meerdere dagen of bij -80 °C voor langdurige opslag voor onbepaalde tijd.

6. Inbedding van paraffine

  1. Sorteer organoïden op grootte (kleine organoïden zijn minder dan 3 mm, grote organoïden zijn meer dan 3 mm). Breng elke organoïde over op een histologiecassette met behulp van een gesneden p1000 pipetpunt en verwerk tot paraffinewas volgens tabel 2 of tabel 3.
    OPMERKING: De grootte/configuratie van de histologiecassette is aan de gebruiker.
  2. Breng organoïden over van de cassettes naar insluitvormen met 1-2 ml gesmolten paraffine en koel deze totdat de was halfvast is.
  3. Zodra de was gedeeltelijk is gestold, voegt u meer was toe aan de bovenkant van de mal. Plaats de gelabelde cassettetop over de mal en breng deze over op een koude plaat. Blijf afkoelen totdat de was helemaal vast is.
  4. Wanneer de was is gestold, snijdt u het blok met behulp van een microtoom. U kunt ook bewaren bij RT of 4 °C voor latere snede.

7. Immunofluorescentie (IF)

  1. Deparaffiniseer en rehydrateer 5-12 μm paraffine-ingebedde weefselsecties met behulp van een schuifkleuringsschaal, volgens de volgende stappen.
    OPMERKING: Als u secties van OCT-ingebedde organoïden gebruikt, raden we u aan secties van 12 μm te gebruiken. Verwijder OCT door de dia in PBS gedurende 30 minuten te schudden. Ga verder met stap 7.2.
    1. Incubeer gedurende 5 minuten in xyleen. Herhaal dit nog twee keer. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in 100% ethanol. Herhaal dit nogmaals.
    2. Incubeer gedurende 10 minuten in 95% ethanol. Herhaal dit nogmaals. Was de secties in gedestilleerd water gedurende 5 minuten, twee keer.
  2. Voor het ontmaskeren van antigeen, dompelg dia's onder in 1x citraat ontmaskeringsoplossing (tabel van materialen) en magnetron op subkokende temperatuur gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat u de oplossing niet laat koken.
    OPMERKING: Dit wordt het best bereikt als u in eerste instantie ~ 2 minuten in de magnetron zet totdat het kookt, vervolgens het vermogen verlaagt en kijkt om ervoor te zorgen dat de oplossing niet overkookt. De gewenste ontmaskeringstemperatuur ligt net onder de 100 °C, idealiter 98 °C.
  3. Laat de dia's 30 min afkoelen op RT in de 1x citraat ontmaskeringsoplossing.
    OPMERKING: Dit is dezelfde 1x citraatoplossing; de oplossing hoeft in deze stap niet te worden vervangen.
  4. Was de dia's in gedestilleerd water gedurende 5 minuten, twee keer.
  5. Was de dia's in 1x TBST (Tris-buffered zoutoplossing met 0,1% Tween 20) buffer gedurende 5 min.
  6. Verwijder de dia's van TBST en droog ze voorzichtig rond weefselsecties met behulp van een laboratoriumreinigingsdoekje, terwijl u voorzichtig bent om het weefselgedeelte niet te laten drogen. Zodra de glijbaan voldoende droog is, cirkelt u weefselsecties met een hydrofobe barrièrepen.
  7. Blokkeer elke sectie met 100-400 μL 10% serumblokkerende oplossing gedurende 1 uur bij RT. Kies de serumblokkerende oplossing op basis van het secundaire antilichaam. Als u bijvoorbeeld een secundair antilichaam gebruikt dat in ezel is gemaakt, gebruik dan een 10% normaal ezelsserum in 1x TBST.
  8. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg vervolgens 100-400 μL primair antilichaam verdund tot de gewenste concentratie toe aan de blokkerende oplossing.
  9. Incubeer bij 4 °C de secties 's nachts met het primaire antilichaam.
  10. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de dia's in 1x TBST gedurende 5 minuten, drie keer.
  11. Voeg 100-400 μL secundair antilichaam (1:1000 verdunning in blokkerende oplossing, of volgens de aanwijzingen van de fabrikant) toe aan elke sectie en incubeer gedurende 1,5 uur bij RT.
  12. Was de dia's in 1x TBST gedurende 5 minuten, twee keer. Was vervolgens de dia's in 1x PBS gedurende 5 min.
  13. Verwijder de dia's van PBS en droog ze rond weefselsecties met behulp van een laboratoriumreinigingsdoekje. Voeg een paar druppels vloeibare uithardingshouder toe en monteer voorzichtig een glazen deklip. Zodra de dia's droog zijn, bewaren bij -20 °C beschermd tegen licht totdat u klaar bent voor beeldvorming.

8. Immunohistochemie

  1. Deparaffiniseer en rehydrateer de in paraffine ingebedde weefselsecties met behulp van een schuifkleuringsschaal, volgens de volgende stappen.
    OPMERKING: Als u secties van in OCT ingebedde organoïden gebruikt, verwijdert u OCT door de dia in PBS gedurende 30 minuten te schudden. Ga verder met stap 8.2.
    1. Incubeer gedurende 5 minuten in xyleen. Herhaal dit nog twee keer.
    2. Incubeer gedurende 10 min in 100% ethanol. Herhaal dit nogmaals.
    3. Incubeer gedurende 10 minuten in 95% ethanol. Herhaal dit nogmaals.
    4. Was secties in gedestilleerd water gedurende 5 minuten, twee keer.
  2. Voor het ontmaskeren van antigeen, dompelglijmen onder in 1x citraat ontmaskeringsoplossing en magnetron bij subkokende temperatuur gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat u de oplossing niet laat koken.
  3. Laat glijden 30 min afkoelen op RT in de 1x citraat ontmaskeringsoplossing.
  4. Was de dia's gedurende 5 minuten in gedestilleerd water, drie keer.
  5. Incubeer de dia's gedurende 10 minuten in 3% waterstofperoxide.
  6. Was de dia's twee keer 5 min in gedestilleerd water.
  7. Was de dia's gedurende 5 minuten in 1x TBST.
  8. Verwijder de dia's van 1x TBST en gebruik vervolgens de hoek van een laboratoriumreinigingsdoekje om zorgvuldig rond weefselsecties te drogen.
  9. Omcirkel de weefselsecties met een hydrofobe barrièrepen zodra de glijbaan droog is.
  10. Plaats 100-400 μL van de blokkerende oplossing op elke sectie binnen de hydrofobe barrièrepencirkel bij RT gedurende 1 uur. Gebruik 10% normaal ezelserum (NDS) of 0,75% runderserumalbumine (BSA) verdund in 1x TBST.
  11. Verwijder vervolgens de blokkerende oplossing en voeg 100-400 μL van het primaire antilichaam toe aan elke sectie. Verdun dit primaire antilichaam tot de gewenste concentratie met behulp van het verdunningsmiddel van de juiste fabrikant.
  12. Incubeer de secties bij 4 °C 's nachts. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de dia's in 1x TBST gedurende 5 minuten, drie keer.
  13. Voeg 100-400 μL IHC-detectiereagens toe aan elke sectie en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Kies het IHC-detectiereagens op basis van het primaire antilichaam.
  14. Was elke sectie met 1x TBST gedurende 5 minuten, twee keer, gevolgd door 1x PBS gedurende 5 minuten eenmaal.
  15. Bereid 3,3-Diaminobenzidine (DAB) oplossing volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Voeg 100-400 μL DAB-oplossing toe aan elke weefselsectie en controleer nauwkeurig onder een microscoop. Tussen 1-10 minuten zorgt voor een acceptabele kleuringsintensiteit; let op deze tijd en blijf consistent voor alle weefselsecties.
  16. Nadat de gewenste kleuringsintensiteit is bereikt, dompelt u de dia's onder in gedestilleerd water.
  17. Voer hematoxyline counterstain en slide dehydratie uit voor montage volgens de instructies in tabel 4.
  18. Verwijder de dia van de xyleenvervanger (Materiaaltabel) en veeg extra vloeistof rond het weefselgedeelte af met een laboratoriumreinigingsdoekje. Gebruik een kleine hoeveelheid permanent montagemedium om coverslip over het weefselgedeelte te monteren en laat drogen.

9. Meting van de totale levensvatbaarheid van cellen

  1. Breng elke organoïde over in een buis van 2 ml en verwijder met behulp van een kleine pipetpunt voorzichtig alle overtollige media rond de organoïde (zie figuur 3 voor het schema van deze procedure).
    OPMERKING: Cel levensvatbaarheidstests moeten worden uitgevoerd met organoïden die zijn gemaakt met identieke aantallen cellen. Dit experiment mag niet worden uitgevoerd op organoïden die rechtstreeks zijn gemaakt van patiëntmonsters van chirurgie, van het snijden van alredy gevormde organoïden of andere gevallen waarin afzonderlijke cellen niet werden gefilterd en geteld.
  2. Bereid het luminescerende levensvatbaarheidstestreagens en 1x PBS in een verhouding van 1:1 en voeg 500 μL toe aan elke buis.
  3. Gebruik een p1000 pipetpunt om agressief op en neer te pipetteren om de organoïde af te breken en laat 5 minuten zitten. De organoïde zou inmiddels wat gedissocieerd en zachter moeten zijn; herhaal het mengen met de p1000 pipetpunt opnieuw.
  4. Het doel is om 100 μL totaal volume per put van een 96-well plaat te hebben. Voeg 25 μL van het mengsel uit stap 9.3 toe (heeft voldoende voor meerdere technische replicaties) en voeg 75 μL resterende luminescerende cel levensvatbaarheidstest en PBS-mengsel toe.
  5. Leg het bord 2 min op een shaker en incubeer vervolgens 20 min bij RT.
  6. Lees de plaat af met behulp van een luminescentie-instelling op een platenlezer en verzamel de gegevens (zie figuur 4).

Resultaten

Figuur 1 toont vroege organoïde groei gezien via lichtmicroscopie bij 10x vergroting. Figuur 1A toont migratie en invasie van afzonderlijke cellen via lrECM in de middelste weergave. De cellen zullen de lrECM blijven uitbreiden en 'koloniseren', en ze zullen dichter en uiteindelijk ondoorzichtiger lijken door visuele inspectie. Figuur 1B toont verschillende volwassen organoïden (na 7 weken) zonder vergroting, ten opzichte van de grootte van een dubbeltje.

Figuur 2 toont immunohistochemische kleuring van GBM-organoïden voor fosfo-histon H3, een marker van actieve proliferatie. De meeste zeer proliferatieve cellen worden gezien in de organoïde omtrek in vergelijking met de organoïde kern. Positieve kleuring zal een bruin / koper uiterlijk hebben.

Figuur 3 beschrijft het proces om het totale celaantal in GBM-organoïden te homogeniseren en te meten met behulp van een 3D-specifieke luminescerende cel levensvatbaarheidstest. Vanwege het grote aantal cellen dat aanwezig is in GBM-organoïden, wordt de grotere organoïde structuur aanvankelijk gehomogeniseerd door tritureren in luminescerend testreagens. Vervolgens worden fracties van het totale organoïde lysaat in afzonderlijke putten geladen en verdund met extra luminescerend assayreagens voorafgaand aan incubatie en aflezing op een geschikte multi-well plaatlezer.

Figuur 4 geeft dmso-controlegegevens (common vehicle) weer voor organoïden. Uitgezette gegevens tonen intra-organoïde en inter-organoïde consistentie aan. Luminescerende levensvatbaarheidsgegevens worden doorgaans genormaliseerd naar controles voor elk monster bij het genereren van experimentele gegevens.

figure-results-1
Figuur 1: Bekijk door een lichtmicroscoop (10x). (A) Vroege organoïde groei die migratie / invasie van GBM-cellen in de lamininerijke extracellulaire matrix aantoont. (B) Rijpe organoïden ten opzichte van de grootte van een dubbeltje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunohistochemie van GBM-organoïden. (A, B) GBM-organoïden met fosfo-histon H3-gekleurde cellen voor actieve proliferatie. Scalebars zijn respectievelijk 600 μm en 300 μm voor A en B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Luminescent cell levensvatbaarheidsprotocol voor organoïden. (A) Verplaats individuele organoïden naar kleine centrifugebuizen en verwijder overtollige media. (B) Voeg 500 μL 1:1 PBS en luminescerend cel levensvatbaarheidstestmengsel toe aan elke buis en pipet agressief om de organoïde af te breken. (C) Voeg 25 μL van dit organoïde mengsel en 75 μL van hetzelfde 1:1 PBS en luminescerende cel levensvatbaarheidstestmengsel toe aan elk putje van een 96-wells plaat. (D) Plaats op een shaker gedurende 2 minuten, gevolgd door incubatie gedurende 20 minuten bij RT, en lees vervolgens luminescentie op een plaatlezer. Figuur gemaakt met behulp van BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Levensvatbaarheid van cellen. Cel levensvatbaarheidsgegevens voor organoïden in 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) voor zes technische replicaties van vier organoïden voor vier patiëntmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BestanddeelHoeveelheid
Neurobasaal medium minus fenol rood500 ml
B-27 supplement minus vitamine A (50x)10 ml
Antibioticum-antimycotisch (100x)5 ml
Natriumpyruvaat (100 mM)5 ml
Glutamine in 0,85% NaCl (200 mM)5 ml
Recombinant humaan FGF basic (250 μg/ml)20 μL
Recombinant humaan EFG-eiwit (250 μg/ml)20 μL
Fenol rood500 μL

Tabel 1: Neurobasal medium complete (NBMc) formulering

ReagensTijd
50% Ethanol3 min.
75% Ethanol3 min.
95% Ethanol3 min.
95% Ethanol4 min.
100% Ethanol2 min.
100% Ethanol3 min.
100% Ethanol4 min.
Xyleenvervanger2 min.
Xyleenvervanger3 min.
Xyleenvervanger4 min.
Paraffine15 min.
Paraffine15 min.

Tabel 2: Verwerkingsschema voor kleine organoïden (met een diameter van minder dan 3 mm)

ReagensTijd
50% Ethanol6 min.
75% Ethanol6 min.
95% Ethanol5 min.
95% Ethanol8 min.
100% Ethanol5 min.
100% Ethanol5 min.
100% Ethanol8 min.
Xyleenvervanger5 min.
Xyleenvervanger5 min.
Xyleenvervanger8 min.
Paraffine30 min.
Paraffine30 min.

Tabel 3: Verwerkingsschema voor grote organoïden (met een diameter van meer dan 3 mm)

ReagensTijd
Hematoxyline2 min.
Lopen diH2O2 min.
Nucleair hematoxyline-verhelderend reagens1 min
Lopen diH2O1 min
Bluing Reagens1 min
Lopen diH2O2 min.
70% ethanol1 min
100% ethanol1 min
100% ethanol1 min
Xyleenvervanger2 min.
Xyleenvervanger2 min.

Tabel 4: Hematoxyline counterstain

Discussie

GBM-organoïden zijn een complementaire kweekmethode met traditionele sferen die een grotere cellulaire en micro-omgeving heterogeniteit omvatten 4,22,30. Hoewel meer tijd- en middelenintensief, kan organoïde cultuur waardevol inzicht bieden in intratumoraal gedrag en mechanismen van medicijnresistentie.

GBM wordt aangedreven door een populatie van CSC's 5,31, en deze methoden zijn ontwikkeld om verdere groei en zelfvernieuwing van deze CSC-populatie mogelijk te maken. Van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblastgroeifactor (FGF) is bekend dat ze het onderhoud en de groei van stamcellen verbeteren en actieve receptor tyrosinekinase (RTK) signalering bieden. De vorming van heterogene cellulaire populaties en verschillende tumormicro-omgevingen binnen GBM-tumoren is afhankelijk van het ondersteunen van CSC-gedrag. De selectie van een lrECM bootst de lamininerijke hersenomgeving na en ondersteunt de cellen in organoïde cultuur om zichzelf te organiseren en te migreren door invasie. Hoewel sommige groepen organoïde cultuur hebben gevestigd zonder het gebruik van een lrECM of EGF / FGF verrijkte media 24,28, die een meer tijdsefficiënte manier van deze kweekmethode en een sterkere selectie van oncogene signalering kunnen bieden om de groei te stimuleren, werden deze methoden gekozen om de pro-stamcelomgeving te optimaliseren om de cellulaire heterogeniteit van organoïden het best vast te stellen. Zowel cerebrale organoïden als GBM-organoïden zijn in de literatuur eerder met lrECM gemaakt 21,32,33. Hoewel we gegevens hebben vastgesteld over de tumorpopulaties die worden aangetroffen in organoïden en de ruimtelijke variatie, is er minder bekend over niet-tumorpopulaties binnen de organoïden en hoe lang ze overleven van de oorspronkelijke patiëntmonsters. Bepaalde IHC-vlekken (zoals CD45) kunnen deze gegevens leveren en kunnen in de toekomst een interessant onderzoekspunt zijn met organoïden.

Het kennen van het beoogde gebruik voor organoïde cultuur is belangrijk voor het selecteren van geschikte methoden. Het vaststellen van organoïden uit primaire specimens versus het kweken van uniforme organoïden voor specifieke experimenten hebben enigszins verschillende procedures. Waardering hebben voor hoe organoïden rijpen en visueel de lrECM-steiger invullen, is belangrijk om de juiste tijd en middelen te kunnen toewijzen aan organoïdecultuur. Schaarse gebieden van cellen in organoïden zullen langzaam uitzetten en groeien om de lrECM te vullen, wat 2-8 weken kan duren, afhankelijk van het gedrag van het monster. Deze groeisnelheid is enigszins intrinsiek aan elk exemplaar; het wordt bewaard over verschillende partijen organoïden en redelijk consistent met de relatieve snelheid van bolgroei. Organoïden kunnen langer dan 1 jaar worden gehandhaafd en behouden tumorvormingsmogelijkheden op xenograft in muizen; het wordt echter aanbevolen om ze te laten groeien met een duidelijk doel om geen laboratoriumbronnen (zowel materialen als tijd) te verspillen4. Organoïde groei is getest in meerdere putgroottes en -formaten en toont aan dat een plaat van 10 cm de ideale instelling is voor het handhaven van optimale cel levensvatbaarheid, gevolgd door een 6-well plaat met drie organoïden per put34. Organoïden verbruiken meer media in vergelijking met hun tweedimensionale kweek tegenhangers, en het gebruik van een kleiner putformaat leidt niet tot goed onderhoud. Een put van een 96-well formaat plaat heeft bijvoorbeeld niet genoeg ruimte of mediavolume ten opzichte van de grootte van een organoïde om organoïde groei te ondersteunen.

Zoals organoïden vaststellen, is oplettend zijn belangrijk voor het vergroten van succes. Aanvankelijk zullen organoïden media langzaam consumeren, maar naarmate ze dichter en volwassener worden, zullen ze media sneller consumeren. Het toevoegen van fenolrood aan de media kan helpen als indicator van mediaconsumptie. Wanneer de media meer geel zijn, kan dit ons ertoe aanzetten het voedingspatroon aan te passen, of het nu gaat om het uitwisselen van een groter volume media, het verhogen van de totale mediahoeveelheid in de plaat, het verdelen van organoïden over meerdere celkweekplaten om hun groei bij te houden, of zelfs het aanpassen van de tijdlijn voor experimenten.

In veel opzichten zijn organoïden een inefficiënte manier om kankeronderzoek uit te voeren. Ze omvatten lange tijdschalen en zijn duur en zwaar in vergelijking met de GBM-sfeercultuur. In vergelijking met patiënt-afgeleide xenografts, een alternatieve methode voor het recreëren van cellulaire en micro-omgevingsdiversiteit, zijn ze echter eenvoudiger, goedkoper en controleerbaar. Selectie van wanneer organoïden het beste kunnen worden gebruikt, is belangrijk voor kankeronderzoekers. Ze zijn niet bedoeld om de traditionele bol of aanhangcultuur te vervangen en niet om xenograftmodellen te vervangen. Organoïden kunnen, wanneer ze worden toegepast op de juiste wetenschappelijke vraag, de voordelen van beide systemen combineren en kunnen ons in staat stellen tumorcelbiologie te observeren die anders verborgen zou blijven. De wetenschappelijke gemeenschap begint pas te begrijpen welke leermogelijkheden organoïden bieden, maar het is duidelijk dat ze in de toekomst een waardevol hulpmiddel zullen zijn om de complexe biologie van GBM te begrijpen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Justin Lathia bedanken voor zijn onschatbare advies en voortdurende steun. We bedanken ook Katrina Fife, Lisa Wallace en Maya Camhi voor hun uitstekende technische ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tabletsMP Biomedicals089806813,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets
96-well PCR platesThermoFisher Scientific96-well PCR plates
AccutaseThermoFisher ScientificSCR005Cell detachment solution
Antibiotic-antimycoticThermoFisher Scientific15240062Antibiotic-antimycotic
B-27 supplement minus vitamin AThermoFisher Scientific12587001B-27 supplement minus vitamin A (50x)
GelCode Blue Stain ReagentThermoFisher Scientific24590Bluing reagent
Cell strainer (70 µm)CellTreat Scientific229483Cell strainer (70 µm)
CellTiter-Glo 3DPromegaG9681Luminescent cell viability assay
Clarifier 2ThermoFisher Scientific7301Nuclear hematoxylin clarifying reagent
Clear-Rite 3ThermoFisher Scientific6901xylene substitute
Epredia Gill 2 HematoxylinThermoFisher Scientific72504Hematoxylin
Glutamine in 0.85% NaClThermoFisher Scientific35050061Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)
MatrigelThermoFisher Scientific354234Laminin-enriched extracellular matrix
Mini PAP penThermoFisher Scientific008877Hydrophobic barrier pen
Mounting mediumThermoFisher Scientific22-050-102Mounting medium
Neurobasal media minus phenol redThermoFisher Scientific12349015Neurobasal media minus phenol red (500 mL)
Normal donkey serum (NDS)Jackson ImmunoResearch017-000-121Normal donkey serum (NDS)
Paraformaldehyde 4% in PBSThermoFisher ScientificAAJ19943K2Paraformaldehyde 4% in PBS
Phenol redSigmaP0290Phenol red (0.5%)
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisher ScientificP10144Liquid curing mountant
Recombinant human EGF proteinR&D systems236-EG-01MRecombinant human EGF protein (250 µg/mL)
Recombinant human FGF basicR&D systems4144-TC-01Recombinant human FGF basic (250 µg/mL)
SignalStain Antibody DiluentCell Signaling8112Antibody diluent
SignalStain Boost IHC Detection ReagentCell Signaling8114Immunohistochemistry detection reagent
SignalStain Citrate Unmasking SolutionCell Signaling14746Citrate unmasking solution
Single edge razor bladeUlineH-595BSingle edge razor blade
Sodium pyruvateThermoFisher Scientific11360070Sodium pyruvate (100 mM)
Tissue-Tek CryomoldsVWR25608-916Disposable cryomolds
Tissue-Tek O.C.T. CompoundVWR25608-930Optimal cutting temperature compound
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificT10282Cell impermeant stain (0.4%)
XyleneThermoFisher ScientificX3P-1GALXylene

Referenties

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7(2018).
  3. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
  4. Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
  5. Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
  6. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
  7. Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
  8. Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
  9. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  10. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).
  11. Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
  12. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
  13. Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
  14. Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
  15. Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
  16. Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
  17. Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
  18. Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
  19. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
  20. Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
  21. Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416(2021).
  22. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
  23. da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
  24. Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  25. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  26. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  27. Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  28. Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).
  29. Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).
  30. Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).
  31. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  32. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  33. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  34. Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Glioblastoom organo dentumoromgevingimmunohistochemieimmunofluorescentiecellevensvatbaarheidsingle cel suspensieFACS analyse
Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.