Bij excitatoire synapsen in de hersenen van zoogdieren activeert presynaptisch vrijgekomen glutamaat receptoren die ingebed zijn in het postsynaptische membraan1,2. De sterkte van deze synaptische verbindingen ondergaat ervaringsafhankelijke plasticiteit, een eigenschap die diverse vormen van leren en geheugen mogelijk maakt3,4,5,6,7,8,9. Pathologische veranderingen in het aantal synapsen en hun signaaleigenschappen leiden tot veranderde circuitactiviteit en informatieverwerking, zoals gezien wordt bij talrijke neurologische en psychiatrische stoornissen10,11,12. Daarom is er een kritische behoefte om de onderliggende mechanismen te begrijpen die de neurale connectiviteit en de sterkte van synaptische verbindingen bepalen.
Excitatoire synapsen vormen zich op dendritische stekels, kleine postsynaptische uitsteeksels die scaffold-eiwitten, receptoren, signaalfactoren, cytoskeleteneiwitten en organellen voor verkeer bevatten1,2,13,14,15,16. Deze micrometergrote signaalcompartimenten maken controle van de synaptische sterkte mogelijk op basis van elke afzonderlijke synapse13,16. De morfologie van dendritische stekels varieert langs de lengte van de neuronale dendrieten, waarbij stekelvormen typisch worden beschreven als dun, filopodiaal, stomp, paddenstoelvormig of vertakt13. Belangrijk is dat de stekelvorm gecorreleerd is met synaptische functie en stabiliteit. Grotere stekels hebben bijvoorbeeld een groter aantal receptoren en een grotere synaptische sterkte16,17,18. In tegenstelling tot dunne stekels kunnen grotere stekels maandenlang in vivo bestaan, een eigenschap die stabiele synaptische verbindingen en langetermijngeheugenopslag mogelijk maakt19,20.
Stekelmorfologie en -dichtheid langs een dendriet worden vaak gevolgd om de mate van neurale connectiviteit en de eigenschappen van excitatoire synapsen in een bepaald hersengebied te onderzoeken, zowel in normale als in ziektoestand13. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de morfologie van stekels te visualiseren in verschillende weefselpreparaten en modelsystemen met behulp van standaard licht- en fluorescentiemicroscopie, evenals superresolutie- en elektronenmicroscopie (EM)21. Deze krachtige beeldtechnieken hebben een enorm inzicht geboden in ons huidige begrip van hersenorganisatie, functie en ziekte. Deze verzameling methoden omvat belangrijke beeldtechnieken om de morfologische complexiteit van dendrieten en stekels te monitoren, evenals optogenetische hulpmiddelen om neurale activiteit in dendrieten en enkele stekels te activeren en meten.
Pekarek et al.22 presenteren een relatief snelle, hoog-doorvoer protocol om de structuur van neuronale dendrieten diep in intact zenuwweefsel te beeldhouwen en te kwantificeren. De auteurs voeren Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) uit, een weefselclearingtechniek die lipiden uit het hersenweefsel verwijdert en helpt lichtverstrooiing tijdens daaropvolgende beeldvorming te minimaliseren23. Na clearing werden Z-stacks van neuronen die fluorescente eiwitten tot expressie brengen verzameld door confocale of twee-foton microscopie. Beeldanalyse en geautomatiseerde kwantificering maakten nauwkeurige metingen van stekeldichtheid en -vorm mogelijk, evenals complexiteit van dendritische bomen. Dit protocol maakt gelijktijdige beeldvorming mogelijk van structuren variërend van enkele stekels tot dendritische bomen en elimineert de tijdrovende en mogelijk schadelijke stap van dun-sectie snijden. Deze techniek zal zeer nuttig zijn voor onderzoekers die veranderingen in stekelmorfologie en dendritische complexiteit in intact hersenweefsel willen kwantificeren na de introductie of verwijdering van een gen(en) van belang.
Golgi-kleuring, ontwikkeld meer dan 100 jaar geleden24, blijft een krachtig hulpmiddel om de organisatie van het zenuwstelsel en neuronale morfologie te visualiseren. In deze methode worden schaarse populaties neuronen gekleurd door microkristallisatie van zilverchromat, waardoor visualisatie van axonen, dendritische bomen en stekels mogelijk is25. Frankfurt en Bowman26 beschrijven een snel Golgi-impregnatieprotocol om neuronen en dendritische stekels in de hippocampus en mediale prefrontale cortex van de rat te visualiseren. De auteurs demonstreren hoe weefsel voorbereid, gekleurd en geïmager kan worden voor daaropvolgende lichtmicroscopie, evenals het kwantificeren van stekeldichtheid langs dendritische bomen. Het hier beschreven protocol levert consistente, betrouwbare impregnatie van neuronen op en vermindert de blootstelling aan giftige chemicaliën.
Terwijl licht- en fluorescentiemicroscopie goed geschikt zijn voor het beeldvormen van dendrieten en stekels, maakt EM visualisatie met nanometerresolutie van pre- en postsynaptische structuren mogelijk21. EM-benaderingen worden typisch gebruikt om de ultrastructurele eigen