Methodenartikel

Analyse van granulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factorproducerende T-helpercellen in een muismodel van contactovergevoeligheid

DOI:

10.3791/63755

⸱

10 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Human Disease and Immunotherapies, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Immunology and Inflammation, Frontiers Science Center for Disease-Related Molecular Network, West China Hospital, Sichuan University, 3Core Facilities of West China Hospital, Sichuan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een eenvoudige en gestandaardiseerde methode voor het analyseren van de granulocyt-macrofaagkolonie-stimulerende factorproducerende T-helper-subset in vivo.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parallel aan traditionele Th1/Th2/Th17/Treg-lijnen zijn granulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factorproducerende T-helpercellen (Th-GM) geïdentificeerd als een afzonderlijke subset van T-helpercellen (GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A-IL-22-effector CD4+ T-cellen) bij mensen en muizen. Contactovergevoeligheid (CHS) wordt beschouwd als een uitstekend diermodel voor allergische contactdermatitis (ACD) bij de mens, die een intacte T-cel-gemedieerde immuunrespons manifesteert. Om een gestandaardiseerde en uitgebreide test te bieden voor de analyse van de Th-GM-celsubset in de T-celafhankelijke immuunrespons in vivo, werd een muizen CHS-model geïnduceerd door sensibilisatie/provocatie met een reactief, organisch hapteen, 2,4-dinitrofluorbenzeen (DNFB) met een laag moleculair gewicht. De Th-GM-subset in effector CD4+ T-cellen gegenereerd na immunisatie met het hapteen werd geanalyseerd door middel van flowcytometrie. We ontdekten dat Th-GM voornamelijk werd verlengd in laesies en drainerende lymfeklieren in het DNFB-geïnduceerde CHS-muismodel. Deze methode kan worden toegepast om de biologie van Th-GM-cellen verder te bestuderen en farmacologisch onderzoek naar therapeutische strategieën gericht op GM-CSF bij verschillende aandoeningen, zoals ACD.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De granulocyt-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF)-producerende T-helpercellen - de Th-GM-subset - is naar voren gekomen als een afzonderlijke subset van T-helpercellen bij mensen en muizen en wordt beschouwd als "alleen GM-CSF-expressie" (GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22-) CD4 T-cellen geïdentificeerd door eencellige RNA-analyse, massacytometrie en GM-CSF fate mapper muizen 1,2,3. In 2014 rapporteerden Sheng et al. signaaltransducer en activator van transcriptie 5 (STAT5) programmering van de Th-GM-subset en conceptualiseerden voor het eerst de "Th-GM"-subset 4,5. Th-GM-cellen worden gekenmerkt door cytokine-expressie van GM-CSF-, IL-2-, TNF-α-, IL-3-, CCL20- en chemokinereceptoren C-X-C chemokinereceptortype (CXCR) 4 of CXCR6 1,2. STAT en/of de NF-κB-route zijn essentieel voor de differentiatie van de Th-GM-lijn. Er werd een in vitro methode ontwikkeld om naïeve CD4 T-cellen te differentiëren tot Th-GM-cellen met behulp van IL-7 in aanwezigheid van TCR-stimuli6. Ondertussen werd aangetoond dat de cytokines IL-23 en IL-1β de expressie en pathogeniteit van Th-GM-cellen ex vivo 3,7 behouden.

Verhoging van Th-GM-cellen is in verband gebracht met verschillende auto-immuunziekten, zoals multiple sclerose en reumatoïde artritis 2,8,9, wat een mogelijke rol suggereert in de pathogenese van auto-immuniteit10. Steeds meer bewijs suggereert dat GM-CSF kan functioneren als een ontstekingsmediator. Muizen die Csf2 (gen dat codeert voor GM-CSF) genetisch tot overexpressie brachten in CD4+ T-cellen ontwikkelden spontaan neurologische stoornissen die gepaard gingen met de infiltratie van fagocyten in het centrale zenuwstelsel. In een T-cel-overdracht colitismodel verminderde de adoptieve overdracht van Csf2-/--T-cellen naar Rag1-/-muizen de klinische en histopathologische kenmerken van de ziekte aanzienlijk. Er zijn echter weinig meldingen van de rol van de Th-GM-subgroep bij allergische aandoeningen, zoals ACD.

ACD is een van de meest voorkomende inflammatoire dermatologische aandoeningen met een hoge prevalentie in werk- en leefomgevingen11,12. Het is een type IV vertraagde overgevoeligheidsrespons die wordt gemedieerd door een intact immuuncircuit dat zich ontwikkelt in twee temporeel gesegmenteerde fasen: sensibilisatie en elicitatie. Menselijke ACD wordt veroorzaakt door blootstelling aan bepaalde chemicaliën (haptenen of metalen) die tot sensibilisatie leiden. Tijdens deze fase wordt een T-cel-gemedieerde respons geprimed door hapteen-eiwitcomplexen die worden gepresenteerd door antigeenpresenterende cellen. Bij daaropvolgende blootstelling aan hetzelfde hapteen worden hapteenspecifieke effector- en geheugen-T-cellen gereactiveerd en gelokaliseerd in de huid, een proces waarbij een verscheidenheid aan immuuncelpopulaties wordt geïnfiltreerd. Deze acute ontstekingsreactie staat bekend als elicitatie, wat resulteert in de volledige ontwikkeling van laesies13. Menselijke ACD kan worden bestudeerd met behulp van diermodellen van contactovergevoeligheid (CHS)14.

Het CHS-model geïnduceerd door een reactief, laag moleculair gewicht, organisch hapteen, 2,4-dinitrofluorbenzeen (DNFB), is een veelgebruikt muizenmodel dat is gebruikt bij de studie van de pathologie en mogelijke therapeutische interventies van ACD15,16. Dit T-celafhankelijke model zou dus kunnen worden toegepast om de generatie van de Th-GM-subset bij allergische aandoeningen te bestuderen. Hier hebben we een muizenmodel van CHS met DNFB geïnduceerd, de generatie van Th-GM in laesies en drainerende lymfeklieren geanalyseerd en vastgesteld dat de Th-GM-subset voornamelijk werd uitgebreid bij hernieuwde blootstelling aan hetzelfde hapteen. Dit suggereert dat de Th-GM-subset essentieel zou kunnen zijn voor de ontwikkeling van ACD en een specifiek therapeutisch doelwit is bij ACD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muizen die in dit protocol werden gebruikt, hadden een genetische achtergrond van C57BL/6, werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden en waren ad libitum voorzien van voedsel en water. Alle experimenten werden goedgekeurd door de ethische beoordelingsinstantie voor dierenwelzijn van het West China Medical Center, Sichuan University (20210302059).

1. Reagens en materiaalvoorbereiding

  1. 0,5% DNFB-oplossing als sensibilisator
    1. Bereid voor sensibilisatie van 10 muizen 1.1 ml aceton/olijfolie 4:1 (v/v) mengsel: meng 880 μL aceton en 220 μL olijfolie om 0.1 ml overtollig volume toe te laten om eventuele kleine volumeverliezen te compenseren. Voeg 5 μL DNFB toe aan 1,1 ml gehomogeniseerd aceton/olijfolie 4:1 mengsel.
      OPMERKING: Bereid vers op de dag van sensibilisatie. Het mengsel van aceton en olijfolie moet in een zuurkast worden bereid.
  2. 0,2% DNFB-oplossing als challenger
    1. Om 10 muizen uit te dagen, voegt u 0,5 μL DNFB toe in 0,25 ml van een gehomogeniseerd aceton/olijfolie 4:1 mengsel beschreven in stap 1.1. Gebruik het 4:1-mengsel van aceton en olijfolie als middel om de muizen na sensibilisatie uit te dagen.
      OPMERKING: Het mengsel van aceton en olijfolie moet in een zuurkast worden bereid.
  3. Chloraalhydraat als verdovingsmiddel
    1. Los 4 g chloraalhydraat op in 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een 8% werkende oplossing te maken. Filtreer en bewaar tot 3 maanden bij 4 °C. Gebruik 5 μL per g lichaamsgewicht voor een muis.
  4. 50x collagenase IV bouillon
    1. Los 100 mg collagenase IV op in 1 ml basisch RPMI 1640 medium (niet aangevuld met antibiotica of foetaal runderserum [FBS]) om een voorraad van 100 mg/ml te maken. Bewaren bij -20 °C in 100 μL aliquots gedurende maximaal 6 maanden.
  5. 1.000x DNase Ik voorraad
    1. Los 5 mg DNase I op in 1 ml 0,15 M NaCl om een bouillon van 5 mg/ml te maken. Bewaren bij -20 °C in 100 μL aliquots gedurende maximaal 6 maanden.
  6. Buffer stoppen
    1. Los 1.681 g EDTA op in 50 ml basisch RPMI 1640 medium om een bouillon van 100 mM te maken. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
  7. Wassen medium
    1. Los 0,372 g EDTA op tot een eindconcentratie van 2 mM en 5 ml FBS tot een eindconcentratie van 1% met 500 ml PBS. Filtreer en bewaar bij 4 °C tot 1 maand.
  8. Kleuring buffer
    1. Los 0,372 g EDTA op tot een eindconcentratie van 2 mM en 10 ml FBS tot een eindconcentratie van 2% met 500 ml PBS. Filtreer en bewaar bij 4 °C tot 1 maand.
  9. Restimulatie reagentia
    1. Los 1 mg phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) op in 20 ml DMSO om een bouillon van 50 μg/ml (500x) te maken en bewaar deze bij -20 °C in 50 μl porties.
    2. Verdun 250 μL ionomycine in oplossing (4 mg/ml) in 7,75 ml DMSO om een voorraad van 500 μg/ml (500x) te maken en bewaar deze bij -20 °C in 50 μL aliquots.
    3. 1 ml eiwittransportremmeroplossing (die brefeldin A bevat) in 50 μl en bewaar de aliquots bij 4 °C.

2. Inductie van CHS bij muizen

  1. Verdoof de muizen op dag -5 door 400 mg/kg chloraalhydraat intraperitoneaal te injecteren.
  2. Scheer met een scheerapparaat voor huisdieren een gebied van 2 cm × 2 cm op de buik van de muis.
    OPMERKING: Vermijd krassen op de huid van de muis; Houd de integriteit van de huidbarrière intact.
  3. Smeer 100 μL 0,5% DNFB-oplossing voorzichtig en gelijkmatig op de geschoren buik met een micropipet met wegwerptips. Houd de muizen 5-10 s vast om een deel van het oplosmiddel te laten verdampen.
  4. Herhaal op dag -4 stap 2.1-2.3 voor een nieuwe sensibilisatie.
    OPMERKING: Twee sensibilisatievoorvallen werken beter dan één.
  5. Daag op dag 0 het rechteroor van de muizen uit met 20 μL 0,2% DNFB met behulp van een micropipettor met wegwerptips en behandel het linkeroor met hetzelfde volume aceton/olijfolie 4:1 mengsel als het medium.
    OPMERKING: Daag de dorsale en ventrale zijden van het oor uit met gelijke hoeveelheden DNFB of medium.
  6. Meet in de komende 3 dagen dagelijks de oordikte van het rechter- en linkeroor van muizen met behulp van een diktemeter met wijzerplaat en bereken de toename van de oordikte: dikte van het rechteroor - dikte van het linkeroor.
    OPMERKING: Een geleidelijke toename van de oordikte kon worden waargenomen bij 0,2% DNFB-uitgedaagde muizenoren in vergelijking met met vehiculum behandelde oren.

3. Monsterafname van CHS-muizen

  1. Verdoof de muizen op dag 3 door een intraperitoneale injectie van 400 mg/kg chloraalhydraat. Wacht 5-10 minuten totdat de muis bewusteloos is en knijp zachtjes in beide achterpoten om te bevestigen dat de muizen diep verdoofd zijn.
  2. Maak een foto van elk oor per muis met behulp van een camera. Scoor de korst (schilfering op het oor) en roodheid van het oor (erytheem op het oor) onafhankelijk om de ernst van de ontsteking te evalueren op een schaal van 0 tot 5: 0, geen; 1, licht; 2, matig; 3, gemerkt; 4, zeer duidelijk; 5, de ernstigste.
  3. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Snijd het hele oor af en ontleed de parallelle drainerende lymfeklieren van muizen met behulp van een steriele scherpe schaar en tang. Plaats de weefsels in een putje van een plaat met 6 putjes op ijs met 5 ml voorgekoelde PBS voor enzymatische of fysische dissociatie om eencellige suspensies te genereren (aanvullende afbeelding S1A en aanvullende afbeelding S2A).
  4. Fixeer voor histologische analyse de oormonsters in 4% paraformaldehyde, dehydrateer ze en sluit ze in paraffine in voor immunohistochemische kleuring, zoals elders beschreven17.

4. Bereiding van eencellige suspensie uit de oren

  1. Splits de ventrale en dorsale zijden van het oor door de afgeknipte uiteinden samen te knijpen en te scheuren met twee gebogen tangen (aanvullende afbeelding S1B). Plaats ze in een putje van een plaat met 6 putjes met 4.5 ml spijsverteringsbuffer en zorg ervoor dat die weefsels volledig worden ondergedompeld in de spijsverteringsbuffer (aanvullende afbeelding S1C).
    OPMERKING: De digestiebuffer was samengesteld uit RPMI 1640 met 10% FBS + 25 mM HEPES + 2 mg/ml collagenase IV + 5 μg/ml DNase I.
  2. Incubeer de bijsluiters gedurende 20 minuten in een celkweekbroedmachine van 37 °C. Knip de bijsluiters met een schaar zo klein mogelijk af om de weefselvertering te vergemakkelijken (aanvullende figuur S1D) en plaats het monster nog 40 minuten terug in de couveuse.
    OPMERKING: Efficiënte spijsvertering kan binnen 40-50 minuten worden bereikt. Oververtering bij 37 °C beïnvloedt de levensvatbaarheid van de cellen.
  3. Voeg 0,5 ml stopbuffer per putje toe om de enzymatische activiteiten van collagenase IV en DNase I te neutraliseren. Voer de volgende stappen uit op ijs.
  4. Breng de oorweefselfragmenten met een gebogen tang over naar een centrifugebuis van 50 ml met een celzeef van 70 μm en pipetteer het hele volume van het medium in dezelfde celzeef.
  5. Verbreek de weefsels met behulp van het bovenste uiteinde van een zuiger van een spuit van 1 ml. Druk in cirkelvormige beweging tegen de 70 μm celzeef totdat er alleen nog wit bindweefsel overblijft (aanvullende afbeelding S1D).
  6. Spoel de celzeven twee keer met 1.000 μL wasmedium. Breng het volledige volume van de put over in een centrifugebuis van 50 ml via een celzeef van 40 μm. Houd de tube op ijs.

5. Bereiding van eencellige suspensies van drainerende lymfeklieren (dLN's)

  1. Breng de lymfeklieren met een gebogen tang over naar een celzeef van 70 μm bovenop het putje van een plaat met 6 putjes (aanvullende figuur S2B). Dissocieer de lymfeklieren met behulp van het bovenste uiteinde van een zuiger van een spuit van 1 ml. Druk in cirkelvormige bewegingen tegen de 70 μm celzeef totdat er alleen wit vuil overblijft (aanvullende afbeelding S2C).
  2. Spoel de celzeef twee keer met 1.000 μL wasmedium. Breng het volledige volume van de put over in een buis van 5 ml. Houd de buizen op ijs.

6. Restimulatie van de Th-GM-subgroep met 12-myristaat 13-acetaat (PMA)/ionomycine in aanwezigheid van een eiwittransportremmer

  1. centrifugeer de cellen geïsoleerd uit het oor en de drainerende lymfekliermonsters gedurende 8 minuten bij 400 × g bij 4 °C en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 1.000 μL wash medium.
  2. Verzamel een klein deel van elk monster om het totale aantal cellen afkomstig van het oor en de afvoerende lymfeklier te tellen met behulp van een hemocytometer. Voeg 0,04% trypanblauw toe om de levensvatbaarheid van de cellen te meten.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cellen moet meer dan 60% zijn voor daaropvolgende T-celstimulatie en -analyse. De celdichtheid kan 1-5 × 106/ml zijn.
  3. Centrifugeer de cellen in stap 6.1 en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 1.000 μL RPMI 1640-medium dat 2% FBS bevat, en zaai 1 ml van de eencellige suspensie (106 cellen/ml) in weefselkweekplaten met 12 putjes met platte bodem.
  4. Voeg 2 μL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (eindconcentratie 100 ng/ml), 2 μL ionomycine (eindconcentratie 1.000 ng/ml) en 1 μL eiwittransportremmer (met Brefeldin A) toe aan elk putje in de plaat met 12 putjes die 1 ml van de eencellige suspensie hierboven bevat en incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur.

7. Analyse van Th-GM-subsets die in vivo worden gegenereerd door celoppervlak en intracellulaire kleuring

  1. Breng de gestimuleerde cellen met behulp van een pipet over in centrifugebuisjes van 1,5 ml. Centrifugeer de centrifugebuisjes gedurende 8 minuten bij 400 × g bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande weg.
  2. Was de celpellet eenmaal met 1 ml kleuringsbuffer en pellet de cellen door centrifugeren, zoals beschreven in stap 7.1. Resuspendeer de cellen bij 1-10 × 106/ml in 0,5 ml kleuringsbuffer.
  3. Voeg onmiddellijk 0,5 μl levensvatbare kleurstofoplossing (zie de materiaaltabel) toe aan 0,5 ml celsuspensie en vortex. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen twee keer met 1 ml kleuringsbuffer en herhaal de centrifugatie in stap 7.1 om de cellen te pelleteren.
  4. Resuspendeer de pellet in 0,1 ml kleuringsbuffer. Voeg 1 μl anti-CD4-antilichaam (FITC-geconjugeerd), 1 μl anti-CD44-antilichaam (APC-geconjugeerd) en 1 μl anti-CD62L-antilichaam (PE/cyanine7-geconjugeerd) toe aan drie aliquots van 0,1 ml van de celsuspensie. Vortex onmiddellijk en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  5. Herhaal de wasbeurten en centrifugatie in stap 7.3.
  6. Resuspendeer de pellet in 200 μL IC-fixatiebuffer en incubeer gedurende 20 minuten in het donker. Bereid ondertussen de permeabilisatiebuffer (1x) voor door 1 deel permeabilisatiebuffer (10x) te verdunnen met 9 delen gedestilleerd water. Was de cellen twee keer met 1 ml permeabilisatiebuffer (1x) door centrifugeren op 600 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Resuspendeer de pellet in 0,1 ml permeabilisatiebuffer (1x) met antilichamen tegen GM-CSF (PE-geconjugeerd, 1 μL/test), IFN-γ (BV711-geconjugeerd, 1 μL/test), IL-17A (BV421-geconjugeerd, 1 μL/test) en IL-22 (PerCP/Cyanine5.5-geconjugeerd, 5 μL/test) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  8. Herhaal de wasbeurten en centrifugatie in stap 7.6.
  9. Resuspendeer de celpellet in 200 μl PBS en breng de suspensie over in een reageerbuisje met ronde bodem. Laat de gekleurde cellen in een flowcytometer lopen.

8. Poortstrategie voor het identificeren van de Th-GM-subset

  1. Analyseer de flowcytometriegegevens (zie de materiaaltabel voor meer informatie over de gebruikte software) met behulp van de poortstrategie die wordt geïllustreerd in aanvullende figuur S1. Voor de software die hier wordt gebruikt, downloadt u deze en stelt u deze in op de computer.
  2. Importeer de flowcytometriegegevens door op Bestand |Openen | Importeer FCS-bestanden in de software en annoteer de groep en naam van elk voorbeeld door het tabblad Naam wijzigen te selecteren.
  3. Kies de lymfocyten op een FSC versus SSC-plot (FSC laag SSC laag, P1) om puin in de linkerbenedenhoek en myeloïde cellen met een grote omvang en hoge granulariteit uit te sluiten door op de dichtheidsgrafiek te klikken en de X-as van deze grafiek weer te geven als FSC-A en de Y-as als SSC-A.
  4. Dubbelklik op de gebeurtenissen in P1 om een andere dichtheidsgrafiek te genereren en scheid de afzonderlijke cellen (weergegeven als een gecorreleerde lijn, P2) van celaggregaten door de celhoogte en -oppervlakte in deze grafiek te selecteren (X-as als FSC-A versus Y-as als FSC-H).
  5. Dubbelklik op de gebeurtenissen in P2 om een andere dichtheidsgrafiek te genereren en geef de X-as van deze grafiek weer als FSC-A en Y-as als SSC-A. Gate de levensvatbare celpopulaties met behulp van FVS 780-events (P3).
  6. Dubbelklik op de gebeurtenissen in P3 om de volgende dichtheidsplot te genereren (de X-as als CD4-A en de Y-as als SSC-A) en onderscheid de CD4 T-cellen door de CD4+ -populatie (P4) te kiezen.
  7. Dubbelklik op de gebeurtenissen in P4 om een andere dichtheidsplot te genereren (de X-as als CD44-A en de Y-as als CD62L-A) en definieer de effector-T-helpercellen door de populatie rechtsboven van deze plot te kiezen (CD62L-CD44+, P5).

9. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit, waarbij twee groepen worden vergeleken met behulp van een ongepaarde t-toets. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 en **** P < 0,0001 (gemiddelde ± SD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNFB-geïnduceerde CHS (contactovergevoeligheid) bij muizen
Om CHS bij muizen te induceren, werden de muizen gesensibiliseerd en uitgedaagd met DNFB op de oorhuid, zoals geïllustreerd in figuur 1A. De oordikte, een indicator van epidermale spongiose, was duidelijk verhoogd bij muizen met DNFB-provocatie in vergelijking met met vehiculum behandelde muizen (Figuur 1B, 70 versus 3 μm op dag 1, 203 versus 7,5 μm o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een eenvoudige in vivo test om de generatie en uitbreiding van de Th-GM-celsubset te analyseren. Het is essentieel om een T-cel-gemedieerd ziektemodel te gebruiken bij muizen die worden geïnitieerd door haptenen of antigenen, en die activering bij de mens na te bootsen. DNFB is een hapteen met een klein molecuul dat zuiniger en tijdbesparender is dan peptide- of eiwitantigenen voor het opwekken van de T-cel-immuunrespons in vivo18,19...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81602763, 81803142, 82003347), het Excellent Researcher Program van de China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2017T100700) en het reguliere onderzoeksprogramma van de China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2016M592673). De auteurs willen Yan Wang en Meng-Li Zhu (Core Facilities of West China Hospital, Sichuan University) bedanken voor de technische ondersteuning van flowcytometrie in deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,4-dinitrofluorobenzeneBT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
AcetonCHRON CHEMICALS/67-64-1
anti-CD4-antilichaamBiolegend3005061:100 Verdund
anti-CD44-antilichaamBiolegend1030121:100 Verdund
anti-CD62L-antilichaamBiolegend1044171:100 Verdund
anti-GM-CSF-antilichaamBD Bioscience5545071:100 Verdund
anti-IFN-γ-antilichaamBiolegend5058361:100 Verdund
anti-IL-17A-antilichaamBD Bioscience5633541:100 Verdund
anti-IL-22-antilichaamBiolegend5164115 µL/test
CD45Biolegend1031011:200 Verdund
ChoralhydraatCHRON CHEMICALS/302-17-0
Meter voor dikte van diaal (type 0,01 mm)PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 Verdund
Fixable Viability Stain 780BD Bioscience5653881:1.000 Verdund, levensvatbaarheidskleurstof
FlowcytometerBD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7Software voor statistiek en grafieken
Set voor intracellulaire fixatie en permeabilisatieThermo Fisher88-8824-00vers vers bereid
IonomycineSigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 Verdund
NovoExpressAgilent/Software voor flowcytometrie-gegevensanalyse; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
OlijfoliënYUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
Remmer voor eiwittransport (met brefeldine A)BD Bioscience5550291 µL/mL

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasouli, J., et al. A distinct GM-CSF(+) T helper cell subset requires T-bet to adopt a TH1 phenotype and promote neuroinflammation. Science Immunology. 5 (52), (2020).
  2. Galli, E., et al. GM-CSF and CXCR4 define a T helper cell signature in multiple sclerosis. Nature Medicine. 25 (8), 1290-1300 (2019).
  3. Komuczki, J., et al. Fate-mapping of GM-CSF expression identifies a discrete subset of inflammation-driving T helper cells regulated by cytokines IL-23 and IL-1beta. Immunity. 50 (5), 1289-1304 (2019).
  4. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24 (12), 1387-1402 (2014).
  5. Herndler-Brandstetter, D., Flavell, R. A. Producing GM-CSF: a unique T helper subset. Cell Research. 24 (12), 1379-1380 (2014).
  6. Lu, Y., Fu, X. Y., Zhang, Y. In vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58087(2018).
  7. Hu, Y., et al. Interleukin-1beta-induced IRAK1 ubiquitination is required for TH-GM-CSF cell differentiation in T cell-mediated inflammation. Journal of Autoimmunity. 102, 50-64 (2019).
  8. Reynolds, G., et al. Synovial CD4+ T-cell-derived GM-CSF supports the differentiation of an inflammatory dendritic cell population in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (5), 899-907 (2016).
  9. Al-Mossawi, M. H., et al. Unique transcriptome signatures and GM-CSF expression in lymphocytes from patients with spondyloarthritis. Nature Communation. 8 (1), 1510(2017).
  10. Wicks, I. P., Roberts, A. W. Targeting GM-CSF in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 12 (1), 37-48 (2016).
  11. Scheinman, P. L., et al. Contact dermatitis. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 38(2021).
  12. Pesonen, M., Koskela, K., Aalto-Korte, K. Contact urticaria and protein contact dermatitis in the Finnish Register of Occupational Diseases in a period of 12 years. Contact Dermatitis. 83 (1), 1-7 (2020).
  13. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  14. Gaspari, A. A., Katz, S. I., Martin, S. F. Contact hypersensitivity. Current Protocols in Immunology. 113, 1-7 (2016).
  15. Manresa, M. C. Animal models of contact dermatitis: 2,4-dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity. Methods in Molecular Biology. 2223, 87-100 (2021).
  16. Kim, J. H., et al. CD1a on Langerhans cells controls inflammatory skin disease. Nature Immunology. 17 (10), 1159-1166 (2016).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Achuthan, A., et al. Cytokine-induced acute inflammatory monoarticular arthritis. Methods in Molecular Biology. 1784, 215-223 (2018).
  19. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  20. Kruisbeek, A. M., Shevach, E., Thornton, A. M. Proliferative assays for T cell function. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3 (2004).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Th GM cellenGM CSF producerende T cellenallergische contactdermatitiseffector CD4 T cellenflowcytometriedrainerende lymfeklierenT celimmuunrespons24 dinitrofluorbenzeen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen