Methodenartikel

Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie

DOI:

10.3791/63759

⸱

14 april 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een reproduceerbaar, geautomatiseerd en onbevooroordeeld beeldvormingssysteem voor het karakteriseren van de neuromusculaire junctiefunctie met behulp van menselijk gemanipuleerd skeletspierweefsel en optogenetische motoneuronen. Dit systeem maakt de functionele kwantificering van neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd mogelijk en detecteert verminderde neuromusculaire functie veroorzaakt door neurotoxinen en myasthenia gravis patiëntenserum.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel neuromusculaire ziekten, zoals myasthenia gravis (MG), zijn geassocieerd met disfunctie van de neuromusculaire overgang (NMJ), die moeilijk te karakteriseren is in diermodellen vanwege fysiologische verschillen tussen dieren en mensen. Tissue engineering biedt mogelijkheden om in vitro modellen van functionele menselijke NMJ's te bieden die kunnen worden gebruikt om NMJ-pathologieën te diagnosticeren en te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. Door optogenetische eiwitten op te nemen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), genereerden we neuronen die kunnen worden gestimuleerd met specifieke golflengten van licht. Als de NMJ gezond en functioneel is, resulteert een neurochemisch signaal van het motoneuron in spiercontractie. Door de integratie van optogenetica en microfabricage met tissue engineering, hebben we een onbevooroordeelde en geautomatiseerde methodologie vastgesteld voor het karakteriseren van NMJ-functie met behulp van video-analyse. Een gestandaardiseerd protocol werd ontwikkeld voor NMJ-vorming, optische stimulatie met gelijktijdige video-opname en video-analyse van weefselcontractiliteit. Stimulatie van optogenetische motoneuronen door licht om skeletspiercontracties te induceren, recapituuleert de menselijke NMJ-fysiologie en maakt herhaalde functionele metingen van NMJ in de loop van de tijd en in reactie op verschillende inputs mogelijk. We demonstreren het vermogen van dit platform om functionele verbeteringen in neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd te laten zien en de schadelijke effecten van MG-antilichamen of neurotoxinen van patiënten op de NMJ-functie te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De neuromusculaire junctie (NMJ) is de chemische synaps tussen motoneuronen (MN's) en skeletspiercellen (SkM) die spiercontractie mogelijk maakt. Toxines, zoals neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), of neuromusculaire ziekten (NMD) zoals myasthenia gravis (MG) kunnen leiden tot degeneratie van de NMJ en vermindering van spiercontrole1. Bio-technische menselijke weefselmodellen kunnen de functionele en fysiologische mechanismen van menselijke NMJ's beter samenvatten en een groter translationeel potentieel bieden dan diermodellen.

Hoewel diermodellen het begrip van de vorming en functie van de NMJ hebben verbeterd, zijn er significante verschillen tussen menselijke en dierlijke synapsen die de vertaling van resultaten naar mensen beperken en in vivo karakterisering van de NMJ uitdagend maken 2,3,4. Studies hebben duidelijke fysiologische verschillen aangetoond tussen muis en menselijke NMJ's. Muizen hebben grotere NMJ's en kleinere actieve zonedichtheden in vergelijking met menselijke NMJ's4. Bovendien weerspiegelen geneesmiddelenstudies die in diermodellen worden uitgevoerd niet altijd de effecten die zijn gevonden in klinische onderzoeken bij mensen. Gemanipuleerde menselijke weefselmodellen bieden de mogelijkheid om de gezonde ontwikkeling van de NMJ en de pathologie van neuromusculaire ziekten te bestuderen en geneesmiddelenscreenings mogelijk te maken. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)5 kunnen worden gedifferentieerd in een verscheidenheid aan celtypen, waaronder skeletspiercellen 6,7 en motoneuronen 8,9. hiPSC's kunnen eenvoudig worden gegenereerd uit patiëntcellen, waardoor een betere ziektemodellering10 en medicijnscreening 11,12 mogelijk is via patiëntspecifieke weefselmodellen.

Tweedimensionale (2D) monolaag co-culturen van SkMs en MN's missen de morfologie, fenotype, organisatie en functioneel gedrag van fysiologische NMJ's. NMJ's vormen zich willekeurig in 2D-cultuur, wat de isolatie van motoreenheden voor analyse remt, nauwkeurige functionele metingen beperkt en voorkomt dat ze worden gebruikt voor herhaalde, systematische experimenten13 . Driedimensionale (3D) weefselmodellen van NMJ's overwinnen veel van deze beperkingen en herformuleren de morfologische en functionele kenmerken van fysiologische NMJ's 7,14,15,16,17. Met behulp van dit model worden de twee weefseltypen afzonderlijk ontwikkeld en vervolgens geïntegreerd door axonale groei te sturen, waardoor meer georganiseerde NMJ's zich kunnen ontwikkelen in vergelijking met 2D-kweeksystemen.

Onze eerdere studie toonde aan dat het combineren van optogenetica met tissue engineering kan zorgen voor nauwkeurige niet-invasieve stimulatie en evaluatie van NMJ-functie18,19. Door middel van genetische manipulatie kunnen lichtgevoelige eiwitten worden geïntegreerd in het genoom van hiPSC's. Het integreren van channelrhodopsine-2 (ChR2), een ionkanaal dat zich opent als reactie op blauw licht, in het membraan van prikkelbare cellen zoals neuronen zorgt voor contactloze spatiotemporale controle over celactivering 20,21,22. hiPSC's die ChR2 dragen, kunnen worden gedifferentieerd in optogenetische motoneuronen die gevoelig zijn voor blauw licht, waardoor de noodzaak voor typische invasieve elektroden die neuronen stimuleren wordt weggenomen en ongewenste stimulatie van de spiercellen door elektroden wordt vermeden23. Dit systeem maakt gebruik van optogenetische motoneuronen om contracties in niet-optogenetische skeletspiercellen te stimuleren. Door video-acquisitie en gecontroleerde blauwlichtverlichting te combineren, kunnen de co-gekweekte weefsels tegelijkertijd worden gestimuleerd en opgenomen voor nmj-functie.

MG wordt veroorzaakt door auto-antilichamen gericht op nicotine-acetylcholinereceptoren (AChR), wat resulteert in een verminderde NMJ-functie en spierzwakte24. Het wordt gediagnosticeerd op basis van gepresenteerde symptomen, elektrodiagnose en detectie van auto-antilichamen via serologische bloedtesten. Echter, niet alle auto-antilichamen betrokken bij MG zijn geïdentificeerd, en sommige seronegatieve patiënten worden gediagnosticeerd met MG, maar met geen erkende antilichamen25,26. Ons systeem maakt herhaalde functionele beoordeling van de NMJ mogelijk voor en na de toevoeging van serum van MG-patiënten, waardoor waardevol inzicht wordt verkregen in de functionele en biochemische veranderingen veroorzaakt door de MG-antilichamen18. Ons protocol illustreert hoe 3D in vitro modellen van functionele menselijke NMJ kunnen worden geproduceerd die kunnen worden gebruikt om NMJ-pathologieën te diagnosticeren en te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. We demonstreren de veelzijdigheid van het systeem in twee platforms, een microfluïdisch apparaat en een groter open-well bioreactorplatform.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle cellijnen voor dit werk zijn gemaakt en gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van Columbia University, NY, VS.

1. Bioreactorvoorbereiding

  1. Bioreactormallen maken
    1. Download een BIOREACTOR CAD-bestand uit het aanvullende CAD-bestand of maak een aangepast eigen ontwerp.
    2. Genereer een CNC-gereedschapspad vanuit het 3D-model met behulp van CAM-software.
    3. Machine acetaal mallen met behulp van een CNC-freesmachine.
  2. Fabricage van bioreactoren
    1. Meng een 10:1 basis tot uithardingsmiddelmengsel van polydimethylsiloxaan (PDMS, 77 g mengsel per 4 platforms/mallen).
    2. Plaats het mengsel in een vacuümkamer, sluit alle kleppen, zet het vacuüm aan en ontgas het mengsel gedurende ten minste 30 minuten totdat er geen luchtbellen achterblijven. Giet het mengsel in mallen en ontgas de mallen in de vacuümkamer gedurende 1 uur.
    3. Sluit de mallen met de bovenste helft van de mal in de juiste richting. Plaats een stalen zeshoekige staaf over het midden en klem aan beide zijden.
    4. Vul de bovenkant opnieuw met PDMS.
    5. Hard de mallen minstens 4 uur uit in een oven van 65 °C.
    6. Verwijder de platforms van de mallen na afkoeling tot kamertemperatuur.
    7. Reinig de apparaten in een ultrasoon bad met behulp van 1 uur cycli afwasmiddel, 400 ml 100% isopropanol en gedestilleerd water.
    8. Laat een nacht drogen bij 65 °C.
    9. Week glazen coverslips gedurende 30 minuten in 1% niet-ionogene oppervlakteactieve polyol en zorg ervoor dat de coverslips niet stapelen zodat ze allemaal goed gecoat zijn.
    10. Spoel goed af met gedestilleerd water en droog een nacht bij 65 °C.
    11. Gebruik een plasmareiniger op hoog met 6 L/min zuurstof gedurende 1-2 minuten om de glazen afdekplaten en het PDMS-platform te behandelen. Na de behandeling verlijmt u de twee met elkaar door het PDMS minstens 30 s op de coverslip te drukken.
    12. Autoclaaf de gebonden apparaten voordat u cellen toevoegt.

2. Het bouwen van een optische stimulatie setup

  1. Bevestig met behulp van een 30 mm kooikubussysteem een 573 nm dichroïsche spiegel in het midden. Koppel een rode 627 nm LED aan een 594 nm long-pass excitatiefilter en bevestig deze aan de bovenzijde van de kubus, met de LED naar de spiegel gericht. Bevestig vervolgens een blauwe 488 nm LED met een 546 nm short-pass excitatiefilter aan de aangrenzende kant van de kubus, met de LED naar de spiegel gericht zoals weergegeven in het schema in figuur 3A.
  2. Bevestig een ringbediend irismembraan aan de onderkant van de kooikubus om de grootte van het verlichte gebied te regelen.
  3. Voed elke LED door een T-Cube LED-driver en bestuur via een Arduino Uno Rev3-bord. Sluit de zijingang van de LED-driver aan op een stekker van de voedingsbron, sluit de middelste uitgang aan op de Arduino en sluit de zijuitgang rechtstreeks aan op de LED's.
  4. Sluit de Arduino Uno aan op een pc via een USB-kabel.
  5. Download bestanden van github link (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. Open het bestand "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" vanuit de map GitHub.
  7. Startparameters instellen: Stappen = 30; startFrequentie = 0,5; endFrequency = 3; pulseLengte = 100.
  8. Zorg ervoor dat pinuitgang 4 is toegewezen aan het blauwe LED-stuurprogramma en pinuitgang 2 is toegewezen aan het rode LED-stuurprogramma. Controleer of de middelste draden van de LED-driver zijn aangesloten op de massa en op de respectieve pinuitgang.
  9. Compileer en laad het programma "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" naar Arduino.
  10. Sluit elke LED-driver aan op het bijbehorende kanaal.

3. Celkweekopstelling (dag -21-0)

  1. Primaire skeletspiercellen
    1. Ontdooi en breid primaire skeletmyoblasten (verkregen uit Cook Myosiet) uit voor maximaal zes passages met behulp van Myotone groeimedium (+ supplement). Houd cellen in een incubator op 37 °C en 5% CO2.
    2. Verander de media elke 2 dagen.
    3. Zodra cellen ongeveer 60% confluent zijn, passeer ze dan met 0,05% Trypsine-EDTA (1x, gedurende 5 minuten bij 37 °C). Verzamel de gedissocieerde cellen en voeg verse media toe om het trypsine te neutraliseren.
    4. Draai de cellen op 300 x g en aspirateer het supernatant boven de celpellet.
    5. Resuspendeer de cellen met MGM en zaai 1:3 met 60 ml per drielaagse kolf.
  2. ChR2-hiPSC
    OPMERKING: Alle cellijnen voor dit werk zijn gemaakt en gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van Columbia University, NY, VS. In dit protocol werden ChR2-expresserende hiPSC's gegenereerd via CRISPR-Cas9-genoombewerking met behulp van eerder beschreven methoden18, maar stabiele optogenetische cellijnen (lentiviral, piggyBac, enz.) kunnen op dezelfde manier worden gebruikt. Constitutieve promotors uitgedrukt in zowel iPSC's als motoneurons werden gekozen (CAG). De cellen bleken een gezond karyotype te hebben, zoals opgemerkt in eerdere publicaties 18,19.
    1. Bekleed 6-well platen met 1 ml / put opgeloste keldermembraanmatrix verdund in DMEM / F12 (1: 80) en incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. Zaai iPSC's op gecoate 6-wells platen met 2 ml feedervrij celkweekmedium (iPSC-media), wissel om de dag 2 ml media uit en passag om de 5-7 dagen. Houd cellen in een incubator op 37°C en 5% CO2.
    3. Passaging
      1. Dissociëren van de stamcellen door te incuberen met 1 ml enzymvrije stamcel die reagens vrijgeeft gedurende 4 minuten en mechanisch af te scheren met een P1000-pipet met brede punt.
      2. Zaadcellen in een verhouding van 1:24 of 1:48 in iPSC-media met 2 μM Y-27632 dihydrochloride in 2 ml/put op gecoate 6-well platen.

4. Skeletspierweefsel zaaien (dag -3)

  1. Isoleer en tel 30 x 106 myoblasten met behulp van een geautomatiseerde celteller.
  2. Resuspendeer de myoblasten in een 4:1 mix van 3 mg/ml collageen I en opgeloste keldermembraanmatrix (800 μL collageenmengsel + 200 μL keldermembraanmatrix om een eindvolume van 1 ml te bereiken). Voeg voor de collageencomponent het bijbehorende neutraliserende middel toe (9:1 mengsel van collageen tot neutralisatiemiddel) en verdun het mengsel met 1x PBS om een volume van 800 μL te bereiken.
  3. Voeg 15 μL celcollageensuspensie toe aan elke spierkamer van de bioreactor en zorg ervoor dat de suspensie over beide pijlers wordt verspreid met behulp van de pipetpunt (figuur 2).
  4. Laat het cel-gelmengsel gedurende 30 minuten polymeriseren bij 37 °C en vul vervolgens elke bioreactor goed met 450 μL myotone groeimedia.
  5. Na 3 dagen (zodra de gel is samengeperst), begint u met myotube-differentiatie.

5. Myotube differentiatie (dag 0-14)

  1. Begin met myotube-infusie door weefsels gedurende 7 dagen over te schakelen op 450 μL fusie-inducerende media (FS, tabel 1), waarbij de media om de andere dag worden vervangen.
    OPMERKING: Probeer myotube-differentiatie te beginnen op dezelfde dag als motoneurondifferentiatie van hiPSC's om motoneuronen te zaaien aan het einde van de differentiatieschema's van beide celtypen.
  2. Verander op dag 7 de media in 450 μL rijpingsmedia Ia (MMIa, tabel 1).
  3. Op dag 9, verandering naar 450 μL rijpingsmedium Ib (MMIb, tabel 1).
  4. Verander op dag 11 de media in 450 μL NbActiv4. Blijf de media om de 2 dagen veranderen totdat de motoneurons zijn gezaaid (stap 7).

6. Motoneuron differentiatie (dag 0-14)

OPMERKING: Ons motoneuron differentiatieprotocol is aangepast van Maury et al8.

  1. Breng op dag 0 4 x 106 ChR2- hiPSC's over naar een petrischaal met ultralage bevestiging met 15 ml motoneuron-ophangingscultuurmedium (MSCM, tabel 1). Vul MSCM aan met 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542hydraat en 5 μM Y-27632 dihydrochloride.
  2. Isoleer op dag 2 de neurosferen (NS) met een omkeerbare zeef van 37 μM en replate in 15 ml MSCM met 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542-hydraat en 0,1 μM retinoïnezuur. NS moet na dag 2 zonder gebruik van een microscoop zichtbaar zijn in de petrischaal.
  3. Breng op dag 4 de cellen en media over naar een buis van 50 ml en laat de neurosferen naar de bodem zakken (5 min). Adem het supernatant op en resuspensieer de cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 en 0,1 μM retinoïnezuur.
  4. Herhaal op dag 7 stap 6.3. maar resuspensie van de cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 0,5 μM SAG en 0,1μM retinoïnezuur.
  5. Herhaal op dag 9 stap 6.3. maar resuspend cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 10 μM DAPT.
  6. Herhaal op dag 11 stap 6.3. maar resuspend de cellen in 15 ml MSCM aangevuld met 20 ng / ml BDNF en 10 ng / ml GDNF.
  7. Op dag 14 zaai je de motoneuronen in het platform.

7. Zaaien van motoneuronen aggregaten in bioreactor (dag 14)

  1. Bereid een 4:1 gelmengsel van 2 mg/ml collageen I en Matrigel (800 μL collageenmengsel + 200 μL Matrigel om een eindvolume van 1 ml te bereiken). Voeg voor de collageencomponent het bijbehorende neutraliserende middel toe (9:1 mengsel van collageen tot neutraliserend middel) en verdun het mengsel met 1x PBS om een eindvolume van 800 μL te bereiken.
  2. Gebruik een celzeef van 400 nm om grote neurosferen te selecteren en deze in het gelmengsel te resuspeneren.
  3. Aspirate media uit het reservoir en voorzichtig uit de neurosfeerput (figuur 2).
  4. Voeg 15 μL gelmengsel toe aan het neurosfeerkanaal.
  5. Laad een pipet van 10 μL met 10 μL gel en kies vervolgens één neurosfeer.
  6. Deponeer de NS in het neurosfeerkanaal en zorg ervoor dat de NS in de kamer zit. Til de pipet langzaam op terwijl u de resterende gel loslaat zodra de NS is afgezet. Als u niet zeker weet of de NS correct is gedeponeerd, controleert u de locatie met behulp van een microscoop.
  7. Laat de gel 30 min polymeriseren bij 37 °C.
  8. Voeg 450 μL NbActiv4 aangevuld met 20 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF toe aan de reservoirs.
  9. Verander de media om de dag om axonale groei van NS naar spierweefsel mogelijk te maken.

8. Gelijktijdige optische stimulatie en video-opname van nmj-functie (dag 24+)

  1. Gebruik voor beeldvorming een omgekeerde fluorescerende microscoop met een wetenschappelijke complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera (sCMOS).
  2. Stel de camerasoftware binning in op 2x2, belichting op 20 ms, rolling shutter AAN, uitleessnelheid op 540 MHz, dynamisch bereik: 12-bit &gain 1 en sensormodus: overlap.
  3. Gebruik 2x objectief op de microscoop om de microtissues in beeld te brengen.
  4. Bevestig een levende celkamer (37 °C, 5% CO2) aan het microscoopstadium.
  5. Selecteer het interessante gebied (ROI) dat het generveerde weefsel van skeletweefsels bevat om de bestandsgrootte en verwerkingstijd te minimaliseren.
  6. Plaats een 594 nm langdoorlaatemissiefilter tussen het monster en het beeldobjectief om blauwe lichtpulsen uit de camera te filteren.
  7. Plaats een rechthoekige 4-wells plaat met 4 bioreactoren (24 weefsels) in de levende celkamer.
  8. Klik op Liveweergave. Centreer en focus de afbeelding met de gewenste ROI.
  9. Upload de aangepaste macrocode vanuit de GitHub-map (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) om de podiumpositie, het Arduino-bord en video-acquisitie te regelen.
  10. Stel uitvoerfilm in als: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Voer de macrocode uit met de gewenste X,Y-coördinaten die in het werkgebied zijn ingesteld en verkrijg een snelle time-lapse met 1700 frames bij 50 frames/s.
  12. Vervang de media na beeldvorming en breng de monsters terug naar de incubator. Laat ten minste 24 uur tussen beeldacquisitiesessies om weefselvermoeidheid te voorkomen.

9. Batchverwerking en -analyse (dag 24+)

  1. Filmverwerking
    1. Gebruik de aangepaste MATLAB-code om de video's in batchanalyse te verwerken. De bestanden kunnen worden gedownload van de GitHub-map (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). De functies worden opgesomd en uitgelegd in tabel 2.
      OPMERKING: De code is compatibel met .nd2- en .czi-indelingen. Het vereist parallelle verwerking om te worden geactiveerd in MATLAB en heeft het bioformats-pakket nodig.
    2. Voer het recursiveOSAnalysis-script uit om de films te analyseren via parallelle verwerking. Plaats alle verkregen video's in dezelfde map en selecteer die map wanneer u de code uitvoert.
    3. Pas de parameters na de analyse indien nodig aan.
      1. Baseline wijzigenTijd (optie 1) als spontane contractie wordt opgepikt aan het begin van de opname. Dit toont een eerste meting ver boven 0 en vereist dat het frame wordt verschoven om te compenseren.
      2. Wijzig piekDonderhold (optie 2) als de weeën niet worden geregistreerd. De code detecteert standaard contracties die hoger zijn dan 25% van de hoogste piek, zodat deze waarde kan worden gewijzigd.
      3. Wijzig minMinProminence en minMinWidth om de gevoeligheid aan te passen bij het detecteren van het begin van elke piek.
    4. Genereer video- en grafiekuitvoer.
      1. Voer recursiveOSMovie uit om een videobestand te genereren voor elk weefsel met de respectieve contractiliteitstracering.

10. Verstoring van nmj-functie (dag 24+)

  1. Bereid behandelingsmedia voor door externe effector toe te voegen aan NbActiv4 basale media aangevuld met 20 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF.
    1. Gebruik voor het MG sera experiment 20% MG patiënt sera in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. Gebruik voor het BTX-experiment 5 μg/ml BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. Stimuleer/afbeelding met stap 3.2. om de basislijn vast te leggen.
  3. Vervang de media in weefsels door behandelingsmedia (450 μL/weefsel).
  4. Incubeer gedurende de gewenste tijd (48 uur voor sera van de patiënt, 20 minuten voor BTX).
  5. Stimuleer/afbeelding opnieuw met stap 3.2. om de functie na de behandeling vast te leggen.
  6. Verwijder de behandelingsmedia en laat de weefsels de gewenste tijd rusten (48 uur na verwijdering van sera)
    OPMERKING: Laat ten minste 24 uur tussen stimulatie en beeldvorming om weefselvermoeidheid te voorkomen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuromusculaire juncties werden gegenereerd door het co-kweken van optogenetische hiPSC-afgeleide motoneuronen met niet-optogenetisch skeletspierweefsel. Menselijke primaire skeletmyoblasten (SkM) werden in de platforms gezaaid en gedifferentieerd in multinucleaire myotubes met behulp van het 2-wekenprotocol. De optogenetische motoneuronen werden afzonderlijk gedifferentieerd, maar parallel aan de myotube-differentiatie, en vervolgens in het platform gezaaid (figuur 1). De weefsels begonnen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit systeem is een gemanipuleerd 3D-menselijk weefselmodel dat optogenetica en videoverwerking combineert om geautomatiseerde en onbevooroordeelde evaluatie van nmj-functie mogelijk te maken. Met behulp van een gestandaardiseerd protocol hebben we het vermogen aangetoond om veranderingen in de NMJ-functie tijdens fysiologische ontwikkeling te meten en de schadelijke effecten van pathologieën zoals blootstelling aan neurotoxine en sera van myasthenia gravis-patiënten te karakteriseren.

Eerdere ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen dankbaar de financiële steun van de NIH [subsidienummers EB025765 en EB027062], DOD [awardnummer W81XWH-18-1-0095] en de UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). We bedanken de Columbia University Stem Cell Core voor hun hulp en begeleiding bij het herprogrammeren van cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Bovine Serum Albumin solutionMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulin, Recombinant HumanMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic Growth Media KitCook MyositeMK-4444
N-2 SupplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm cage cube systemThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, largeStem Cell Technologies27250
546 nm short-pass excitation filterSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirrorSemrockFF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filterSemrockBLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filterSemrockBLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated LegsLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
Heat sinkLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
ring-actuated iris diaphragmThorLabsSM1D12D
T-Cube LED driversThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"McMaster91920A046
Low-Profile C-ClampMcMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human ProteinThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin mouse protein, naturalThermoFisher Scientific23017015
Recombinant Human Agrin ProteinR&D Systems6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ugR&D Systems212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-TerminusR&D Systems1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoic Acid, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Smoothened AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectin from human plasmaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)DSHBMF20
Equipment

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326(2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126(2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885(2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27(2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133(2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033(2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetic Neuromuscular JunctionHuman NMJ ModelTissue EngineeringInduced Pluripotent Stem CellsOptogenetic StimulationMuscle Contraction AnalysisMicrofabrication TechniquesVideo Contractility AnalysisMyasthenia Gravis ModelMotor Neuron Differentiation

Gerelateerde artikelen