Methodenartikel

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

DOI:

10.3791/63761

⸱

10 mei 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis B-virus (HBV) infectie is beschouwd als een cruciale risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De huidige behandeling kan alleen de virale lading verminderen, maar niet resulteren in volledige remissie. Een efficiënt hepatocytenmodel voor HBV-infectie zou een levensechte virale levenscyclus bieden die cruciaal zou zijn voor de screening van therapeutische middelen. De meeste beschikbare anti-HBV-middelen richten zich op levenscyclusstadia na virale binnenkomst, maar niet vóór virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft de generatie van een competent hepatocytenmodel dat in staat is om te screenen op therapeutische middelen gericht op pre-virale entry en post viral entry lifecycle stadia. Dit omvat de targeting van natrium taurocholaat cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage op basis van imHC of HepaRG als gastheercellen. Hier gebruikte de HBV-entry-inhibitietest curcumine om HBV-bindings- en transportfuncties via NTCP te remmen. De remmers werden geëvalueerd op bindingsaffiniteit (KD) met NTCP met behulp van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) - een universeel hulpmiddel voor HBV-geneesmiddelenscreening op basis van thermodynamische parameters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatitis B-virus (HBV) infectie wordt wereldwijd beschouwd als een levensbedreigende ziekte. Chronische HBV-infectie is beladen met een risico op levercirrose en hepatocellulair carcinoom1. De huidige anti-HBV-behandeling richt zich vooral op post-virale entry met behulp van nucleos(t)ide analogen (NAs) en interferon-alfa (IFN-α)2,3. De ontdekking van een HBV-entryremmer, Myrcludex B, heeft een nieuw doelwit voor anti-HBV-middelen geïdentificeerd4. De combinatie van entryremmers en NA's bij chronische HBV heeft de virale lading aanzienlijk verminderd in vergelijking met die gericht op virale replicatie alleen 5,6. Het klassieke hepatocytenmodel voor de screening van HBV-entryremmers wordt echter beperkt door lage virale receptorniveaus (natrium taurocholaat cotransporting polypeptide, NTCP). De overexpressie van hNTCP in hepatoomcellen (d.w.z. HepG2 en Huh7) verbetert de HBV-infectiviteit 7,8. Niettemin drukken deze cellijnen lage niveaus van fase I- en II-enzymen uit die geneesmiddelen metaboliseren en vertonen ze genetische instabiliteit9. Hepatocytenmodellen die kunnen helpen bij het richten op verschillende mechanismen van kandidaat-anti-HBV-verbindingen zoals previrale invoer, NTCP-binding en virale entry, zouden de identificatie en ontwikkeling van effectieve combinatieregimes versnellen. De studie voor anti-HBV-activiteit van curcumine heeft de remming van virale entry opgehelderd als een nieuw mechanisme naast onderbreking van de post-virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft een gastheermodel voor de screening van anti-HBV-ingangsmoleculen10.

Het doel van deze methode is om kandidaat-anti-HBV-verbindingen te onderzoeken voor virale entry-remming, met name het blokkeren van NTCP-binding en transport. Omdat NTCP-expressie een kritieke factor is voor HBV-invoer en -infectie, hebben we het hepatocytenrijpingsprotocol geoptimaliseerd om NTCP-niveaus11 te maximaliseren. Bovendien kan dit protocol het remmende effect op HBV-entry differentiëren als remming van HBV-aanhechting versus remming van internalisatie. De taurocholzuur (TCA) opnametest werd ook aangepast met behulp van een ELISA-gebaseerde methode in plaats van een radio-isotoop om NTCP-transport12,13 weer te geven. De receptor- en ligandinteractie werd bevestigd door hun 3D-structuren14,15. De remming van de NTCP-functie kan worden geëvalueerd door TCA-opnameactiviteit16 te meten. Deze techniek leverde echter geen direct bewijs van NTCP-binding aan de kandidaat-remmers. Daarom kan de binding worden onderzocht met behulp van verschillende technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie17, ELISA, fluorescentie-gebaseerde thermische verschuivingstest (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen en verschillende andere methoden20. Onder deze technieken is ITC een doelstandaard in bindingsanalyse omdat het warmteabsorptie of -emissie in bijna elke reactie kan observeren21. De bindingsaffiniteit (KD) van NTCP en kandidaat-verbindingen werd direct geëvalueerd met behulp van ITC; deze affiniteitswaarden waren nauwkeuriger dan die verkregen met behulp van het in silico voorspellingsmodel22.

Dit protocol heeft betrekking op technieken in hepatocytenrijping, HBV-infectie en screening op HBV-entryremmer. In het kort werd een hepatocytenmodel ontwikkeld op basis van imHC- en HepaRG-cellijnen. De gekweekte cellen werden binnen 2 weken gedifferentieerd tot volwassen hepatocyten. De upregulatie van NTCP-niveaus werd gedetecteerd met behulp van real-time PCR, western blot en flowcytometrie11. Hepatitis B-virion (HBVcc) werd geproduceerd en verzameld uit HepG2.2.15. De gedifferentieerde imHC of HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) werd profylactisch behandeld met de anti-HBV-kandidaten 2 uur voorafgaand aan de inenting met HBV-virion. De verwachte uitkomst van het experiment was de identificatie van de middelen die cellulaire HBV en infectiviteit verminderen. Anti-NTCP-activiteit werd geëvalueerd met behulp van de TCA-opnametest. NTCP-activiteit kan worden onderdrukt door de agenten die specifiek NTCP hebben gebonden. De ITC-techniek werd gebruikt om de haalbaarheid te onderzoeken van interactieve binding die remmers en hun doeleiwitten kon voorspellen, waarbij de bindingsaffiniteit (KD) van het ligand voor de receptor werd bepaald via niet-covalente interacties van het biomoleculaire complex23,24. KD ≥ 1 × 103 mM staat bijvoorbeeld voor een zwakke binding, KD ≥ 1 × 106 μM voor matige binding en KD ≤ 1 × 109 nM voor een sterke binding. De ΔG is direct gecorreleerd met bindingsinteracties. In het bijzonder is een reactie met negatieve ΔG een exergonische reactie, wat aangeeft dat binding een spontaan proces is. Een reactie met een negatieve ΔH geeft aan dat de bindingsprocessen afhankelijk zijn van waterstofbinding en Van der Waalskrachten. Zowel TCA-opname- als ITC-gegevens kunnen worden gebruikt om te screenen op anti-HBV-entry agents. De uitkomsten van deze protocollen kunnen een basis vormen voor niet alleen anti-HBV-screening, maar ook voor de interactie met NTCP zoals beoordeeld door bindingsaffiniteit en transportfunctie. Dit artikel beschrijft de voorbereiding en karakterisering van gastheercellen, experimenteel ontwerp en evaluatie van de anti-HBV-ingang samen met de NTCP-bindingsaffiniteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II biologische gevarenstroomkap of een laminaire stromingskap. De behandeling van HBV is ethisch goedgekeurd door de IRB (MURA2020/1545). Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle oplossingen, reagentia, apparatuur en cellijnen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Het voorbereiden van gastheercellen (volwassen hepatocyten)

  1. Kweekhepatocyten (3,75 × 105 cellen HepaRG of imHC) en onderhouden in een 75 cm2 kweekkolf met 10 ml DMEM/F12 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. Wacht tot de cellen 80% -90% samenvloeiing bereiken (binnen 1 week).
  2. Gooi het oude medium uit de kolf en was de cellen met 4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Aspirateer de PBS en voeg 4 ml 0,05% trypsine-EDTA toe.
  4. Incubeer de kolf in de incubator van 37 °C gedurende 2-3 minuten en controleer de aanhangende cellen met een omgekeerde microscoop met een 10x objectieflens. Zorg ervoor dat de monolaag is losgemaakt van het kweekoppervlak.
  5. Rem het trypsine door 4 ml van het kweekmedium aangevuld met 10% FBS aan de kolf toe te voegen en de geoogste cellen zorgvuldig te resuspeneren. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 × g, 25 °C.
  6. Aspirateer het supernatant uit de celpellet en resuspenseer met 1-2 ml van het voorgewarmde kweekmedium aangevuld met 10% FBS en antibiotica.
  7. Meng 10 μL elk van de celsuspensie en trypan blue en tel de cellen met behulp van een hemacytometer. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel hoger is dan 90% voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  8. Zaad 1 × 106 cellen per 2 ml in elke put van een 6-well plaat en handhaven in DME / F12 volledig medium totdat de cellen 100% samenvloeiing bereiken.
  9. Bereid voor leverrijping hepatisch rijpingsmedium (Williams' E-medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 5 μg/ml insuline, 50 μM hydrocortison, 2 mM L-glutamine en 2% DMSO).
  10. Vervang het kweekmedium 2x per week.
  11. Houd de hepatocyten gedurende 2 weken in rijpingsmedium om rijpe hepatocyten te verkrijgen die klaar zijn voor HBV-infectie.

2. Kwantificering van cellulaire NTCP

  1. NTCP-expressie meten met behulp van real-time PCR
    1. Verzamel de pellet van volwassen hepatocyten door trypsinisatie (zie stappen 1.2-1.5).
    2. Extraheer totaal RNA uit de celpellet met behulp van een RNA-extractiekit met DNase I-behandeling.
    3. Synthetiseer cDNA uit 200 ng totaal RNA met behulp van een oligo-dT primer en reverse-transcriptiesysteem volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Verdun het cDNA tot 50 ng/μL en gebruik het als sjabloon voor de PCR-reactie. Meng 2 μL van het verdunde cDNA met de PCR master mix reagentia die SYBR groene qRT-PCR Kit oplossing bevatten met 5 μM NTCP-specifieke primers (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' en 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Gebruik voor normalisatie GAPDH als huishoudgen met specifieke primers (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' en 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCTC-3').
    6. Versterk de cDNA-monsters met behulp van een thermische cycler onder de volgende temperatuuromstandigheden: 1 cyclus van 3 minuten bij 95 °C (initiële denaturatie); 40 cycli van 30 s bij 95 °C (denaturatie), 30 s bij 60 °C tot 65 °C (gloeien), 30 s bij 72 °C (extensie); 1 cyclus van 5 min bij 72 °C (laatste verlenging).
    7. Bereken de NTCP-vouwverandering in volwassen hepatocyten over ongedifferentieerde cellen met behulp van GAPDH als kalibratorgen op basis van de 2-ΔΔCT-methode .
  2. NTCP kwantificeren met behulp van western blot-analyse
    1. Oogst hepatocyten met behulp van een celschraper en centrifugeer ze bij 300 x g, 25 °C gedurende 5 minuten om de celpellet te verzamelen.
    2. Volg de instructies van de RIPA-bufferfabrikant om het cellulaire eiwit te extraheren met 100 μL RIPA-buffer met 1x proteaseremmer.
    3. Meet de totale eiwitconcentratie met behulp van de bicinchonininezuur (BCA) methode.
    4. Meng 12,5 μL eiwit met 2x ladende kleurstof in een volumeverhouding van 1:1.
    5. Kook het eiwitmengsel en de standaardladder gedurende 5 min op 95 °C.
    6. Voeg 1x loopbuffer toe aan de elektroforesekamer.
    7. Laad 5 μL van de eiwitstandaardladder of 20 μL van het gekookte eiwitmengsel in een polyacrylamidegel van 10% (w/v).
    8. Voer gel-elektroforese uit: 50 V gedurende 30 minuten gevolgd door 90 V gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    9. Bereid een PVDF-membraan voor door het gedurende 30 s in methanol te weken, was het met dubbel gedestilleerd water gedurende 1-2 minuten en week het samen met twee stukken filterpapier in transferbuffer gedurende 10 minuten of tot gebruik.
    10. Plaats het filtreerpapier op de anodeplaat van een halfdroge overdrachtscel; plaats vervolgens het PVDF-membraan, de gel en het filterpapier erop, in die volgorde.
    11. Breng de eiwitten van de gel over naar het PVDF-membraan bij 10 V gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
    12. Blokkeer het membraan met WB-blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    13. Incubeer het membraan met anti-natrium taurocholaat cotransporting polypeptide (anti-NTCP) (1:100 verdunning) bij 4 °C 's nachts.
    14. Was het membraan 3 x 10 min met TBST.
    15. Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd geitenantikonijnantilichaam (1:10.000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    16. Was het membraan 3 x 10 min met TBST en vervolgens 1 x 5 min met TBS.
    17. Detecteer NTCP met behulp van een HRP-substraat (zie de tabel met materialen).
    18. Voeg ten minste 0,1 ml HRP-substraatoplossing/cm2 van het membraan toe en incubeer het membraan gedurende 3-5 minuten in het donker.
    19. Visualiseer NTCP met behulp van een Gel Documentation System in de chemiluminescentiemodus, selecteer de markeroptie voor het membraan, pas de belichtingstijd elke 1 min aan met de accumulatieve modus en maak de foto met verschillende belichtingstijden gedurende 5 minuten.
    20. Strip en sondeer de vlek met muis anti-GAPDH antilichaam (1:200.000 verdunning) en HRP-geconjugeerde geiten anti-muis secundair antilichaam (1:10.000 verdunning).
  3. Het NTCP-niveau meten met behulp van flowcytometrie
    1. Verzamel de celpellets van volwassen hepatocyten door de cellen gedurende 15 minuten te incuberen met 8 mM EDTA.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van trypsine of andere proteasen die de receptoren van het celoppervlak kunnen verstoren. Omdat NTCP een celoppervlakreceptoreiwit is, kan schade als gevolg van trypsinisatie negatieve resultaten geven.
    2. Fixeer de hepatocyten met 300 μL 3,7% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 15 min. Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 × g, 25 °C.
    3. Was de cellen 2x met 700 μL 1x PBS met 1% FBS (v/v), centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C, voeg 300 μL van 0,05% Triton X-100 in PBS toe aan de celpellet en incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om ze te permeabiliseren.
    4. Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C, was de celpellet 3 x 1 min met 700 μL PBS met 1% FBS (v/v). Incubeer de cellen met het primaire antilichaam tegen NTCP (1:100 verdunning) bij 4 °C gedurende 30 min. Was de cellen 3 x 1 min met Perm/Wash buffer en centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C.
    5. Kleur de cellen met secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 bij 4 °C gedurende 30 minuten. Was de cellen 3 x 1 min met Perm/Wash buffer en centrifugeer gedurende 10 min bij 300 × g, 25 °C. Resuspendeer de celpellet met 200 μL PBS met 1% FBS (v/v).
    6. Schakel de flowcytometer in, warm de laser gedurende 15 minuten op en voer routinematige reiniging uit.
    7. Selecteer de meetparameters, waaronder forward scatter (FSC), side scatter (SSC) en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of phycoerythrin (PE), en stel de automatische compensatieaanpassing door de software in. Neem de compensatiecontrolemonsters op: niet-gebeitste controle, FITC-gekleurde controle en PE-gekleurde controle.
      OPMERKING: FSC- en SSC-parameters worden gebruikt om de grootte en granulariteit van individuele cellen te bepalen om de celpopulatie te selecteren voor gating-analyse. De fluorescentiekanaaldetector heeft FITC- en PE-kanalen. Selecteer voor dit protocol het FITC-kanaal om Alexa Fluor 488 te detecteren.
    8. Voer het niet-gekleurde monster uit met een gemiddeld vloeibaar debiet (60 μL/min), pas de drempel van FSC en SSC aan totdat ze de relevante celpopulatie bestrijken, markeer het poortgebied in dit gebied en pas alle compensatiecontroles toe.
    9. Stel de fluorescentiefotomultiplicatorbuis (PMT) in met behulp van de niet-gekleurde regeling en pas de PMT-spanning van FITC of PE in het negatieve kwadrant aan. Voer het positief gekleurde monster uit en pas FITC of PE aan in de positieve kwadrantschaal. Voer de niet-gekleurde, FITC-gekleurde of PE-gekleurde besturingselementen uit, bereken de compensatie en pas deze toe op de monsterinstellingen. Voer het hepatocytenmonster uit om het NTCP-niveau te meten.
    10. Analyseer de gekleurde hepatocyten met behulp van flowcytometersoftware (zie de tabel met materialen).
      1. Klik onder BD FACSuite-vensters op de bedieningsbuis op het tabblad Gegevensbronnen en wacht tot de onbewerkte gegevens verschijnen.
      2. Klik op het tabblad Werkblad aan de rechterkant op de knop Ellipse Gate , selecteer de celpopulatie in SSC en de FSC-dot plot met behulp van de muiscursor en wacht tot de cirkel P1 verschijnt.
      3. Klik op de intervalpoortknop en markeer het gebied in het FITC-histogram, beginnend bij de hoogste fluorescentie-intensiteitswaarde aan de rechterkant. Let op de lijn P2 die verschijnt.
      4. Klik op de experimentbuis en merk op dat de gegevens op het tabblad Werkblad veranderen. Klik op de knop Statistieken en vervolgens op de lege ruimte in het werkblad. Observeer de statistische waarden van de NTCP-populatie die verschijnen.

3. Productie van de van celcultuur afgeleide HBV-deeltjes (HBVcc)

  1. Kweek HepG2.2.15 in volledig medium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) in een petrischaaltje van 10 cm gedurende 24 uur.
  2. Vervang het volledige medium aangevuld met 380 μg/ml geneticine (G418) wanneer de HepG2.2.15 60%-70% samenvloeiing bereikt. Oogst het geconditioneerde medium om de 2 dagen; bewaar het medium dat HBV bevat bij 4 °C.
  3. Verwijder celresten door het supernatant gedurende 20 minuten te centrifugeren bij 5.000 × g, 4 °C. Verzamel het geconditioneerde medium met behulp van een spuit van 20 ml en filter het door een 0,45 μm eiwitarm filter om celresten te verwijderen.
  4. Om HBV te concentreren, verdunt u 1 volume concentrator met 3 volumes van het gefilterde supernatant uit stap 3.3 in een conische centrifugebuis en mengt u de oplossing zorgvuldig door buisinversie. Breng het mengsel gedurende 1 uur op 4 °C. Centrifugeer de oplossing gedurende 1 uur bij 1.500 × g, 4 °C en zorg ervoor dat een gebroken witte pellet zichtbaar is.
    OPMERKING: Voeg voor elke 30 ml gefilterd supernatant uit stap 3.3 10 ml van de concentrator toe om 40 ml totaal volume te bereiken.
  5. Evalueer de HBV-titer (genoomequivalent) met HBV 1,3-mer WT-replicon als een standaardcurve variërend van 1 × 102 tot 1 × 1010 met behulp van absolute real-time PCR, zoals eerder beschreven11.
  6. Reconstitueer de pellet voorzichtig in FBS en bewaar deze gedurende maximaal 1 jaar bij −80 °C in aliquots voor eenmalig gebruik.

4. Anti-HBV-invoertest

  1. Onderhoud 100% confluente imHC of HepaRG in 6-well platen in rijpingsmedium (2% DMSO in Williams' E medium, 10% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 5 μg/ml insuline, 50 μM hydrocortison en 2 mM L-glutamine) gedurende 2 weken en verander het medium 2x per week.
  2. Aspirateer het medium en voeg vervolgens de curcumine (10-30 μM) of 4 μM ciclosporine A (CsA) verdund met William's E-medium gedurende 2 uur toe. Aspirateer de kandidaat HBV entry inhibitor en vervang deze door 1 ml William's E medium met 4% polyethyleenglycol.
  3. Voeg HBV-deeltjes toe aan het kweekmedium bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100 per put en incubeer bij 37 °C gedurende 18 uur. Gooi het supernatant weg, voeg 2 ml koude PBS toe en draai voorzichtig om het oude medium af te spoelen met ongebonden HBV.
  4. Voeg 2 ml compleet William's E medium en cultuur toe gedurende 7 dagen. Aspirateer het medium, was de cellen met 1x PBS en fixeer de cellen met 3,7% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Permeabiliseer en blokkeer de geïnfecteerde cellen met IF-blokkerende oplossing (0,2% Triton X-100 en 3% runderserumalbumine in PBS) en incubeer ze gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voeg het primaire antilichaam (anti-HBV-kernantigeen) toe bij 1:200 verdunning in de blokoplossing en incubeer een nacht bij 4 °C. Was de cellen 3 x 1 min met wasoplossing (0,5% Tween 20 in PBS).
  6. Voeg secundair antilichaam (1:500 verdunning) toe aan de IF-blokkerende oplossing, incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en was de cellen 3 x 1 min met wasoplossing.
  7. Monteer het monster met antifade montagemedium met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en dek af met een glazen afdeklip. Detecteer het fluorescentiesignaal met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een DAPI-filter (Ex 352-402 nM en Em 417-477) en een PE-filter (Ex 542-582 en Em 604-644), samen met een 20x objectieve lens, en bepaal de anti-HBV-entry-activiteit van de kandidaat-verbindingen.

5. Hbv-celbindingstest

  1. Onderhoud 100% confluente imHC of HepaRG in 6-well platen in rijpingsmedium (2% DMSO in Williams' E medium, 10% FBS, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 5 μg/ml insuline, 50 μM hydrocortison en 2 mM L-glutamine) gedurende 2 weken en verander het medium 2x per week.
  2. Aspirateer het medium en voeg vervolgens curcumine (10-30 μM) of ciclosporine A (4 μM) verdund in William's E-medium gedurende 2 uur toe. Aspirateer de HBV entry inhibitor en vervang deze door 1 ml William's E medium met 4% polyethyleenglycol.
  3. Voeg HBV-deeltjes toe aan het kweekmedium met een MOI van 100 per put en incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur om HBV-binding aan de hepatocyten mogelijk te maken. Gooi het medium met ongebonden HBV weg, voeg 2 ml koude PBS toe en draai voorzichtig om sporen van het gebruikte medium te verwijderen.
  4. Oogst de geïnfecteerde cellen met behulp van een celschraper en verstoor de cellen met lysisbuffer. Breng het lysaat over naar een verzamelbuis en extraheer totaal DNA om het HBV-DNA te evalueren met behulp van real-time PCR met specifieke primers voor HBV (voorwaartse primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', en omgekeerde primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') met behulp van PRNP (forward primer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', reverse primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') als interne controle.
  5. Versterk de PCR-producten in een thermische cycler met behulp van de temperatuuromstandigheden beschreven in stap 2.1.
  6. Bereken relatieve HBV DNA-niveaus/1 × 106 cellen in behandeling versus controle met BEHULP VAN PRNP als het kalibratorgen op basis van de 2-ΔΔCT-methode .

6. Taurocholzuur (TCA) opnametest

  1. Behoud 100% confluente imHC- en HepaRG-cellen in rijpingsmedium gedurende 14 dagen.
  2. Aspirateer het medium en was de hepatocyten met 1x PBS. Voeg curcumine of ciclosporine A (10-50 μM) verdund toe in William's E medium gedurende 2 uur. Vervang het medium door de natrium taurocholzuuroplossing (0,5 M natrium taurocholaathydraat in 1x HEPES) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Aspirateer de natrium taurocholzuuroplossing en was 3x met koude 1x HEPES. Voeg 300-500 μL koude 1x HEPES toe en oogst de cellen met celschrapers op ijs.
  4. Homogeniseer de cellen door ultrasoon geluid met een frequentie van 20 kHz gedurende 20 s en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten bij 10.000 × g gedurende 20 minuten om celresten neer te slaan. Verzamel het supernatant en evalueer de intracellulaire taurocholzuurconcentratie met behulp van een TCA ELISA-testkit (zie de tabel met materialen).

7. Bepaling van eiwit-ligandinteracties met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

OPMERKING: Dit testsysteem is ontwikkeld op basis van de MicroCal PEAQ-ITC (ITC-software).

  1. Bereid de buffer voor (50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,0).
  2. Bereid 15 μM NTCP in de buffer.
  3. Bereid 150 μM kandidaat HBV-invoerremmeroplossingen in de buffer.
  4. Was de monstercel, de referentiecel en de spuit in het ITC-instrument met behulp van de buffer (stap 7.1.).
    1. Start de ITC-software door te dubbelklikken op het softwarepictogram in Windows-systemen. Selecteer onder het tabblad Experiment highlight uitvoeren de optie microCal-methode voor 19 Injection.itcm en klik op openen. Wanneer een nieuw venster wordt geopend, klikt u op het tabblad Schoon en selecteert u in het venster Reinigingsmethode de knop Wassen voor Celreinigingsmethode en de spoelknop voor Spuitreinigingsmethode. Klik op Volgende en volg de instructies op het scherm.
      OPMERKING: De wasstap kan 1,4 uur in beslag nemen.
  5. Laad het monster in de ITC; klik op het tabblad Experiment uitvoeren op de knop Laden en lees de instructies op het scherm. Klik op Volgende en volg de video-instructies totdat deze laadstap is voltooid.
    1. Vul de referentiecel met een oplossingsbuffer met behulp van een spuit. Vul de monstercel met 15 μM NTCP in buffer met behulp van een spuit en verwijder de overtollige NTCP-oplossing over de monstercel. Vul de spuit met 150 μM oplossing van de curcumine (ligand) en vermijd luchtbellen in de spuit.
  6. Voer het voorbeeld uit en klik op het tabblad Experiment uitvoeren op de knop Uitvoeren . Observeer de vensters aan de linkerkant met experimentele informatie en experimentele instellingen. Voer de ligand- en eiwitconcentraties in als 150 μM in [Syr], 15 μM in [Cel] en 25 °C in temperatuur.
  7. Klik in de software op start om het injectieproces uit te voeren en wacht 1,4 uur totdat de eiwit-ligandinteractie is voltooid.
    OPMERKING: De vervaagde analyseknop verschijnt onder de softwarevensters.
  8. Merk op dat de analyseknop helderder wordt nadat de injectie is voltooid. Klik op de analyseknop in de besturingssoftware om de onbewerkte gegevens te analyseren met behulp van de analysesoftware. Klik op overzicht om de onbewerkte gegevens weer te geven en kies het montagemodel als One Set of Binding Site.
  9. Zorg ervoor dat de bindingsstatus de experimentele gegevens weergeeft (binding, geen binding, controle of controlegegevens) en dat de experimentwaarden (KD, ΔG, ΔH, TΔS en N) worden weergegeven in het softwarepaneel.
  10. Exporteer de thermodynamische parameters die de interactiebinding voorspellen, waaronder waterstofbrug, van der Waals-binding en hydrofobe interactie in tif- of jpeg-formaat.
  11. Nadat het experiment is voltooid, wast u de monstercel volgens stap 7.4.

8. Statistische analyse

  1. Voer alle experimenten uit in drie onafhankelijke replicaties (n = 3).
  2. Presenteer experimentele gegevens als middel ± SD en voer statistische analyses uit met behulp van de gewenste statistische analysesoftware.
  3. Gebruik een tweezijdige ongepaarde studentent-test om twee gemiddelde waarden te vergelijken of pas eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) toe met Dunnett voor meerdere vergelijkingen tussen meerdere waarden tot een controlewaarde. Stel het significantieniveau in op p ≤ 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatische rijpingskenmerken werden waargenomen, waaronder binucleated cellen en polygonaalvormige morfologie (figuur 1), vooral in het gedifferentieerde stadium van imHC (figuur 1A). Een grote toename van NTCP-expressie werd gemeten in d-HepaRG en d-imHC bij respectievelijk 7-voudig en 40-voudig (figuur 1B). De sterk geglycosyleerde vorm van NTCP, waarvan wordt gepostuleerd dat deze vatbaar is voor HBV-entry, werd meer gedetecteerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HBV-infectie wordt geïnitieerd via binding met lage affiniteit aan heparansulfaatproteoglycanen (HSPG's) op hepatocyten25, gevolgd door de binding aan NTCP met daaropvolgende internalisatie via endocytose26. Aangezien NTCP een cruciale receptor is voor HBV-entry, kan targeting hbv-entry klinisch worden vertaald om de novo infectie, moeder-op-kindtransmissie (MTCT) en recidief na levertransplantatie te verminderen. Het onderbreken van virale invoer zou een haalbare ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoeksproject wordt ondersteund door Mahidol University en de Thailand Science Research and Innovation (TSRI) afzonderlijk toegekend aan A. Wongkajornsilp en K. Sa-ngiamsuntorn. Dit werk werd financieel ondersteund door het Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council via de Program Management Unit for Competitiveness (subsidienummer C10F630093). A. Wongkajornsilp is een ontvanger van een Chalermprakiat-beurs van de Faculteit der Geneeskunde Siriraj Hospital, Mahidol University. De auteurs willen miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) bedanken voor haar hulp bij de ITC-techniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellijnen
HepaRG Cellen, CryopreservedThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma CellijnMerckSCC249
Reagentia
4% Paraformaldehyde FosfaatbufferoplossingFUJIFLIM Wako chemical163-20145
BD Perm/Wash bufferBD Biosciences554723Perm/Wash buffer
Cyclosporine Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 disulfaat zoutMerck108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-vrij (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolatiekitsGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA isolatiekitGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcriptie SysteemPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X ConcentratorTakara bioPT4421-2concentrator
Luminata crescendo Western HRP substraatMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniverseelKapa BiosystemsKK4600
Nucleospin DNA extractiekitmacherey-nagel1806/003
Fosfaat gebufferde zoutoplossingMerckP3813
Polyethyleenglycol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Recombinant NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Verdunnen tot 0,125%
Antilichamen
    Anti-NTCP1 antilichaamAbcamab1310841:100 verdunning
    Anti-GAPDH antilichaamThermo Fisher ScientificAM43001:200.000 verdunning
    HRP-geconjugeerd geitenanti-konijn antilichaamAbcamab2057181:10.000 verdunning
    HRP geitenanti-muis secundair antilichaamAbcamab970231:10.000 verdunning
    Geitenanti-Konijn IgG secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 verdunning
Reagens samenstelling
1° Antilichaam verdunningsbuffer
     1x TBST
     3% BSASigmaA7906-100GWerkconcentratie: 3%
     NatriumazideSigma199931Werkconcentratie: 0,05%
Hepatocyt Groeimedium
      DME/F12Gibco12400-024
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
Levercel rijpingsmedium
       Williams’ E mediumSigma AldrichW4125-1L
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
      5 µg/mL  InsulineSigma Aldrich91077C-100MG
      50 µM hydrocortisonSigma AldrichH0888-1g
      2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Blokkeer oplossing
     1x PBSGibco21300-058
     3% BSASigmaA7906-100GWerkconcentratie: 3%
     0,2% Triton X-100SigmaT8787Werkconcentratie: 0,2%
RIPA Lysis Buffer OplossingMerck20-188Eindconcentratie: 1X
     Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific78425

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169(2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054(2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125(2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952(2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419(2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796(2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144(2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205(2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115(2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216(2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NTCP bindinginhibitie van virale entryflowcytometrieisotherme titratiecalorimetrieopname van taurocholzuurimmunofluorescentiekleuringHepaRG cellenpolymerasekettingreactie

Gerelateerde artikelen